华理分子生物学实验.docx
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华理分子生物学实验.docx
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华理分子生物学实验
曲霉脂肪酶编码基因的克隆与表达分析
接入载体为pET-28a,外源基因为AFL-1,PCR产物直接酶切(NdeI/BamHI)后纯化连接pET28a
外源基因信息:
.ncbi.nlm.nih.gov/gene/?
term=3504452
AFL1-1(GeneID=3504452)序列信息统计如下:
1atggcttctccaattctgcgatcaccgattacttcggacctcgccaacgtaacacccgat
61ttggtggatgttagcactcccgaaaaattgaaatcctaccgcgaatcacttgaaccaatc
121ttcactttggagaatatcatccgagggaaagagaacatcatctcctacgaggaactggac
181atcccaggccccgcaggaccgatgcgggccaccatcttccgccccaagcaccaaacccac
241cctatcgatgaaatccctggtatcctacacatccacggcgggggcctcgccacgggaaac
301cgcttcctgggcttcaccatgctcgactgggtcgagtccctcggtgccgtctgcctgacg
361gccgagtaccgtctcgccccggaacatcaccagcccgcccagctggaagacagctacgcc
421gcgctgcagtggatgagcgaccacgccgccgagctgggcttcaacccgcgcaagctggtt
481gtctgcggtagctcggcggggggcaatctcacggcgggggtcaccttactcgcgcgggac
541cgctcgggcccgcaaatccgcggccaggtgttgatctatccgtgggttgacgatggcatg
601gactacgtgtccatgcggcagtatgcggatattgcgcctgtgagggacgtggacgccgcc
661gtgttggctaattatgcgtttggcgagaggcgcgagcacgcggatatgtatactgtgccg
721atgcgcgcgacgaatttcgcgggcttgcccccgacgtttatcgatgtgggtgaggcggat
781gtgtttcgtgatcaggatatcgcgtacgcgtcggctttgtggaaggatggtgtctcgact
841gagttgcatctgtggccgggcagttggcatgggtttgatgtctttgttcctgatgctccc
901attagtcggcgggcgagggctgctcggttggaatggcttcggaagttgttaagtgtgcct
外源基因PCR扩增引物序列:
P1:
5’GCGCGGCAGCCATATGGCTTCTCCAATTCTGCGA3’
P2:
5’GCTCGAATTCGGATCCAGGCACACTTAACAACTTCCGAAG3’
N端保留了标签,用于亲和层析
实验流程安排
第一天外源基因的制备
涉及实验:
PCR、酶切、电泳、回收
掌握实验原理:
PCR及基本要素和注意点、酶切、电泳、回收
实验顺序:
PCR扩增-->电泳-->纯化-->酶切-->电泳-->割胶及回收-->载体接种
进度限制点:
PCR为统一开机,需要所有同学完成后进行
上交样品:
外源基因回收样品,标记好组号
外源基因的PCR制备体系
1#2#
总体积50l50l
ddH2O35l34l
10×buffer5l5l
dNTP(2.5mM)4l4l
P1(5pmol/l)2l2l
P2(5pmol/l)2l2l
模板DNA1l2l
Taq酶(5U/l)0.25l0.5l
PCR反应条件:
退火温度61度30s,延伸时间1min。
预变性:
95度,5min,
变性95度,30s,
退火61度,30s,
延伸72度,1min,
30循环。
延伸72度,10min,
4度保存。
或取出实验,或取出后-20度保存。
PCR回收样品的酶切体系
总体积ddH2OPCR回收产物BufferNdeI/BamHI
40l15l20l4l0.6+0.6l
酶切反应条件:
37度水浴保温30min。
PCR产物纯化:
产品说明书
DNA片段回收:
胶回收试剂盒说明书
思考问题:
1.PCR中的退火温度和延伸时间如何确定?
产物浓度不高的原因?
2.PCR实验中如果出现无产物,该如何分析原因?
3.PCR扩增产物如果保证其准确性?
如果出现扩增基因点突变时,有何解决方法?
4.电泳中针对300bp和5.6kb的片段,胶浓度如何选择?
5.胶回收过程中出现无产物带时,如何选择原因?
