高效液相色谱质谱联用HPLCMS实验含思考题.docx
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高效液相色谱质谱联用HPLCMS实验含思考题
液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)的各种模式探索
一、实验目的
1、了解LC-MS的主要构造和基本原理;
2、学习LC-MS的基本操作方法;
3、掌握LC-MS的六种操作模式的特点及应用。
二、实验原理
1、液质基本原理及模式介绍
液相色谱-质谱法(LiquidChromatography/MassSpectrometry,LC-MS)将应用范围极广的分离方法——液相色谱法与灵敏、专属、能提供分子量和结构信息的质谱法结合起来,必然成为一种重要的现代分离分析技术。
但是,LC是液相分离技术,而MS是在真空条件下工作的方法,因而难以相互匹配。
LC-MS经过了约30年的发展,直至采用了大气压离子化技术(Atmosphericpressureionization,API)之后,才发展成为可常规应用的重要分离分析方法。
现在,在生物、医药、化工、农业和环境等各个领域中均得到了广泛的应用,在组合化学、蛋白质组学和代谢组学的研究工作中,LC-MS已经成为最重要研究方法之一。
质谱仪作为整套仪器中最重要的部分,其常规分析模式有全扫描模式(Scan)、选择离子监测模式(SIM)。
(一)全扫描模式方式(Scan):
最常用的扫描方式之一,扫描的质量范围覆盖被测化合物的分子离子和碎片离子的质量,得到的是化合物的全谱,可以用来进行谱库检索,一般用于未知化合物的定性分析。
实例:
(Q1=100-259m/z)
(二)选择离子监测模式(SelectiveIonMonitoring,SIM):
不是连续扫描某一质量范围,而是跳跃式地扫描某几个选定的质量,得到的不是化合物的全谱。
主要用于目标化合物检测和复杂混合物中杂质的定量分析。
实例:
(Q1=259m/z)
本实验采用三重四极杆质谱仪(Q1:
质量分析器;Q2:
碰撞活化室;Q3:
质量分析器),由于多了Q2、Q3的存在,在分析测试的模式上又多了四种选择:
(三)子离子扫描模式(ProductScan):
第一个质量分析器固定扫描电压,选择某一质量离子(母离子)进入碰撞室,发生碰撞解离产生碎片离子,第二个质量分析器进行全扫描,得到的所有碎片离子都是由选定的母离子产生的子离子,没有其它的干扰。
主要用于化合物结构分析。
实例:
(Q1=259m/z;Q3=100-259m/z)
(四)母离子扫描模式(PrecursorScan):
第一个质量分析器扫描电压选择母离子(如分子离子),进入碰撞室碰裂后,第二个质量分析器固定扫描电压,只选择某一特征离子质量,该特征离子是由所选择的母离子产生的,由此得到所有能产生该子离子的母离子谱。
主要用于同系物的分析。
实例:
(Q1=100-300m/z;Q3=259m/z)
(五)中性丢失扫描模式(NeutralLoss):
第一个质量分析器扫描所有离子,所有离子进入碰撞室碎裂后,第二个质量分析器以与第一个质量分析器相差固定质量联动扫描,检测丢失该固定质量中性碎片(如质量数15、18、45)的离子对,得到中性碎片谱。
主要用于中性碎片的分析。
实例:
(Q1=100-300m/z;Q3=82-282m/z)
(六)多反应监测模式(MRM):
第一个质量分析器选择一个(或多个)特征离子,经过碰撞解离,到达第二个质量分析器再进行选择离子检测,只有符合特定条件的离子才能被检测到,因为是两次选择,比单四极质量分析器的SIM方式选择性、排除干扰能力、专属性更强,信噪比更高。
主要用于定量分析。
实例:
(Q1=259m/z;Q3=138m/z)
2、实验内容简介
邻苯二甲酸酯(简称PAEs)是一类重要的环境内分泌干扰物,常被用作塑料的增塑剂,也可用作农药载体。
近年来,随着工业生产和塑料制品的广泛使用,邻苯二甲酸酯不断进入环境,普遍存在于土壤、底泥、大气、水体和生物体等环境样品中,成为环境中无所不在的污染物。
据报道,邻苯二甲酸酯类具有较弱的环境雌激素成分,具有影响生物体内分泌和导致癌细胞增殖的作用。
环境内分泌干扰物是指能改变机体内分泌功能,并对机体、后代或(亚)种群产生有害效应的环境物质。
