生物制药工程实验讲义.docx
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生物制药工程实验讲义.docx
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生物制药工程实验讲义
实验一大孔吸附树脂分离技术在生物制药中的应用(对应教材8.4)
一、目的要求
⑴了解黄酮类等化合物的特性;
⑵掌握黄酮类药物的提取分离技术与方法;
⑶掌握大孔吸附树脂分离黄酮类化合物的方法;
⑷掌握黄酮类药物制备工艺。
二、实验原理
大孔吸附树脂(macroporousabsorptionresin)属于功能高分子材料,是近30余年来发展起来的一类有机高聚物吸附剂,是吸附树脂的一种,由聚合单体和交联剂、致孔剂、分散剂等添加剂经聚合反应制备而成。
聚合物形成后,致孔剂被除去,在树脂中留下了大大小小、形状各异、互相贯通的孔穴。
因此大孔吸附树脂在干燥状态下其内部具有较高的孔隙率,且孔径较大,在100~1000nm之间,故称为大孔吸附树脂。
大孔树脂的表面积较大、交换速度较快、机械强度高、抗污染能力强、热稳定好,在水溶液和非水溶液中都能使用。
大孔吸附树脂具有很好的吸附性能,它理化性质稳定,不溶于酸、碱及有机溶媒,对有机物选择性较好,不受无机盐类及强离子低分子化合物存在的影响,可以通过物理吸附从水溶液中有选择地吸附有机物质。
大孔树脂是吸附性和筛选性原理相结合的分离材料,基于此原理,有机化合物根据吸附力的不同及分子量的大小,在大孔吸附树脂上经一定的溶剂洗脱而分开。
由于大孔吸附树脂的固有特性,它能富集、分离不同母核结构的药物,可用于单一或复方的分离与纯化。
但大孔吸附树脂型号很多,性能用途各异,而中药成分又极其复杂,尤其是复方中药,因此必须根据功能主治明确其有效成分的类别和性质,根据“相似相溶”的原则,即一般非极性吸附剂适用于从极性溶液(如水)中吸附非极性有机物;而高极性吸附剂适用于从非极性溶液中吸附极性溶质;中等极性吸附剂,不但能够从非水介质中吸附极性物质,同时它们具有一定的疏水性,所以也能从极性溶液中吸附非极性物质。
三、实验器材
试剂:
大孔吸附树脂D101,乙醇,白头翁,正丁醇,醋酸,乙醚,蒸馏水,丙酮,活性炭等
仪器:
烧杯,漏斗,三角烧瓶,索氏提取器,电子天平,恒温水浴锅,硅胶,色谱柱,待回流液1份回流
四、实验步骤
1.大孔吸附树脂的预处理
取100gD101型大孔吸附树脂,于500ml索氏提取器中用150ml乙醇回流3h,待回流液1份加3份水无浑浊时,取出树脂沥干乙醇,放入蒸馏水中,浸泡待用。
2.皂苷的提取
去粉碎后的白头翁药材粗粉5g,加入20ml工业酒精回流1h左右,过滤,浓缩至5-10ml,活性炭脱色过滤(可省略),5ml乙醚沉淀,过滤,沉淀用少许水溶解,上柱。
3.色谱分离
取一玻璃柱,检查柱子,湿法装入10-12g处理好的大孔吸附树脂,上端加入少许棉花,去总皂苷液上柱,用分别用30ml水、20ml20%乙醇、20ml50%乙醇、30ml95%乙醇洗脱。
收集各洗脱液。
各洗脱液于水浴加热浓缩至1ml左右点样用。
4.薄层色谱鉴定
展开剂:
正丁醇-醋酸-水(4:
1:
1);显色:
10%硫酸乙醇105℃显色。
注意事项:
配制展开剂时要充分摇匀;加乙醚时边搅拌边加,是沉淀完全。
五、结果与分析
记录实验条件、现象、图谱、斑点颜色、各试剂用量等。
思考题:
1.大孔吸附树脂法提取分离皂苷的原理是什么?
有何特点?
2.为什么要进行树脂的预处理?