第二天载体质粒的制备
涉及实验:
质粒抽提、酶切、电泳、回收、连接
掌握实验原理:
质粒抽提、连接及体系确定
实验顺序:
抽提质粒-->电泳-->酶切-->电泳-->割胶回收-->电泳-->连接-->感受态接种
进度限制点:
均为各组独立实验,无限制点
上交样品:
载体质粒(P)、载体酶切片段(F)、连接样品(L),标记组号
质粒提取:
产品说明书
载体质粒双酶切
Total40μl
ddH2O34-Xμl
10×buffer4μl
质粒DNAXμl
NdeI/BamHI1+1μl
酶切反应条件:
37度水浴保温30min。
正常情况下,全做酶切。
(因回收后条带较淡)
连接体系
∑10×Buffer载体片段外源片段T4DNA连接酶
15l1.5lXlYl0.5l
连接反应条件:
4度水浴保温过夜。
思考问题:
1.质粒的拷贝数通常有哪些?
对于低拷贝质粒的制备该如何进行?
2.未酶切的质粒正常带型是如何分布的?
如出现异常现象该如何处理?
3.双酶切如发生酶切不完全时,产物带如何分析?
在电泳中如果观察?
4.重组质粒构建中外源和载体的投入量如何确定?
针对不同粘性末端的DNA片段连接该注意什么?
5.大体积酶切(如1ml体积,DNA量为毫克级)该如何设计酶切体系和酶切时间?
第三天转化与RNA抽提
涉及实验:
感受态细胞制备、转化、RNA抽提
掌握实验原理:
细菌细胞感受状态、转化、细菌RNA抽提
实验顺序:
翻瓶(7:
30)-->感受态细胞制备-->RNA抽提-->转化-->RNA样品电泳-->涂板
进度限制点:
冷冻离心和操净台公用
上交样品:
涂布平板2块/组,统一放置37度培养箱
大肠杆菌感受态细胞的制备
1.用牙签挑取少许宿主菌保藏液稀释划线于LB固体培养基上,37℃下隔夜培养。
2.挑取单菌落接种于30mlLB液体培养基中,37℃下隔夜培养。
3.按1%的接种量将大肠杆菌菌液接种于30mlLB培养基中。
4.在37℃的水浴摇床中培养1.5小时,OD600接近0.5。
(以上步骤教师完成)
5.4℃,6000rpm离心10分钟收获菌体。
1.0ml/管,4管/组
6.上述菌体沉淀用100l/管的100mmol/LCaCl2(冰冻)悬浮,并合并于一管,4℃,6000rpm离心10分钟。
7.弃上清,将沉淀用100l的100mmol/lCaCl2(冰冻)重新悬浮。
8.冰水浴中放置3-5h放可使用。
RNA抽提:
产品说明书
大肠杆菌的转化
1.取一管已制备好的大肠杆菌感受态细胞置于冰水浴中。
2.在90l感受态细胞悬浮液,加入6lDNA连接溶液,轻轻混匀,在冰水浴中放置30分钟。
3.混匀,42℃水浴中脉冲2分钟,快速转移至冰水浴中,加入900lLB培养基,37℃摇床培养1~1.5小时。
(42℃热脉冲前混匀菌体)
4.吸取适量已转化的感受态细胞涂布于100g/ml卡那霉素的LB平板上。
(涂布量确定?
本次实验离心后弃上清850l,离心条件4℃,6000rpm,5min)
5.37℃下倒置培养12~16小时后计数。
思考问题:
1.大肠杆菌转化除了感受态细胞转化方法外,还有哪些方法?
2.细菌RNA的半衰期特点?
如何判断RNA的抽提质量?
3.抽提RNA过程中为何要带手套和口罩?
常规DNA电泳可以分析RNA抽提质量否?
4.转化子筛选原理?
一般筛选中还有哪些方法?
5.转化完成最后筛选平板上几乎没有转化子,转化失败可能的原因有哪些?