由于环境内分泌干扰物对人和动物有种种不良影响,对环境内分泌干扰物的研究已成为国际关注的焦点。
我国也正在逐渐重视有关环境内分泌干扰物的研究。
三、仪器与试剂
1、仪器
液相系统:
VarianProStar;
自动进样器:
Varian410自动进样器;
质谱仪:
Varian310LC-MS/MS三重四极杆质谱仪(ESI离子源);
色谱柱:
VarianInertsil3ODS-3(150mm×2mm,3μm)。
2、试剂
甲醇:
HPLC色谱纯;
超纯水:
MilliporeExpress超纯水系统制备;
标准溶液:
用甲醇配制邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)混合标准溶液(0.1ppm)。
四、实验步骤
1、条件设置
色谱条件:
流动相(90%甲醇+10%水);流速(0.2ml/min);扫描时间(7min);
离子源模式:
电喷雾电离(ESI),正离子模式;
扫描条件:
Detector:
1000V;Needle:
5000V;Shield:
600V;SprayChamberTemperature:
50℃;NebulizingGasPressure:
55psi;DryingGasPressure:
18psi,DryingGasTemperature(℃):
250℃,CapilaryVoltage30(V),Coll.Energy30(v);
质量分析器:
三重四极杆;
进样体积:
10ul。
2、实验测定
按实验操作规程完成仪器开机、参数设置及测定。
根据表1中的数据,设置m/z,选择各种扫描模式(全扫描、选择离子扫描、子离子扫描、母离子扫描、多反应监测模式)进行测定。
3、数据处理
表1待测物质的母离子和主要子离子
DMP
DEP
DBP
母离子(m/z)
195.1
223.1
279.1
子离子(m/z)
163.1
149.1
149.1
(一)全扫描模式方式(Scan):
(二)选择离子监测模式(SelectiveIonMonitoring,SIM):
(三)子离子扫描模式(ProductScan):
(四)母离子扫描模式(PrecursorScan):
(五)多反应监测模式(MRM):
4、思考题
1、各扫描模式中m/z分别如何设定?
(一)全扫描模式方式(Scan):
100-300m/z;
(二)选择离子监测模式(SelectiveIonMonitoring,SIM):
279m/z;
(三)子离子扫描模式(ProductScan):
Q1=279m/z,Q2=100-279m/z;
(四)母离子扫描模式(PrecursorScan):
Q1=149-300m/z,Q2=149m/z;
(五)多反应监测模式(MRM):
Q1=279m/z,Q2=149m/z;
2、比较各模式的测定结果,讨论各模式在测定中的作用。
(一)全扫描模式方式(Scan):
扫描的质量范围覆盖被测化合物的分子离子和碎片离子的质量,得到的是化合物的全谱,一般用于未知化合物的定性分析。
(二)选择离子监测模式(SelectiveIonMonitoring,SIM):
跳跃式地扫描某几个选定的质量,得到的不是化合物的全谱。
主要用于目标化合物检测和复杂混合物中杂质的定量分析。
(三)子离子扫描模式(ProductScan):
对碰撞解离产生碎片离子,第二个质量分析器进行全扫描,得到的所有碎片离子都是由选定的母离子产生的子离子,没有其它的干扰。
主要用于化合物结构分析。
(四)母离子扫描模式(PrecursorScan):
第一个质量分析器根据某一特征离子质量扫描电压,确定该特征离子是由哪种所选择的母离子产生的,由此得到所有能产生该子离子的母离子谱。
主要用于同系物的分析。
(五)多反应监测模式(MRM):
比其他模式更具有排他性、排除干扰能力、专属性更强,信噪比更高。
主要用于定量分析。
3、结合HPLC等其它色谱分析技术及实验,讨论LC-MS的优势及在社会中所能起到的作用。
答:
应用广泛,既能分离物质还能作精确分析,而且分析速度快,分离效率高,自动化等特点。
但表面活性剂不能进去,不能测无机离子。
可用于食品检测,药物杂质的质控等!
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