实验二银杏中生物活性成分黄酮的提取和测定(对应教材8.7)
一、目的要求
⑴掌握银杏黄酮提取制备原理和方法;
⑵掌握银杏黄酮性质测定方法;
⑶掌握银杏黄酮提取制备工艺。
二、实验原理
(略)通过实验,学生分析总结。
三、实验器材
试剂:
银杏叶,芸香叶苷,亚硝酸钠,硝酸铝,氢氧化钠等
仪器:
紫外分光光度计,粉碎机,烘箱,电子天平,恒温水浴锅,搅拌器,冷凝管,温度计,真空泵,容量瓶等
四、实验步骤
1.银杏黄酮提取
(1)银杏叶干燥,粉碎,筛分,精确称取20目的叶片10g。
(2)将其和35ml70%乙醇加入到100ml圆底烧瓶50-70℃回流1-2h。
(3)将粗提取液过滤、抽滤,再用70%乙醇定容至50ml。
(4)定容液中黄酮类化合物用紫外分光光度计测定
2.银杏黄酮的测定
(1)标准溶液的配制
精确称取芸香叶苷5mg,置于50ml容量瓶中,加入适量60%乙醇,在水浴上加热溶解,自然冷却,用60%乙醇稀释至刻度,摇匀。
(2)标准曲线的制作
取10ml容量瓶6只,分别准确吸取标准液1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml、置于10ml容量瓶中,另一容量瓶中不加标准溶液(配制空白液,作参比)。
然后各加入30%乙醇补至5ml,加入5%亚硝酸钠溶液0.3ml,摇匀,放置6min,再加10%硝酸铝溶液0.3ml,摇匀,再放置6min,加4%NaOH溶液4ml,用水稀释到10ml,放置20min。
在紫外-可见分光光度计上,先取两个2cm比色皿加空白溶液,调零。
取出一个比色皿,分别加入不同浓度的溶液,在波长510nm处测定吸光度,以黄酮含量为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。
(3)未知液中黄酮含量的测定
吸取2ml未知液代替标准溶液,其它步骤同上,测定吸光度。
由未知液的吸光度在标准曲线上查2ml未知液中黄酮的含量。
五、结果与分析
试液编号
标准溶液的量/ml
总黄酮量
吸光度A
1
0
0
2
1.0
0.1
3
2.0
0.2
4
3.0
0.3
5
4.0
0.4
6
5.0
0.5
未知液
绘制标准曲线,并计算提取的银杏总黄酮的含量。
思考题:
1.回流提取法的原理是什么?
2.分光光度发测定的原理是什么?
3.如果提取时间延长对最终黄酮的含量测定有什么影响?
实验三大黄中蒽醌类化合物的提取分离(对应教材8.11)
一、目的要求
⑴掌握蒽醌及蒽醌衍生物的理化性质及提取分离方法。
;
⑵掌握柱层析等分离方法的操作过程、蒽醌类成分的各类检识方法;
⑶了解蒽醌类化合物的提取制备工艺。
二、实验原理
大黄种类繁多,优质大黄是蓼科植物掌叶大黄(RheumPalmatum.L)、大黄R.officinaleBaill)及唐古特大黄(R.tanguticumMaxiimetRegll)的根茎及根。
蒽醌类化合物在植物体内主要以苷的形式存在,其中有大黄酸-葡萄糖苷;大黄素甲醚-葡萄糖苷;芦荟大黄素-葡萄糖苷;大黄素-葡萄糖苷;大黄酸双葡萄糖苷等。
此外尚含鞣质类成分如葡萄糖没食子鞣质,儿茶鞣质、没食子酸等。
大黄中还含有属于双蒽酮的番泻苷A及番泻苷B。
蒽苷内服后有致泻、清热解毒作用,尤其是大黄酸葡萄糖苷有较强的致泻作用。
游离的羟基蒽醌如大黄酸、大黄素有明显的抗菌活性。
大黄中蒽醌类化合物有结合态和游离态两种形式存在,为得到游离蒽醌类化合物,先酸水解,使蒽醌类化合物以苷元的形式游离出来。
1.大黄酸(Rhein)本品黄色针状结晶(升华法),熔点321~322℃,330℃分解。
几乎不溶于水,溶于碱、乙醇、苯、三氯甲烷、乙醚和石油醚。
2.大黄素(Emodin)
本品系橙黄色长结晶(丙酮),C15H10O5,在有机溶媒的溶解度情况如下(25Cw/w):
四氯化碳0.01%;苯0.041%;三氯甲烷0.071%;乙醚0.14%,几乎不溶于水,溶于乙醇及氢氧化钠,碳酸钠,氨水溶液中。
3.大黄素甲醚(Physcion)
砖红色单斜状结晶,溶点207~209℃。
溶于苯、三氯甲烷、甲苯、乙醇、冰醋酸、不溶于乙醚和丙酮。
4.大黄酚(Chrysophanol)
本品六方形或单斜形结晶(乙醇或苯),熔点196℃;升华,几乎不溶于水,略溶于冷乙醇,易溶于沸乙醇,溶于苯、三氯甲烷、乙醚及丙酮等。
5.芦荟大黄素(Aloeemodin)
橙色针状结晶(甲苯),熔点223~224℃。
易溶于热乙醚。
在乙醚及苯中呈黄色,氨水及硫酸中呈绯红色。
A:
大黄酸;B:
大黄素;C:
芦荟大黄素;D:
大黄酚;E:
大黄素-6-甲醚
三、实验器材
试剂:
大黄粗粉,石油醚,甲酸,浓氨水,氢氧化钠,碳酸钠,羧甲基纤维素钠等。
仪器:
萃取装置,色谱缸,点样毛细管,紫外分析仪,电吹风,烘箱,天平,量筒等。
四、实验步骤
1.提取
2.pH梯度萃取(不做,供参考)
3.薄层色谱鉴别
点样:
总蒽醌产品及其样品
展开剂:
石油醚-乙酸乙酯(9:
1)
显色:
可见光下显黄色斑点;紫外灯下显亮黄色斑点;置层析缸中氨熏蒸10分钟,斑点为红色;氨熏蒸后于365nm下,观察斑点颜色;3%氢氧化钠或者碳酸钠溶液喷后显示红色斑点。
五、结果与分析
1.记录实验条件、过程和反应现象。
2.计算各个成分的Rf值。
3.记录图谱和斑点的颜色。
思考题:
1.将五种成分按照极性大小顺序排列?
