中介蝮Gintermedius蛇毒磷脂酶A2的分离纯化及生物活性研究.docx
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中介蝮Gintermedius蛇毒磷脂酶A2的分离纯化及生物活性研究
密级:
公开
分类号:
Q5
提交日期二○一一年五月
学号:
281744
硕士学位论文
题目中介蝮(G.intermedius)蛇毒磷脂酶A2的分离纯化及
生物活性研究
作者杜国俊
指导教师杨章民教授
提交日期二○一一年五月
学科专业生物化学与分子生物学
学位论文独创性声明
本人声明所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。
尽我所知,除文中已经注明引用的内容外,论文中不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得陕西师范大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。
对本文的研究做出重要贡献的个人和集体,均已在文中作了明确说明并表示谢意。
作者签名:
杜国俊日期:
2011-5-29
学位论文使用授权声明
本人同意研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属陕西师范大学。
本人保证毕业离校后,发表本论文或使用本论文成果时署名单位仍为陕西师范大学。
学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其它指定机构送交论文的电子版和纸质版;有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆、院系资料室被查阅;有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索;有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。
作者签名:
杜国俊日期:
2011-5-29
摘要①
蛇毒磷脂酶A2(SnakevenomphospholipaseA2,svPLA2)是蛇毒中毒性最强的组分,除具有酶活性外,还可能具有多种毒理学活性,具有潜在的利用价值。
同一种毒蛇的蛇毒中可能存在多种PLA2,虽然它们的氨基酸序列和空间结构相似,一级结构差异不大,但功能上却差异明显,因此是研究蛋白质结构和功能的极好模型,也是蛇毒研究领域的一个热点。
中介蝮(Gloydiusintermedius)为蝰科蝮亚科(Crotalinae)毒蛇,广泛分布于我国西北、华北地区,是我国6种蝮蛇中毒性最强的一种,其PLA2的结构及作用的分子机制有待阐明,而分离获得PLA2是解决这些问题的前提。
本研究的内容及结果:
1.中介蝮蛇毒PLA2的分离纯化
(1)以中介蝮粗毒为原料,用Sephacryl-200HR凝胶过滤层析柱进行初步分离,用50mmol/L醋酸铵缓冲液洗脱,分离得到8个蛋白峰(Peak1-8)。
以获得的峰组分1mL腹腔注射昆明小鼠,观察急性毒性效应,并采用SDS-PAGE分析组分的蛋白纯度。
结果表明,Peak1和Peak8蛋白含量甚微,无致死活性。
Peak2、Peak6和Peak7虽然有小鼠致死活性,但是没有引起偏瘫和呼吸衰竭,而且有出血,推测可能为出血毒素。
Peak3、Peak4、Peak5有致死活性,且能引起偏瘫及呼吸衰竭,可能为神经毒素。
SDS-PAGE分析发现这3个组分都非单一条带,因此需要进一步分离。
(2)用HiTrapQ阴离子交换层析对具有神经毒性的Peak3、4、5进一步的分离纯化,上样后以A液(50mmol/L醋酸铵缓冲液,pH7.8)洗脱未结合的组分,之后从A液到100%B液(50mmol/L醋酸铵缓冲液,0.5mol/LNaClpH7.8)进行线性梯度洗脱。
收集各洗脱峰及穿透峰,然后取各组分1mL腹腔注射昆明小鼠,根据急性毒性结果判定神经毒素活性,用SDS-PAGE分析组分纯度。
结果表明,Peak3-1、Peak4-1和Peak5-2有致死活性,且局部有出血,其可能为出血毒素。
Peak3-2、Peak4-2、Peak5-1均有致死活性,且可导致偏瘫及呼吸衰竭,为神经毒素,由于SDS-PAGE分析发现不是单一条带。
(3)最后,利用HiTrapSP阳离子交换柱对有PLA2神经毒活性的3个峰组分(Peak3-2、Peak4-2、Peak5-1)进行了分离,上样后以A液(50mmol/L醋酸铵缓冲液,pH5.5)为起始洗脱液,之后从A液到100%B液(50mmol/L醋酸铵缓冲液,0.5mol/LNaClpH5.5)进行线性梯度洗脱,收集各洗脱峰。
腹腔注射昆明小鼠,观察急性毒性效应,同步用SDS-PAGE分析组分纯度,卵磷脂琼脂平板法检测致死毒性组分的PLA2活性。
结果表明,Peak3-2-2、Peak4-2-1、Peak4-2-2和Peak5-1-2无致死活性,Peak3-2-1和Peak5-1-1均有致死活性,Peak3-2-1分子量在14kDa左右,纯度接近单一条带,Peak5-1-1仍有三个条带,不纯。
Peak3-2-1、Peak5-1-1都具有磷脂酶A2活性,其中Peak3-2-1的PLA2活性最高。
2.生物活性初步检测:
(1)酶活性检测:
以中介蝮蛇粗毒做阳性对照,卵磷脂琼脂平板法检测了Peak3-2-1组分的PLA2酶活性,结果显示Peak3-2-1比粗毒的透明圈大。
(2)抑菌活性检测:
以大肠杆菌为对象,粗毒为阳性对照,PBS为阴性对照,检测Peak3-2-1组分的24h抑菌效应,粗毒组出现的抑菌圈明显,而Peak3-2-1组分的抑菌活性不高。
