消化性溃疡幽门螺杆菌感染与Toll样受体4基因多态性的相关性研究.docx
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消化性溃疡幽门螺杆菌感染与Toll样受体4基因多态性的相关性研究
消化性溃疡幽门螺杆菌感染与Toll样受体4基因多态性的相关性研究
【关键词】消化性溃疡幽门螺杆菌感染Toll样受体
HP感染是引起人类慢性胃炎、消化性溃疡及胃癌等疾病的病因之一,但研究发现在HP感染者中仅有极少数会发生上述疾病。
HP致病机制与细菌数量、毒力以及环境因素、宿主易
感性、胃肠黏膜内环境等有关。
人类TLR4通过识别病原相关分子构型(PAMPs),激活先天性免疫应答机制,同时还诱导共刺激分子CD80的表达,为获得性免疫的启动提供活化信号,因此在免疫系统中有着十分重要的作用[1]。
TLR4作为细菌脂多糖(LPS)的受体,将LPS传导通路的信号迅速传至核内,通过激活核因子-kB(NF-kB),刺激NO分泌,消灭病原;还可促进炎性
细胞因子表达与释放,激活特异性免疫反应[2]。
本研究通过探讨TLR4基因突变与HP感染相关性消化性溃疡的关系,旨在为阐明HP感染相关性消化性溃疡的遗传易感性和先天性
免疫机制提供依据。
1临床资料
1.1一般资料
于2006年7月至2007年6月间,在温州医学院附属第二医院消化内科,依据悉尼分类标准[3]收集消化性溃疡患者120例(胃溃疡51例、十二指肠球部溃疡69例)。
其中男72例,女48例;平均年龄52.2岁。
正常体检者204例作为对照组,男104例,女100例;平均年龄39.2岁。
1.2方法
(1)取外周静脉血5ml,EDTA抗凝,蛋白酶K/酚/氯仿法提取基因组DNA。
(2)PCR扩增目的基因,根据文献设计引物[4]如下。
PCR反应体系25μl,每侧引物各10pmol,dNTPs(10mmol/L)0.5μl,DNA聚合酶1U,DNA模板1μl(约40-100ng)。
反应条件:
94℃预变性3min,接着38个循环,94℃变性45s,51℃复性45s,72℃延伸45s,72℃终末循环5min,最后于4℃终止反应。
PCR产物片段长度139bp或131bp,用2%琼脂糖凝胶电泳及紫外分析仪鉴定。
(3)TLR4Asp299Gly基因多态性分析:
①限制性内切酶消化PCR产物酶切反应体系20μl,含10μlPCR(Ⅰ)的产物,用BsaBI内切酶0.5μl(10U/μl),于55℃消化酶切4h;取10μlPCR(Ⅱ)的产物,用BstXI内切
酶0.5μl,于65℃消化酶切4h后80℃灭活20min;②酶切产物用8%的非变形聚丙烯酰胺凝胶电泳(100V,1.5h)分离,1‰硝酸银染色分析基因型;③基因测序:
部分PCR(Ⅰ)及PCR(Ⅱ)产物经纯化后由上海生工生物工程服务有限公司进行DNA测序,测序样品作为阳性对照;④消化性溃疡患者均采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定HP-IgG。
同时采用胃窦黏膜组织快速尿素酶试验(pH值指示剂法),检测HP感染。
诊断HP感染参照安徽桐城会议通过的共识意见[5],2项均阳性诊断HP感染。
正常体检者采用14C-尿素呼气试验,检测HP感染,检测前所有研究对象均未行抗HP治疗。
1.3统计学处理
SPSS11.5软件处理试验数据,采用χ2检验分析病例组和对照组Asp299Gly基因型频率及等位基因分布的差异,以及分析TLR4基因Asp299Gly基因型与HP感染相关性消化性溃疡
之间的关系。
P<0.05有显著性差异。
2结果
浙江汉族人群中,TLR4基因Asp299Gly等位基因位点均为野生型A,未见突变型G;A等位基因频率及AA基因型频率均为100%。
消化性溃疡组及正常对照组TLR4基因Asp299Gly基因
型频率,等位基因频率及携带者频率分布无显著性差异。
TLR4基因Asp299Gly多态性与HP感染关系,消化性溃疡患者中HP感染率为94.7%,正常对照为60.1%;两组中TLR4基因Asp299Gly基因型频率,等位基因频率及携带者频率分布无差异,所有研究个体均为AA纯合子。
参照文献结果[6],将汉族人群TLR4基因Asp299Gly多态性与外国人群比较,发现TLR4基因Asp299Gly等位基因频率及基因型频率存在种族差异。
汉族人和日本人该等位基因均为野
生型A,未发现突变型G;与荷兰高加索人相比,等位基因频率及基因型频率具有显著性差异。
AA基因型频率在中国浙江汉族人群(χ2=33.064,P=0.000,OR=1.183,95%CI:
1.080~1.296)及日本人群(χ2=42.682,P=0.0001,OR=1.183,95%CI:
1.109~1.262)中显著高于荷兰人群;而荷兰人群等位基因A的频率明显高于中国人群(χ2=37.403,P=0.000,OR=1.098,95%CI:
1.047~1.151)及日本人群(χ2=42.597,P=0.000,OR=1.125,95%CI:
1.077~1.175)。