2.如何鉴别出各斑点是什么化合物,应如何进行?
实验四芦丁的提取与鉴定(对应教材8.3)
一、目的要求
⑴了解芦丁的提取制备原理;
⑵掌握不同的提取分离方法;
⑶掌握芦丁的鉴别方法。
二、实验原理
槐花米系豆科槐属植物槐树(SophorajaponicaL)的花蕾,自古用作止血药物。
治疗吐血,痔疮便血、子宫出血、鼻血等症,所含主要成分为芸香苷,又称芦丁(Rutin,维生素P),其含量高达12~16%,有调节毛细血管渗透性之作用,临床用作毛细血管止血药,如复方芦丁,也作为高血压的辅助治疗药物。
芦丁(芸香苷,rutin),淡黄色针晶,水中结晶者含3分结晶水,C27H30O16·3H2O。
100mmHg和110℃加热12小时后,变为无水物,无水物于25℃变棕,115~7℃软化,214~5℃发泡分解,1g芦丁溶于约300ml冷水,200ml沸水,7ml沸甲醇,溶于吡啶,甲酰胺和碱液,微溶于乙醇、丙酮、乙酸乙酯,不溶于氯仿,二硫化碳、乙醚、苯和石油醚。
三、实验器材
试剂:
硼砂,槐花,石灰乳,蒸馏水,正丁醇,醋酸,乙醇,三氯化铝,α-萘酚,浓硫酸,镁粉,盐酸,羧甲基纤维素钠,硅胶等
仪器:
烧杯,滤纸,纱布,电炉,圆底烧瓶,三角烧瓶,玻璃棒,电子天平,抽滤瓶,布氏漏斗,紫外分析仪,试管,冰箱等
四、实验步骤
1.水提取法
称取槐花米粗粉(20g),在500ml烧杯中加入水250ml,加热30min,补充失去的水分,用4层纱布趁热过滤,滤渣重复提取一次。
合并滤液,放置冰箱中析晶,待全部析出后减压抽滤,用去离子水洗芦丁结晶,抽干,放置空气中自然风干得粗芦丁,称重。
2.碱提酸沉法
称取槐花米粗粉(20g),在500ml烧杯中加入水250ml,硼砂1g[注1]在加热至沸腾时,投入槐花米,继续直火煮沸2~3分钟,在搅拌下小心加入石灰乳,调至8.5~9[注2]保持微沸30分钟,趁热用尼龙布挤过滤,取滤液。
滤液在60~70℃下用浓盐酸调pH至4[注3],静置6小时以上析出沉淀。
抽滤,用水洗3-4次,放置空气中自然风干得粗芦丁,称重。
注1:
硼砂因能与芦丁结合,起保护邻二酚羟基,不被氧化破坏的作用,实验证明,提取时加入硼砂,产品质量要好些。
注2:
加石灰乳既能达到碱溶解提取芦丁的目的,还可以除去槐花米中大量的粘液质和酸性树脂(形成钙盐沉淀),但pH不能过高和长时间煮沸,因为会导致芦丁的降解。
注3:
pH过低会使芦丁形成锌盐而降低收率。
3.芦丁的精制
取静置物抽滤,用蒸馏水洗沉淀1~2次至中性,滤液弃去,沉淀即为芦丁粗品。
粗品粗称重后按芦丁在热水中1:
200的溶解度加蒸馏水进行重结晶。
将沉淀悬浮于蒸馏水中,加热煮沸15分钟,趁热过滤。
弃去残渣,滤液充分静置析晶,抽滤,60-70℃干燥,称重得芦丁精品。
4.黄酮苷的鉴别
取芦丁少量于试管中,加乙醇10ml,在水浴上加热溶解。
①盐酸-镁粉反应:
取芦丁液2ml,加浓盐酸2~3滴及镁粉少量,放置(或于水浴中微热),产生红色反应。
②取芦丁液1ml,滴加PbAC2溶液数滴,产生黄色沉淀。
③纸片法:
将芦丁液滴于滤纸上喷以3%FeCl3乙醇溶液,出现亮黄、绿、兰或棕色斑点。
5.芦丁的纸色谱鉴定
展开剂:
正丁醇-醋酸-水(4:
1:
5)上层溶液,喷三氯化铝前后,置日光及紫外(365nm)灯检观察色斑的变化。
五、结果与分析
1.记录实验条件、现象、图谱、斑点颜色、各试剂用量及其产品芦丁的重量。
2.计算芦丁的理论产量和实际得率。
思考题:
1.黄酮类化合物还有哪些提取方法?
2.对比两种提取方法的优缺点?
3.如果产品的实际收率不高,可能的原因是什么?
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