(3)溶血活性检测:
以粗毒为阳性对照,红细胞血红蛋白释放法测定毒素的溶血活性,发现Peak3-2-1组分可以引起溶血,但活性比粗毒低。
(4)以SD大鼠的膈神经-肌肉接头标本为模型,电生理学方法检测了Peak3-2-1的突触阻断效应,发现Peak3-2-120min后就可以抑制间接刺激诱发的膈肌收缩,60min后膈肌收缩下降到只有正常幅度的10%左右。
而且Peak3-2-1对间接刺激诱发的大鼠膈肌收缩有抑制作用,但不影响直接刺激膈肌引起的肌肉收缩,说明它抑制的是神经-肌肉接头的传递,而对肌肉组织本身无明显影响,其作用部位在突触间隙,因此属于神经毒素。
结论:
采用凝胶过滤层析和离子交换层析技术,从中介蝮蛇粗毒中筛选分离得到了一种具有神经毒性的PLA2,其分子量大约为14kDa,该PLA2具有溶血活性、无抑菌活性。
本工作为下一步研究中介蝮PLA2的分子进化及作用机理奠定了基础。
关键词:
中介蝮,蛇毒,磷脂酶A2,分离纯化,生物活性
Abstract
PhospholipaseA2(svPLA2)isthemosttoxiccomponentsnakevenom,svPLA2possessseveraltoxicologicalactivitiesbesidesenzymaticactivity,whichmayhavepotentialsinapplication.SnakevenomfromonespeciesmaycontainseveralkindsofPLA2,theirprimarystructuresaresimilar,butthecorrespondingfunctionmaybemarkedlydiverse,thereforePLA2shaveservedasagoodmodelforthestudyofproteinstructure-functionrelations.Italsobecomeahotspotinsnakevenomresearch.
GloydiusintermediussubordinatestotheGenusGloydius,CrotalinaeofViperidae,whichmainlydistributesinnorthwestandnorthChina,isthemosttoxicspeciesamongsixpit-vipersinChina.Littleisstillknownaboutitsstructureandmolecularmechanismofenvenomation,whiletheobtainingofpurePLA2isapreconditionfortheaddressingoftheseissues.
MethodsandResults:
1.PLA2Purification.
Atfirst,PLA2swereseparatedbyusingSizeexclusionchromatography(Sephacryl-200HR)fromGloydiusintermediuscrudevenom.Afterelutionwith50mmol/Lammoniumacetatebuffer(pH7.3),eightfractionswereobtained(designatedPeak1-8).Acutetoxicitywasassessedbyinjectionintraperitonealwith1mLofeachpeakfractioninmice,puritywasanalyzedbySDS-PAGE.Theresultsshowedthat,Peak1andPeak8werenotlethalformiceandtheproteinconcentrationwereverylow.Peak2,Peak6andPeak7werelethalandhemorrhagic,butdidn’tcauseparalysis,sowerespeculatedashemorrhagictoxins.FractionsPeak3,Peak4andPeak5werebothlethalandparalyticneurotoxins,butwerestillmixed,asrevealedbySDS-PAGEanalysis.
Secondly,fractionsPeak3,peak4andPeak5wereseparatedwithanionexchangechramatographyonaHiTrapQcolumn.Afterloadingeachsample,ProteinwaselutedwithalineargradientfromstartbufferA(50mmol/Lammoniumacetate,pH7.8)toelutionbuffer(50mmol/Lammoniumacetate,0.5mol/LNaCl,pH7.8),unboundproteinsandboundproteinswerecollected.Acutetoxicitywasassessedbyinjectionintraperitonealwith1mLofeachpeakfractioninmice,puritywasanalyzedbySDS-PAGE.Theresultsshowedthat,Peak3-1,Peak4-1andPeak5-2werehemorrhagicandlethal.Peak3-2,Peak4-2andPeak5-1werelethalandparalyticneurotoxins,butwerestillmixedasrevealedbySDS-PAGE.