由此可见中国及日本人群与荷兰高加索人TLR4基因Asp299Gly位点多态性分布存在显著性差异。
3讨论
TLR是人类在进化过程中所保留的参与先天性抗感染的受体蛋白家族,具有高度保守性。
TLR不仅通过识别病原微生物的PAMP,激活先天性免疫反应,还诱导共刺激分子CD80
的表达,为获得性免疫的启动提供必要的活化信号,因此在免疫系统中有着十分重要的作用。
TLR超家族已发现有10个家族成员,其中TLR4、TLR2与宿主的免疫功能有着密切联系,可
识别不同的病原分子。
TLR4主要作为革兰阴性菌LPS的特异性受体,在LPS诱导的信号传导中起着重要作用,TLR2则主要作为革兰阳性菌的肽聚糖、酵母菌的甘露聚糖及某些特定的LP
S的受体。
TLR4接触不同的抗原分子后,通过协同分子CD14、LPS结合蛋白、MD2的共同作用,经由MyD88、TIRAP/MAL等信号传导途径,将LPS传导通路的信号迅速传至核内,激活NF-кB通道,刺激NO分泌,消灭病原菌;此外,激活相关细胞因子的表达,释放炎症细胞因子,激活特异性免疫反应,因而在机体的先天性免疫中起到十分重要的作用。
Arbour等用单链构象
多态性分析法(PCR-SSCP)和基因测序的方法发现了TLR4基因的非同义的单核甘酸多态性Asp299Gly和Thr399Ile,除体外转染研究证实Asp299Gly多态性与LPS的反应减低有关外,Asp299
Gly和Thr399Ile等位基因杂合子和纯合子个体与野生型基因型的个体相比,吸入性LPS的气道反应明显减低。
小鼠C3H/HeJ和C57BL/10ScCr株对LPS高度抵抗,缺乏先天性免疫的生物作
用,易受感染,是由于小鼠TLR4基因突变导致对LPS无反应,或LPS信号传导异常所致。
野生型TLR4的表达增强可使LPS的信号增强。
研究发现TLR4基因的突变可改变肠黏膜先天性免疫细胞和肠上皮TLR4分子结构,使机体的免疫系统失去正常处理肠腔内的大量细菌和LPS等病原分子的能力,进而使肠黏膜在长期的刺激下产生感染、炎症、过敏、易激乃至癌变。
流行病学调查结果显示:
人群中HP感染率与其社会经济地位关系密切,发达国家成人HP感染率<40%,而我国人群感染率为20%~80%,明显高于经济发达国家。
本研究中,正常浙江汉族人群HP感染率是60.1%,与以上的研究结果一致。
同时已有大量研究资料显示:
HP感染率高的地区和国家人群的胃炎和消化性溃疡的发病率也较高,如经济落后国家同发达的欧美国家比较,HP感染相关性胃炎和消化性溃疡的发病率也高。
通过对浙江汉族人群HP感染的检测,发现消化性溃疡患者组HP感染率显著高于对照组(P=0.000,OR=12.512,95%CI:
5.255~29.792)。
本研究采用PCR限制性片段长度多态性分析的方法,对120例消化性溃疡患者及204例正常对照者TLR4基因sp299Gly基因型及等位基因分布进行检测,发现所有样本均为野生型基因型,提示在中国浙江汉族人群中罕见TLR4基因Asp299Gly突变基因型。
树突状细胞(DC)是重要的抗原提呈细胞,在机体免疫应答过程中起着至关重要的作用。
目前研究发现胃黏膜上皮DC能穿过胃上皮细胞间的紧密连接,到达胃黏液层与HP接触[7],HP能够特异性地定植于胃黏膜的黏液层下的上皮细胞表面;另发现在活体内胃上皮细胞可以表达TLR[8]。
国外Bauditz等[9]对HP感染相关性胃炎进行研究,发现LPS引起胃黏膜单核细胞分泌大量IL-12,在胃粘膜上皮细胞表达的TLRs与HP的LPS相互作用后,通过TLR4/CD14途径激活单核-巨噬细胞分泌细胞因子,如TNF-α,IL-1,IL-6,IL-8等,引起胃黏膜的炎症。
Su等[10]发现与临床相关的Ⅰ型HP和Ⅱ型HP感染能激活TLR4基因的表达,Kawahara等[11]发现Ⅰ型HP的脂质A可以激活TLR4途径。
本研究将汉族消化性溃疡患者按HP感染分类后,未发现TLR4基因Asp299Gly突变基因型,与正常对照组相比无显著性差异,提示TLR4基因Asp299Gly多态性与汉族HP感染相关性消化性溃疡的发生无相关性。
本研究将中国浙江汉族人群与其他人种的TLR4基因的Asp299Gly多态性分布进行分析比较,发现不同人群中TLR4基因Asp299Gly等位基因频率及基因型频率的分布存在显著性差异。
其中中国汉族人与日本人的Asp299Gly等位基因频率及基因型频率分布无明显差异性,即在所检测的样本中均未发现TLR4基因Asp299Gly的突变基因型,与荷兰高加索人群突变频率存在明显差异,提示由于欧亚人种在TLR4基因Asp299Gly等位基因及基因型频率分布的不同,导致种族差异和遗传背景的不同,从而影响TLR4基因多态性在消化性溃疡等疾病的遗传机制中的作用。
另外由于CD14是TLR4信号传导途径中重要的协同分子,CD14基因多态性在不同人种之间的分布差异也可能影响TLR4在HP的LPS抗原呈递和胞内信号传导过程中所发挥的作用。
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