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增强型绿色荧光蛋白
增强型绿色荧光蛋白
【摘要】目的:
应用增强型绿色荧光蛋白-C1标记骨髓间充质干细胞,以期为MMSCs的体内移植提供示踪方法。
方法:
在体外分离培养大鼠MMSCs,流式细胞仪检测细胞表型,以脂质体介导法转染质粒增强型绿色荧光蛋白基因,荧光显微镜观察基因表达。
结果:
pEGFPC1在基因转染24h后开始表达,48~72h达高峰,12~14d后有较多的表达。
结论:
由脂质体介导的质粒pEGFPC1可较为安全、有效地转染MMSCs,是一种较为理想的干细胞示踪方法。
【关键词】骨髓间充质干细胞;增强型绿色荧光蛋白;基因转染
[Abstract]Objective:
Todevelopanappropriatetracingmethodfortransplantedmarrowmesenchymalstemcells(MMSCs)invivo.Methods:
MMSCsofratswereisolatedfrombonemarrowandpurifiedbyadherentcultureinvitro,andthecellmembrane‘smarksweredetectedwithflow cellsweretransfectedwithexpressingplamidofpEGFPC1mediatedbylipofectamine,andtransientexpressionwassubsequentlyobservedwithfluorescentmicroscopy.Results:
TheexpressionofpEGFPC1wasinitiallyfoundin24hafterthetransfection,reachedpeakin48~72h,andremainedstrongexpressfor12~14moredays.Conclusion:
LipofectaminemediatedtransfectioncanmakepEGFPC1expressedinMMSCssafelyandeffectively,whichshowsthatitisanidealmethodforstemcelltracking.
[Keywords]marrowmesenchymalstemcells;enhancedgreenfluorescentprotein;genetransfec-tion
骨髓间充质干细胞成为近年来干细胞研究的热点,其不仅本身可发挥治疗作用,同时也可作为外源基因的载体和表达场所[1],是基因治疗理想的种子细胞。
2007年3月~2008年3月通过对大鼠MMSCs体外增殖培养,应用增强型绿色荧光蛋白C1基因表达的质粒转染MMSCs并筛选培养,旨在建立一个较好的基因标记条件,为MMSCs应用于后续基因治疗的可行性奠定基础,为MMSCs的生物学行为提供新的示踪方法。
1材料与方法
动物、试剂和仪器
清洁级近交系SD大鼠6只,雄性,体重(110±10)g,健康。
质粒pEGFPC1由香港大学周中军教授惠赠,菌株E·ColiDH5α由贵阳医学院分子生物学实验室保存并提供,LDMEM购自GIBCO公司,胎牛血清购自杭州四季青公司,离心柱型质粒小提中量试剂盒购自TIANGEN公司,HindⅢ限制性内切酶购自TakaRa公司,脂质体LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司,G-418购自Solarbio公司,荧光显微镜购自Olympus公司。
大鼠MMSCs的体外分离、纯化、增殖培养及鉴定
取雄性SD大鼠颈椎脱臼法处死,分离股骨及胫骨,收集骨髓腔内细胞,接种于含10%胎牛血清的L-DMEM培养瓶中,37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中培养。
第3天后半量换液,以后每3d更换新鲜完全培养液,待细胞接近90%铺满瓶底时,倾去培养液,用%胰蛋白酶常温下消化并传代,用新鲜完全培养基重悬细胞,按照1∶2接种于培养瓶中继续增殖培养。
每日定时于倒置相差显微镜下观察,记录细胞形态的变化和增殖情况;取传代培养至第5代的MMSCs制成单细胞悬液,应用流式细胞仪进行细胞膜表面分子CD29、CD34、CD45及CD71的水平检测分析。
质粒的扩增、提取及鉴定
取大肠杆菌DH5α用氯化钙法制备感受态细菌,将质粒pEGFPC1转化感受态细菌,37℃培养24h,挑取单菌落接种到含卡那霉素的LB液体培养基中,37℃震荡培养过夜,取菌液ml,按照离心柱型质粒小提中量试剂盒说明书用碱裂解法提取质粒DNA。
紫外分光光度计测定质粒DNA浓度,取1μg质粒DNA用HindⅢ酶切,1%琼脂糖电泳鉴定酶切结果。
质粒pEGFPC1转染大鼠MMSCs
应用阳离子脂质体LipofectamineTM2000介导pEGFPC1转染MMSCs,以400mg/L的G418进行筛选,荧光显微镜下观察细胞并拍照。
为提高转染率,质粒DNA∶LipofectamineTM2000为2μg∶5μl,G418的筛选浓度为400mg/L,均为经优化后的最佳条件。
表达pEGFPC1基因的MMSCs的生长特性及细胞活力观察
在荧光显微镜和倒置相差显微镜下观察细胞生长及增殖特性。
取转染质粒pEGFPC1后1~3代的传代细胞,制成单细胞悬液,以%台盼蓝作为染色剂,用细胞计数板计数活细胞和死细胞,共计3次,取平均值计算,细胞活力=/总细胞数×100%。