Then,threeneurotoxicfractions(Peak3-2,Peak4-2andPeak5-1)werefurtherseparatedbycationexchangechromatographyonaHiTrapSPcolumn.Aftersampleloadingofeachfraction,ProteinwaselutedwithalineargradientfromstartbufferA(50mmol/Lammoniumacetate,pH5.5)toelutionbuffer(50mmol/Lammoniumacetate,0.5mol/LNaCl,pH5.5),unboundproteinsandboundproteinswerecollected.Acutetoxicitywasassessedbyinjectionintraperitonealwith1mLofeachpeakfractioninmice,puritywasanalyzedbySDS-PAGE,enzymeactivitiesweredeterminedbylecithinhydrolysisonagaroseplates.Theresultsshowedthat,Peak3-2-2,Peak4-2-1,Peak4-2-2andPeak5-1-2werenotlethal.Peak3-2-1andPeak5-1-1werelethalandtheenzymeactivityoftheformerwashigherthanthatofthelatter.Peak3-2-1,witharelativemolecularweightof14kDawasalmostpureandPeak5-1-1containedmulti-bands.
2.CharacterizationoftheBiologicalActivity.
Firstly,withcrudevenomaspositivecontrol,PLA2enzymeactivitieswerecomparedbymethodoflecithinhydrolysisonagaroseplates.TheresultshowedthatfractionPeak3-2-1causedlargertransparentcirclethancrudevenomonagaroseplate.
Secondly,withcrudevenomandPBSaspositiveandnegativecontrols,theantibacterialactivitywereevaluatedonE.coli.24hourlater,crudevenomcausedobvioustransparentcircle,whilePeak3-2-1onlyshowedsubtleantibacterialactivity.
Next,hemolysisactivity,whichrevealstheindirectPLA2activity,weretestedwithRBChemoglobinreleasemethod.OnhumanRBCs,Peak3-2-1showedlowerhemolyticactivitythanthepositivecontrol.
Finally,withphrenicnerve-diaphragmmusclepreparationofSDratasamodel,theblockingactivityoffractionPeak3-2-1weremeasured.Musclecontractioninhibitoryeffectwasobserved20minafteradditionofPeak3-2-1(50μg/mL)intotheMOPSmedium,diaphragmcontractiondeclinedtoonlyabout10%ofthenormalmagnitude.Peak3-2-1onlyblockedtheindirectstimulateddiaphragmcontraction,butdidn’tinfluencedirectstimulatedmusclecontraction,indicatingthattheblockingeffectwasonnerve-musclejunction(synapse),butnotdiaphragmitself.SoproteininPeak3-2-1isaneurotoxin.
Conclusion:
bycombineduseofsizeexclusionchromatographyandionexchangechromatography,aneurotoxinwithPLA2activityandabout14kDahasbeensuccessfullyseparatedfromGloydiusintermediusvenom.Itpossessespotenthemolyticandweakantibacterialactivity.Thisworkmaythereforeestablishthebasisfortheinvestigationoffunction,strctureandmolecularmechanismofenvenomationinthefuture.
