质粒DNA的提取定量酶切鉴定与PCR实验报告.docx
- 文档编号:10095128
- 上传时间:2023-02-08
- 格式:DOCX
- 页数:11
- 大小:54.62KB
质粒DNA的提取定量酶切鉴定与PCR实验报告.docx
《质粒DNA的提取定量酶切鉴定与PCR实验报告.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《质粒DNA的提取定量酶切鉴定与PCR实验报告.docx(11页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
质粒DNA的提取定量酶切鉴定与PCR实验报告
质粒DNA的提取定量酶切鉴定与PCR实验报告
姓名:
学号:
专业年级:
组别:
生物化学与分子生物学实验教学中心
实验名称质粒DNA的提取、定量、酶切鉴定与PCR实验日期实验地点
合作者指导老师
评分XX教师签名李某某批改日期2013-06-03格式要求:
正文请统一用:
小四号,宋体,1.5倍行距;数字、英文用TimesNewRoman;标题用:
四号,黑体,加粗。
需强调的地方请用蓝颜色标出。
不得出现多行、多页空白现象。
一、实验目的
1、掌握PCR基因扩增的原理和操作方法
2、掌握碱裂解法提取质粒的方法
3、了解和掌握紫外吸收检测DNA浓度与纯度的原理和测定方法
4、了解质粒酶切鉴定原理
、学习水平式琼脂糖凝胶电泳,检测质粒DNA的构型、分子量的大小5
二、实验原理
1、PCR:
在DNA聚合酶催化下,以DNA为模板,特定引物为延伸起点,dNTP为原料,通
n过变性、退火、延伸等步骤,在体外(缓冲液中)复制DNA,使目的DNA按2方式呈指数形式扩增。
PCR一次循环的具体反应步骤为:
(1)变性:
加热反应系统至95?
,使模板DNA在高温下完全变性,双链解链。
(2)退火:
逐渐降低溶液温度,使合成引物在低温(35~70?
一般低于模板Tm值的5?
左右),与模板DNA互补退火形成部分双链。
(3)延伸:
溶液反应温度升至中温72?
,在Taq酶作用下,以dNTP为原料,引物为复制起点,模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。
2、质粒DNA的提取:
(1)碱裂解法:
1)基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异:
2)高碱性条件下,染色体DNA和质粒DNA均变性;
3)当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时,变性的质粒DNA复性并保存在溶液中,染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构,可通过离心形成沉沉淀去除。
(2)离心层析柱:
1)硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA,而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质;
2)通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除;
3)低盐,高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
3、质粒DNA的定量分析(紫外分光光度法):
1)物质在光的照射下会产生对光的吸收效应,且其对光的吸收是具有选择性。
2)各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱。
3)A260/A280比值可以反应DNA的纯度。
4、质粒DNA的酶切鉴定:
限制性内切酶是DNA重组操作过程中所使用的基本工具。
限制性内切酶能特异性地与一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列结合,或是与其附近的特异位点结合,并在结合位点切割双链DNA。
分子克隆中常用的为II类限制酶,其识别位点长度为4、5或6个核苷酸的反向重复序列。
5、琼脂糖凝胶电泳:
琼脂糖是一种天然聚合长链状分子,可以形成具有刚性的滤孔,凝胶孔径的大小决定于
琼脂糖的浓度。
DNA分子在碱性环境中带负电荷,在外加电场作用下向正极泳动。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时,有电荷效应与分子筛效应:
不同的DNA,分子量大小及构型不同,电泳时的泳动率就不同,从而分出不同的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比关系).