2结果
形态学观察及鉴定
大鼠MMSCs原代培养的细胞呈圆形,呈悬浮状态,第3天有部分细胞贴于培养瓶底,呈圆形或类圆形。
第7~8天贴壁的细胞开始形成克隆集落,呈放射状或漩涡状生长。
第14天瓶底细胞密度达90%以上,呈融合状态,由形态均一的细胞组成增殖集落。
待细胞接近铺满瓶底时即可传代,第3~5代细胞已基本形成均匀一致的长梭形,排列成放射状或漩涡状,传代周期约为6~7d。
流式细胞仪检测发现,分离、纯化所得细胞表面CD29、CD71以阳性表达为主,CD45、CD34以阴性表达为主,符合MMSCs的生物学特征,见图1。
质粒pEGFPC1DNA的定量及鉴定
提取的质粒pEGFPC1,用分光光度计分别测出所提取质粒DNA溶液的A260和A280,根据公式计算出质粒DNA的纯度为~。
根据公式C(mg/L)=A260×稀释倍数×50,计算出质粒DNA的浓度为180~360mg/L。
所提取的质粒DNA在出现两条较为清晰的条带,质粒DNA的酶切产物在B泳道约4700bp处出现一条清晰的目的条带,证实所获质粒为pEGFPC1。
质粒pEGFPC1转染大鼠MMSCs
转染质粒pEGFPC16h后,MMSCs胞体内绿色荧光表达率较低,转染24h后MMSCs中可见特异性EGFP绿色荧光,少数细胞转染后呈圆形,未能贴壁而死亡;48~72h后加入G-418进行筛选,7~8d后空白对照组MMSCs全部死亡。
转染pEGFPC1的大鼠MMSCs仍继续生长,细胞密度较低,荧光显微镜下可见到MMSCs胞体内有绿色荧光表达;12~14d后荧光显微镜下可见到MMSCs胞体内有绿色荧光,细胞密度增高至80~90%,外形与未转染细胞相同。
表达pEGFPC1基因的MMSCs的生长特性及细胞活力
pEGFPC1在脂质体介导下转染MMSCs后,阳性细胞发绿色荧光,呈“全细胞型”,同一时间点观察,可见处于增殖、分裂状态的各期细胞的生长和增殖不受影响。
经台盼蓝染色后,表达pEGFPC1基因的第1~3代MMSCs的细胞活力大致相同,分别为96%、94%和93%,传代周期约为6d~7d,此时细胞呈融合状态,由形态均一的长梭形细胞组成增殖集落,排列成放射状或漩涡状。
将表达pEGFPC1基因的MMSCs共传至第5代,发现仍具较强的增殖活力,未出现衰老征象。
3讨论
应用pEGFPC1作为示踪分子时,不同的表达载体转染不同的细胞,效率不同,病毒载体转染效率较高,但有较强的免疫原性,表达质粒比病毒载体更为安全。
脂质体法是近年开发的更加简便高效的方法,能被DNA的磷酸根所吸附形成DNA-脂质体复合物,同样也能被表面带负电荷的细胞膜吸附将DNA导入细胞。
实验发现,质粒和脂质体浓度过低,转染效率降低;而浓度过高时,不仅转染效率降低,且容易出现细胞脱落和坏死,说明高浓度对细胞存在毒性。
当脂质体-DNA复合物孵育时间过长时,可见细胞形态的变化,甚至细胞漂浮,同时转染效率也降低。
因此,转染效率与质粒浓度、脂质体的浓度及脂质体-DNA复合物孵育时间密切相关。
在质粒的转染过程中,认为有几点值得推荐。
(1)在开始准备DNA和阳离子脂质体试剂稀释液时要使用无血清培养基,因为血清会影响DNA-脂质体复合物的形成;
(2)在转染培养基中不能使用双抗,即青霉素和链霉素,它们是影响转染的培养基添加物,这些抗生素一般对于真核细胞无毒,但阳离子脂质体增加了细胞的通透性,使抗生素可以进入细胞,从而降低了细胞的活性,导致转染率降低;(3)转染相同量的DNA所需的最佳阳离子脂质体的量会因细胞密度而异,质粒和脂质体浓度比例为1∶2~1∶3效果最佳。
经过优化条件后发现,对MMSCs进行转染前细胞密度在80%~90%时效果较好,这样可以确保细胞未长满或未处于静止期。
MMSCs由于取材方便,易于分离培养,体外扩增快,具有高度自我复制的能力,而且不存在免疫排斥和病毒威胁等因素[3,4],被认为是较为理想的基因治疗的载体[5,6]。
在本实验中,将外源性基因EGFP转染大鼠MMSCs,以验证MMSCs作为基因转染载体的可行性。
实验发现,采用脂质体介导EGFP瞬时转染MMSCs,转染6h后,在MMSCs胞体内有报告基因产物的绿色荧光,此时表达率较低;转染后72h左右对MMSCs进行加压筛选,12~14d后可见表达EGFP的MMSCs呈融合生长,而且转染该外源基因后MMSCs生长无明显改变,依然保持自我复制的能力。
本实验应用的突变型EGFP基因是在水母来源的野生型GFP基因的基础上,替换了影响荧光表达效率的88个密码子中的92个碱基所构建的合成基因,由于选用了动物细胞偏爱的密码子,可以显着提高其在动物细胞中的蛋白表达量和荧光效能。
EGFP是一种优化的突变型GFP,它将65位的丝氨酸用苏氨酸代替,64位的苯丙氨酸用亮氨酸代替,这种突变型EGFP基因保留了GFP作为报告基因和筛选标记的诸多优点,更易于在动物细胞中表达。
这种突变体蛋白表达量的增加及有效蛋白折叠的构象变化,使突变型EGFP基因荧光强度明显增强,发射出的荧光强度比野生型GFP高35倍,大大增强了该报告分子的灵敏度,使EGFP非常适用于荧光显微镜和流式细胞术分析。
因此,突变型EGFP基因比野生型GFP基因更适用于作为哺乳动物细胞的报告基因和筛选标记,可在多种异源细胞中表达[7,8],可以广泛应用于细胞生物学、发育生物学、分子生物学、基因表达与调控、细胞分化及蛋白质的胞内定位与功能转化等诸多研究领域。
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- 增强 绿色 荧光 蛋白