Keywords:
Gloydiusintermedius,snakevenom,PLA2,separation,biologicalactivity
目录
摘要I
AbstractIII
第1章绪论-1-
1.1蛇毒概述-1-
1.2蛇毒磷脂酶A2-1-
1.2.1蛇毒PLA2的理化性质-2-
1.2.2蛇毒PLA2的分类-2-
1.3蛇毒PLA2的结构与功能-3-
1.3.1蛇毒PLA2的结构特征-3-
1.3.2蛇毒PLA2的功能-4-
1.3.3结构与功能的关系-7-
1.4蛋白质的分离纯化-8-
1.4.1蛋白质的分离基质-8-
1.4.2生物大分子分离纯化模式-9-
1.4.3蛇毒PLA2分离方法进展-10-
1.5PLA2活性检测方法-15-
1.5.1体外检测方法-15-
1.5.2动物效应检测法-16-
1.6本文工作-17-
第2章中介蝮蛇毒磷脂酶A2的分离纯化-18-
2.1实验材料-18-
2.1.1蛇毒-18-
2.1.2实验试剂-18-
2.1.3实验仪器-18-
2.1.4实验动物-19-
2.1.5缓冲液与培养基-19-
2.2分离过程-19-
2.2.1凝胶过滤层析-19-
2.2.2十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)-21-
2.2.3阴离子交换层析-22-
2.2.4阳离子交换层析-22-
2.3实验结果-23-
2.3.1粗毒溶液浓度测定-23-
2.3.2凝胶过滤层析-23-
2.3.3HiTrapQ阴离子交换层析-25-
2.3.4HiTrapSP阳离子交换层析-26-
第3章中介蝮蛇毒磷脂酶A2生物学活性鉴定-29-
3.1引言-29-
3.2材料与方法-29-
3.2.1仪器-29-
3.2.2实验试剂-29-
3.2.3PLA2的酶活力检测-29-
3.2.4抑菌实验-30-
3.2.5溶血活性-30-
3.2.6PLA2对神经-肌肉接头的阻断作用-30-
3.3实验结果-32-
3.3.1PLA2的酶活力检测-32-
3.3.2抑菌试验-32-
3.3.3溶血活性-32-
3.3.4PLA2对神经肌肉接头的阻断作用-33-
第4章讨论-34-
4.1分离纯化-34-
4.2活性检测-35-
附录-38-
参考文献-41-
致谢-49-
攻读硕士期间研究成果-50-
第1章绪论
1.1蛇毒概述
蛇属于爬行纲有鳞目蛇亚目,全世界蛇类约有3000余种,其中毒蛇约650种,我国的毒蛇有50余种,主要分布在长江以南地区,其垂直分布从沿海到海拔1000m左右的平原、丘陵和低山区较多[1]。
蛇毒(Snakevenom)是由蛇毒腺分泌的一类用于捕食及防御的天然毒素蛋白[2],其主要毒性成分有蛇毒酶、神经毒素、心脏毒素、出血毒素和肌肉毒素等,具有多种生物学活性和药理作用[3],蛇毒的研究不仅有助于提高蛇咬伤治疗的水平,而且对探讨蛋白质的结构与功能的相互关系、探索蛋白质功能的进化、寻找新型药物等都有借鉴意义[4]。
1.2蛇毒磷脂酶A2
磷脂酶A2(phospholipaseA2,PLA2)是一类水溶性界面酶,可以特异性地水解磷脂中甘油分子sn-2位上的酰基,生成游离脂肪酸(freefattyacids,FFA)和溶血磷脂(Lysophospholipid)(图1-1)。
哺乳动物的诸多生物进程,如磷脂代谢、免疫防御和信号传导中,PLA2均发挥着重要的作用[5]。
磷脂酶A2存在于脊椎动物多种脏器(胰脏、胃、肠、脾、心、肝等),以及血细胞(多形核白细胞、巨噬细胞、红细胞、血小板)和精浆中[6-7],也存在于眼镜蛇科、海蛇科、蝰蛇科和响尾蛇科等毒蛇的毒液中。
蛇毒磷脂酶A2(SnakevenomPLA2,svPLA2),均为低分子量型(14-18KDa),绝大多数含有6-7对二硫键,稳定性高,具有广泛的生物/药理活性。
当svPLA2的一级结构有微小差异时,往往在功能上会表现出明显的分化,是研究蛋白结构与功能的绝佳材料[8-10],因此成为蛇毒研究领域的一个热点。
1-1磷脂酶A2水解卵磷脂反应
Fig.1-1HydrolysisofPLA2withphosphatidylcholine
1.2.1蛇毒PLA2的理化性质
虽然蛇毒磷脂酶A2的分子量比较小,但是含有较多的二硫键,所以这类毒素的理化性质比较稳定。
在酸、碱、变性剂的环境中都很稳定。
蛇毒磷脂酶A2的一个共同特点是易溶于水,发挥酶活性时需要Ca2+参与,绝大多数以Ca2+作为其活性所必备的辅基,因此只有与Ca2+结合构成全酶时才具有催化活性。
另外,研究发现Na+、K+、Mg2+、Mn2+和脱氧胆酸能够增强酶活性[11]。
1.2.2蛇毒PLA2的分类
目前所发现的PLA2可分为以下几类(见表1)[12]。
依据svPLA2一级结构和二硫键模式上的差异,svPLA2分为ⅠA(眼镜蛇
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