三、材料与方法:
以流程图示意
(一)材料:
1、PCR:
仪器:
PCR仪、台式离心机、微量加样枪、灭菌的薄壁离心管
材料:
菌液:
(大肠杆菌DH5a菌株,含靶基因CHD5片段的pMD19-T)、无菌去离子水、2×PremixTaq、引物
2、质粒DNA的提取
仪器:
恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、台式离心机、高压灭菌锅材料:
含pMD19-T质粒的大肠杆菌DH5α
试剂:
溶液S1、溶液S2、溶液S3、去蛋白液W1、漂洗液W2、洗脱液Eluent3、质粒DNA的定量分析(紫外分光光度法)
仪器:
比色杯、紫外分光光度计、微量加样枪
材料:
蒸馏水、质粒,,,
4、质粒DNA的酶切鉴定
仪器:
1.5ml的EP管、微量加样枪
材料:
无菌水、10×M酶切缓冲液BufR、质粒DNA、HindIII(15U/ul)、EcoRI(12U/ul)
5、琼脂糖凝胶电泳
仪器:
凝胶电泳系统、凝胶成像系统
材料:
电泳指示剂、Gelview、TBE、琼脂糖、DNAMarker5000、电泳缓冲液方法:
1、PCR
取0.2mlPCR反应管一只
用微量加样枪加入灭菌去离子水6.0μl
6l加入2*PremixTaq12.0μl
加入引物1-SO100(10μmol/L)1.0μl12l
加入引物2-SO101(10μmol/L)1,0μl
加入菌液5.0μl
离心10min
将反应管放到PCR仪上进行扩增
、质粒DNA的提取2
离心13000rpm,1min菌液离心并弃上清液
弃滤液,加入500.0μl去蛋白液W1加250.0μl溶液S1
旋涡振荡离心13000rpm,1min
悬浮沉淀
弃滤液,加入500.0μl漂洗液W2加250.0μl溶液S2
离心13000rpm,1min颠倒6-8次
加400.0μl溶液S3弃滤液
颠倒数次,空柱离心13000rpm,2min放置3-5min
离心13000rpm,10min放入一个干净的离心管中,在吸附膜的
中间加50.0μl洗脱液Eluent,放置1min取上清700.0μl加到吸附柱中离心13000rpm,1min3、质粒DNA的定量分析(紫外分光光度法)
用蒸馏水将石英比色皿洗净,用擦镜纸擦干
往石英比色皿中加入98.0μl蒸馏水
将石英比色皿放入检测槽,按blank键调零
往石英比色皿中加入2.0μl样品,混匀
将石英比色皿放入检测槽,按sample键检测
记录数据,重复三次取平均值
4、质粒DNA的酶切鉴定
取一洁净的1.5mlEP管
加入无菌水6.0μl
加入质粒DNA10.0μl
加入10×M酶切缓冲液6.0μl
加入HindIII(15U/ul)1.0μl
加入EcoRI(12U/ul)1.0μl
移液枪轻轻混匀(避免产生气泡),37?
水浴1.5h
5、琼脂糖凝胶电泳
往质粒DNA、酶切DNA片段样品中按10:
1的比例加入Gelview染料,混匀,室温放置1min
用微量加样枪各吸取10.0μl样品,按序号加入到电泳仪的凝胶孔中
电泳30min
取出凝胶
紫外光下观察,拍照
四、结果与讨论:
?
结果:
实验数据、现象、图谱;?
讨论:
以结果为基础的逻辑
推论,并得出结论。
(一)结果
实验现象:
1、PCR:
如图1所示,PCR样品呈荧光绿色。
2、质粒DNA的提取:
(1)加入溶液S1后,细菌沉淀部分溶解,旋涡振荡后出现悬浮现象。
(2)加入溶液S2并混匀,如图2所示,溶液变清。
(3)加入溶液S3,有白色絮状沉淀生成。
图1PCR样品图2溶液变清
3、质粒DNA的定量分析:
图3质粒DNA的定量分析数据记录
4、质粒DNA的酶切鉴定:
如图4所示,加入10×M酶切缓冲液后,溶液呈紫色。
5、琼脂糖凝胶电泳:
如图5所示,电泳时,可观察到在电流作用下,点样的溶液出现电泳现象,电泳速度不同。
每组中,PCR样品电泳速度最快,质粒DNA样品和酶切后DNA样品速度几乎相同。
在紫外检测仪条件下,可以观察到不同的物质出现不同的电泳带。
图4溶液呈紫色图2电泳结果(自然光下)实验数据:
测量次数质粒DNA浓度(μg/ml)Ratio值(A260/A280)
1723.42
21261.86
31191.87
平均值122.51.865
表格1质粒DNA的定量分析数据记录注:
因第一次测量数据偏差较大,故弃去第一次数据,取后两次数据计算其平均值。
图谱:
500A0bpCA.质粒
300B.PCR0bpBC.酶切200
0bp
图4琼脂糖凝胶电泳图150
0bp
(二)讨论100
0bp
7501、质粒DNA的定量分析数据分析:
bp
500
bp
250
bp
纯净的DNAA260/A280比值为1.8,纯净的RNAA260/A280比值为2.0。
由表格1可知,本次试验测得质粒DNA的Ratio值为1.865。
A260/A280比值略大于1.8,但小于1.9,表示DNA样品较纯,符合实验要求,可能有少量RNA杂质。
若A260/A280比值,1.9,则表示样品中含RNA杂质,需用RNA酶去除。
若A260/A280比值,1.6,则表示样品中有蛋白质或其它杂质的污染,需重新纯化DNA,去除蛋白、多糖、多酚等杂质。
2、电泳图谱分析:
如图4所示,可见质粒DNA呈现3条带,PCR产物1条带,酶切后的质粒DNA呈现2条带。
将样品与Maker相比较,质粒DNA的分子大小在4000~5000bp,酶切反应的质粒DNA片段分子大小在3000~4000bp和450~700bp,PCR的DNA分子大小在450~700bp。
理论上来说,质粒大小为:
2692bp+400bp=3092bp,酶切片段约为2692~2792bp和400~500bp两段,目的片段为400bp,预期PCR产物大小约400~500bp。
由此可见,样品结果略大于理论值。
本次试验所用材料大肠杆菌DH5a菌株的质粒中含有三种DNA,分别为超螺旋质粒DNA、线性DNA和开环状质粒DNA。
这三种DNA有不同的迁移率,迁移速度最快的是超螺旋型,其次是线性分子,最慢的是开环状分子。
因此,条带从上到下依次为:
开环状分子、线性分子、超螺旋型DNA。
开环状分子的条带较不明显,可能是因为其含量较少。
3、注意事项:
(1)在PCR中,如果配好的反应液较多沾到管壁上,要将PCR反应管置台式离心机中瞬时离心,使反应液集中于管底,然后才将反应管放到基因扩增仪上。
(2)在质粒DNA提取的实验中,加入溶液S1并旋涡振荡后,菌液一定悬浮均匀,不能有结块。
加入溶液S2后,时间不能太久,动作要温柔,轻轻颠倒几次。
加入溶液S3后,复性时间不宜过长。
(3)取上清时注意不要碰到沉淀物。
(4)空柱离心后应更换一个干净的离心管。
(5)进行质粒DNA的定量分析时,要将比色皿中的样品和蒸馏水完全混匀。
(6)每次测量前应将比色皿用蒸馏水冲洗干净。
(7)在电泳实验中,点样时枪头下伸,点样孔内不能有气泡。
(8)在电泳中,Geldview有毒,切勿用手接触。
4、思考题:
(1)碱法提质粒中溶液I、II、III的作用,
答:
溶液I:
含有溶菌酶,葡萄糖和EDTA。
溶菌酶具有溶菌的作用。
葡萄糖可以增加溶液的黏度,维持渗透压,以保护DNA,防止DNA受机械切力作用降解。
EDTA可以螯合金属离子,抑制脱氧核酸酶对DNA的降解作用,加强溶菌酶的溶菌效果。
溶液II:
含有NaOH和SDS。
NaOH提供高碱环境,使DNA变性。
SDS能溶解膜蛋白而破坏细胞膜,解聚细胞中的核蛋白,与蛋白质结合为复合物使蛋白质沉淀下来。
溶液III:
起缓冲液的作用,调节pH至中性使质粒DNA复性。
溶液还提供了高盐环境,有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀下来,从而被除去。
(2)结合实验情况,如何提高限制性酶切的反应效率,
答:
1)酶的选择:
尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶。
2)酶量的选择:
任何时候2种酶的总量不能超过反应体系的1/10体积,而且最大反应体系最好不要小于20μl。
3)底物DNA的纯度:
严格实验操作步骤,尽量纯化底物,提取质粒DNA时使乙醇尽量挥发干净。
因为主要污染DNA的某些物质,如酚、氯仿、乙醇等均能抑制酶反应。
4)反应系统:
构建酶切反应体系时,应该先加入缓冲液再加入限制酶,最后加入质粒DNA。
因为反应缓冲液中合适离子强度可以激发酶切反应,提高反应效率。
5)反应体积:
一般应尽量小,且酶切反应中甘油浓度应低于5%。
6)保温时间与温度:
保温时间和温度应准确,温度的改变会使酶识别错误。
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 质粒 DNA 提取 定量 鉴定 PCR 实验 报告