绵羊DGAT1基因部分片段的遗传多态性分析方法的建立毕业论文Word格式.docx
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(7)多功能水域恒温振荡器:
SHA-D型,江苏正基仪器有限公司
(8)旋涡混合仪:
XW-80A型,海门市其林具而仪器制造有限公司
(9)立式电热压力蒸汽灭菌锅:
LDZX-50KBS型,上海申安医疗器械厂
(10)制冰机:
SIM-F140型,SANYO公司
(11)超纯水设备:
Sartorius公司
(12)可调式微量移液器:
Thermo公司,编号和量程如下表:
表1试验所用的微量移液器
编号
ZX01518
ZX00732
ZX03315
ZX05185
量程(μL)
0.5-10
5-50
20-200
100-1000
2.3分子生物学与制图软件
(1)DNASTARLastergene(转换序列和查找序列)
(2)PrimerPremier5.0(引物设计)
(3)Oligo(验证引物合理性)
2.4主要试剂
(1)DNA提取试剂盒:
H.Q.&
.QDNA提取试剂盒,安徽优晶生物工程有限公司生产,组成Mu-PuDNA分离柱,2ml收集管,ZZ-I缓冲液,ZZ-II缓冲液,DNA洗涤缓冲液,DNA洗脱缓冲液,OB蛋白酶。
(2)PCR试剂盒:
Fermentas公司生产
试剂盒的组成:
25mmol/L10×
TaqBuffer,10mmol/LdNTP,5U/μLTaqPolymerase,25mmol/LMgCl2。
(3)其他试剂:
琼脂糖、鹏程生物批号:
Ameresco0425
600bpladderMaker、上海生工生物工程有限公司批号:
HF405
6×
loadingbuffer鹏程生物批号:
Ameresco0463、
Tris碱鹏程生物批号:
Ameresco0497、
过硫酸铵莱阳市双双化工有限公司批号:
2007.01.0924、
丙烯酰胺、西安化学试剂厂批号:
GBG75-52
去离子甲酰胺Bio.Basic.ing公司批号:
FDB0212-500ml、
硝酸银西安化学试剂厂批号:
GBG70-77、
无水碳酸钠天津正太龙化工有限公司批号:
070410、
无水乙醇烟台双双化工有限公司批号:
2008.3.28、
TE缓冲液上海生工生物工程有限公司批号:
SD106、
甲醛上海中秦化学试剂有限公司批号:
2007.4.3
硼酸天津巴斯夫化工有限公司批号:
06.11.08
3.实验设计与方法
3.1实验设计
本实验总体思路:
采样→进行DNA提取→对提取的DNA进行PCR→琼脂糖电泳检测扩增产物的特异性→PAGE检测样品基因的多态性
3.2试验方法
3.2.1基因组DNA的提取
本实验采用DNA提取试剂盒来提取基因组DNA,操作步骤按说明书进行。
(1)取1ml抗凝血,移入1.5ml离心管中,加入200μLZZ-I缓冲液。
(2)加入25μL20mg/ml的OB蛋白酶,漩涡混匀后,55℃温浴3h,每30min在旋涡混合仪上混匀一次。
(3)温浴3h后,104g/min离心1分,将上清液转移到1.5ml离心管中。
(4)在上清液中加入220μLZZ-II缓冲液,旋涡混合仪上混合均匀,70℃水浴10min。
(5)加入220μL无水乙醇,旋涡混合仪上混合均匀。
(6)所的样品转移至Mu-Pu柱上,将柱放入2ml收集管中,8000g/min离心1min。
弃去收集管中的液体。
(7)把柱子装到新的收集管中,吸取720μL用乙醇稀释过的DNA洗涤液于柱中,8000g/min离心1min,弃去收集管。
(8)把柱子装到新的收集管中,吸取720μL用乙醇稀释过的DNA洗涤液于柱中,8000g/min离心1min,弃去收集管。
(9)急速离心(104g/min以上)2min,甩干DNA。
(10)将柱子置于1.5ml离心管中,加入200μL70℃预热的DNA洗脱缓冲液,室温放置3min。
(11)8000g/min离心1min以从柱子上洗脱出DNA,收集管中的液体即为DNA溶解液。
(12)DNA的检测:
吸取5μL从柱子上洗脱出的DNA,与1μL6×
loadingBuffer混合好后,点样于1.0%的琼脂糖凝胶上,100V恒压电泳0.5-1h,电泳结束后于凝胶成像系统上观察条带,并判断所提取的基因组DNA能否用于PCR扩增反应。
3.2.2引物的设计与合成