第四天重组子鉴定与转录水平的表达分析
涉及实验:
转化计数、单菌落接种、菌落PCR、RT-PCR
掌握实验原理:
转化子与重组子、RT-PCR
实验顺序:
菌落接种(Eppedorf)-->RT-PCR-->电泳-->菌落PCR-->电泳-->接种
进度限制点:
PCR为统一开机,需要所有同学完成后进行
上交样品:
接种重组子的试管1根/组,统一放置37度摇床培养
逆转录体系(电子产品说明书RR037A)
∑5×Buffer(含dNTP)EnzymeMixOligodTRandom6mersRNARNAFreedH2O
10l2l0.5l0.5l0.5l1l5.5l
对照∑5×BufferEnzymeMixOligodTRandom6mersRNARNAFreedH2O
10l2l0l0.5l0.5l1l6l
逆转录反应条件:
37℃15min
85℃5sec
PCR体系:
逆转录组对照组
总体积20l20l
ddH2O7l7l
2×MIX10l10l
P1(5pmol/l)1l1l
P2(5pmol/l)1l1l
模板DNA(逆转录溶液)1l1l
菌落PCR
总体积25l
ddH2O10l
2×MIX12.5l
P1(5pmol/l)1l
P2(5pmol/l)1l
模板DNA(菌液)0.5l
每组完成4个菌落的PCR鉴定,其中BL21(DE3)和DH5a各两个;
PCR反应条件:
退火温度61度30s,延伸时间1min。
预变性:
95度,5min,
变性95度,30s,
退火61度,30s,
延伸72度,1min,
30循环。
延伸72度,10min,
电泳鉴定。
思考问题:
1.逆转录过程中需要注意RNA酶污染情况否?
为什么?
2.RT-PCR是定性分析外源基因表达情况?
如果要进行定量分析外源基因表达情况,如何设定参?
3.菌落PCR的模板DNA来源何处?
为何能直接以菌液模板进行PCR?
血液样品可否直接PCR?
4.PCR预混液主要包括哪些组份?
如进行批量转化子的菌落PCR鉴定,如何实验可以大大节约时间?
如果没有购买预混液,可否自行配制?
如果进行?
第五天重组菌的蛋白表达
涉及实验:
重组菌表达、SDS-PAGE灌胶、蛋白电泳
掌握实验原理:
诱导、SDS-PAGE电泳
实验顺序:
翻瓶-->制分离胶-->诱导-->制浓缩胶-->菌体样品处理-->点样电泳
进度限制点:
菌体培养摇床公用
上交样品:
无
SDS-PAGE分离胶和浓缩胶配制
组分分离胶(l)浓缩胶(l)
双蒸水16502700
30%丙烯酰胺2000670
(甲叉双丙烯酰胺)
分离胶缓冲液(PH8.8)1250—
浓缩胶缓冲液(PH6.8)—500
10%SDS5040
10%过硫酸铵5040
TEMED2.52.5
总体积50004000
菌体电泳样的制备
将菌体均匀悬浮,测OD600,若>1,则稀释,离心,弃上清,按照1OD/1ml沉淀中加入100µl1*loadingbuffer(50水+50µl2*loadingbuffer),悬浮,沸水浴5min,离心后,3µl上样。
例如:
若OD600nm为0.6,体积为0.5,则所得沉淀中相应加入
0.6*0.5=30µl1*loadingbuffer(15µl水+15µl2*loadingbuffer)
资料复印:
上述6页、PCR产物回收试剂盒、胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒和RNA抽提试剂盒的说明书
讲解容:
周一(准备):
移液器使用、实验总体克隆方案、整个实验周期需要注意的问题(实验的连续性及空余时间的利用、实验的安全、实验报告--总结报告)
周二(Day1):
PCR基本原理、基因克隆中PCR的常规难点(模板----DNA、cDNA)、利用基因同源序列进行全长克隆的方法、模板和酶的优化等问题
周三(Day2):
质粒抽提的基本原理(碱裂解法、低拷贝大质粒的抽提方法、特殊受体来源的抽提方法)、限制性切酶的定义、酶切体系的设计、多样品同种酶切的实验快速方法、大量DNA酶切的方法、联合酶切、不同公司来源的酶混合联用等,快切酶技术等。
周四(Day3):
感受态细胞类型(克隆受体、表达受体)、DNA连接效率的决定因素、转化效率的限制因素、转化实验的对照设置及转化效率低的原因分析、RNA抽提原理等
周五(Day4):
重组鉴定的方法(标记基因、PCR鉴定、酶切鉴定、测序验证)、PCR模板(菌液、血液。
。
。
。
。
)、RT-PCR的定性和定量分析与参选择
周六(Day5):
表达系统(大肠杆菌、链霉菌、酵母、动物细胞。
。
。
)
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- 分子生物学 实验
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