引物根据GeneBank上发表的绵羊的DGAT1基因部分序列,利用DNASTAR软件转换成SEQ格式的文件,再用PrimerPremier5.0软件设计合理的引物,并经oligo软件和blast工具进行验证后,提交上海捷瑞生物工程公司合成引物。
(引物见附录)
3.2.3PCR扩增反应
1.PCR扩增反应体系
本实验采用25μLPCR反应体系,各组分体积、浓度如表2所示
表225μLPCR反应体系
PCR反应各组分
所用体积(μL)
终浓度
TaqBuffer
2.5
2.5mmol/L
0.5U/μLTaqDNAPolymerase
0.2
0.04U/L
2.5mmol/LMgCl2
2.0
0.2mmol/L
2.5m/LdNTPs
1mmol/L
DNA模板
1.5
0.05g/l
10μmol/L上游引物
1.0
0.4μmol/L
10μmol/L下游引物
超纯水
14.3
--
2.PCR扩增程序
本次采取普通PCR来扩增目的DNA,PCR扩增程序如下:
表3PCR扩增过程表
温度(℃)
时间(s)
过程
备注
95
5
预变性
94
45
变性
循环35次
61
60
退火
72
延伸
600
充分合成产物
4
7200
保存
如需立即实验,则不用此步
3.PCR扩增产物的检测
从每个反应管中分别取3μL扩增产物,与1.0μL6×
LoadingBuffer混匀,加样于1%的琼脂糖凝胶上,另加5μL600bpDNAMarker做参照。
100V电泳0.5h。
结束后,于凝胶成像系统上观察条带,特异性很好的PCR产物方可用于PCR-SSCP检测,无条带或是非特异性条带产物出现的产物都不能用于PCR-SSCP。
3.2.5PCR-SSCP检测(聚丙烯酰胺凝胶电泳)
3.2.5.1电泳装置的准备
在方盒中装上水,并加入一定量的洗涤剂,再将所用的玻璃板放入,浸泡0.5-1h,之后用软毛刷将其表面的污渍去除干净,再用自来水冲至无泡沫,用蒸馏水冲洗3-5次,再用75%的酒精擦拭使用面(也可全擦),待干燥后将垫条夹在玻璃板中间,外面用透明的胶布粘贴(每个面上卷回0.8cm即可),再用夹子固定于胶版架上,防止倒胶时外漏。
3.2.5.2聚丙烯酰胺的制备
1凝胶贮存液的制备
(1)超纯水:
用超纯水设备制备电阻率超过10MΩ·
cm-3超纯水100ml,存放于4℃,备用。
(2)30%丙烯酰胺贮存液:
称取29g丙烯酰胺和1g甲叉双丙烯酰胺溶于60ml上述的水中(必要时加热至37℃),再定容至100ml,存放于4℃,备用。
(3)10%过硫酸铵称取3g过硫酸铵(A.R.)溶于30ml水中,存放于4℃,备用。
(4)TEMED(四甲基乙二胺)新买来的TEMED,需分装成小包装使用,一般分成2ml/份。
(5)5×
TBE称取54gTris,3.72gNa2EDTA·
2H2O,27.5g硼酸(H3BO3),混合加入1L的烧杯内,并加入800ml的去离子水,充分搅拌至完全溶解,再加水定容至1L,室温存放。
2.PAG凝胶的制作
本实验采用8%的凝胶电泳,具体配方见下表[10]:
表48%的PAGE配方表
15
20
25
30
40
50
80
作用
7.9
10.5
13.2
15.8
21.1
26.4
42.2
稀释
30%丙烯酰胺贮存液
5.3
6.7
8.0
10.6
13.3
21.3
凝胶的成分
5×
TBE
3.0
4.0
5.0
6.0
10.0
16.0
加大离子强度
10%过硫酸铵
0.11
0.14
0.18
0.21
0.28
0.35
0.56
引发剂
TEMED
0.010
0.013
0.016
0.020
0.026
0.033
0.052
加速剂
3.聚丙烯酰胺凝胶的灌制
(1)将夹住的玻璃板于桌面呈70°
放置,将混匀的凝胶液缓慢倒入两块玻璃板中间,直至灌满,注意此操作不可产生气泡。
(2)灌好后立即插入梳子,梳子底端不要产生气泡,须仔细观察
(3)在室温下聚合约30-40min,梳子底端的凝胶出现折射率不同的线,表明凝胶聚合完成,拔去梳子。
(4)立即用电泳缓冲液冲洗加样孔,冲走多余的未聚合的凝胶。
(5)拆除胶带和垫条将加样孔朝向电泳缓冲液的槽放置,并用夹子固定。
(6)在上下两槽中倒入1×
TBE缓冲液,并检查上槽是否漏液。
(7)将电泳槽的盖子盖上,并查到电泳仪上,开始预电泳,电压150V,时间:
半小时。
3.2.5.3PCR产物的处理
在PCR管内加入4μL去离子甲酰胺和1.5μL6×
loadingBuf
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