一种简单有效的去除植物DNA中多糖等杂质的方法图文文档格式.docx
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[J]・西北植物学报,2007,27(3:
616—619・
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蔷至物学实验手册[M].上海:
上海科学技术出版社,
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菌初步研究[J].塔里木大学学报,2007,19(2:
49—52.
技术与方法
TECHNIQUEANDMETHODS
一种简单有效的去除植物DNA中多糖等杂质的方法
郭大龙,昊正景
(河南科技大学林学院,河南洛阳471003
摘要:
目的:
寻找一种经济、快速、简便的去除多糖等杂质并获得高质量DNA的、适于不同植物而又便于一般实验室操作的基因组DNA提取方法。
方法:
使用lm01]LNacl溶液溶解常规方法提取的DNA,离心后弃沉淀,从而使多糖等杂质去除。
结果:
提
取DNA纯化之后经电泳检测以及0耽。
和0如。
比值的测定,限制性内切酶反应,PCR扩增的结果表明.基因组DNA条带清晰,
亮度均一,DNA片段大小一致,无降解弥散,用改进方法提取的DNA,无论在纯度上还是在完整性上都比用常规方法要好。
结论:
该方法能较好的去除DNA中色素、多糖等干扰物质。
关键词:
DNA提取;
NaCI;
多糖
中图分类号:
¥663.1
文献标识码:
A
文章编号:
1004—31lX(2f10805—0031—03
An
Efficient
andSimple
MethodRemoving
theImpurityinDNAExtraction
GU0Da—long‘,WUZheng—jing
(College
of
Forestry,HermnUniversityofScience蛐dTechnology.I
J叩ng471003.mm
Allmraet:
Objective:
Toexplore
themethodforextractionofhighqualityDNA.Method:
theconventionalCTABmethodhadbeenilI甲删,ie.
after瓢‰all
213volumeofice—coldisopropanoltoce咖fhge
DNA,thepelletwasredissolvedin1moYLNaCl,then
cEmtrj蜊to
discard
the
万方数据
32生物技术2008年18(5
pellet.Thesupematant惴transferedandprecipitatedtheDNAbyaddingtwovolumeof100%ethan01.Result:
Thepigments。
polysaccharides,substanceinterferingthegenomicDNAextractionanddisturbingPCRwerepreservedinpelletandeliminatedfromthesupernatanttIlroughthisway.Conclusion:
Themethodcouldrenlovepolysaccharideeffectively,theycouldmeetexperimentrequirementperfectly.
Keywords:
DNAextraction;
impurity;
polysaccharides;
NaCI
得到高质量的DNA是分子生物学实验关键的第一步,植物材料中大都含有种类繁多的次生物质,获得的DNA溶液常常黏度大乃至呈胶状,是植物DNA提取中最常见现象,主要原因是多糖、酚类在提取过程中与DNA共沉淀,形成包裹DNA的黏稠胶状物,难以溶解或产生褐变,使得DNA提取质量较低,提取液往往含有多糖、色素等物质,如清除不净则无法用于后续研究㈨J。
所以,如何高效简便地去除多糖、多酚等次生物质,对提取纯化植物DNA来说至关重要。
作者随机选取了4种园艺植物,采用优化的CTAB法提取基因组DNA,寻找一种经济、快速、简便的去除多糖等杂质并获得高质量DNA的、适于不同植物而又便于一般实验室操作的基因组DNA提取方法。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1实验材料
以牡丹(Paeonia.suffruticnsaAndrews.、扁豆(1ablabpurpu.删(1lma.Sweet、苦瓜(MomordicacharantialL.、葡萄(VitisviniferaL.叶片为材料,用dH20清洗除去表面污物,用滤纸吸干表面残留水分,标记分装,置一20℃冰箱冷冻保存备用。
1.1.2试剂
CTAB、PVP、B一巯基乙醇、Tris-HCI、EDTA、NaCI、氯仿,异戊醇(24:
1、异丙醇、聚乙烯吡略烷酮PVP、无水乙醇等均为分析纯,购自上海生物工程有限公司(S扑gon公司;
DNAMarker、入一H/ridHIdigest、raq酶、dNTP.s购自大连宝生物工程有限公司(TaKaRa公司。
琼脂糖购自北京华美公司。
1.1.3仪器
ThermoeyclerPCR仪,德国Biometra公司生产;
Sigma3K18冷冻离心机;
BackmanDU800分光光度计;
DYY一Ⅲ型电泳仪。
北京六一仪器厂;
硒型凝胶成像仪,英国UVP公司。
1.2方法
1.2.1改良CrAB法的操作步骤
参照JosephSambrook等一的方法并作适当改良,进行基因组DNA的提取。
准备:
将CrAB提取缓冲液(100mmol/Lriffs・HCl,pH8.0,1.4mmol/LNaCl,20mmol/LEDTA,3%CTAB,2%PVP,8一巯基乙醇使用时加入预热。
研磨:
取叶片0.5~lg,置于研钵,加人液氮,研磨成粉末;
迅速转入1.5mL离心管中。
裂解:
加入预热的CTAB提取缓冲液,充分混匀,65℃水浴60min,期间不时小心摇动离心管。
抽提:
冷却至室温后离心(8000drainlOmin,取上清液置于1.5mL离心管中,加入等体积氯仿:
异戊醇(24:
1抽提2次,至有机相与水相交界处白色杂质消失。
离心(8000r/rain10rain,取上清液。
沉淀:
将上清液转入另~离心管,加入2/3倍体积的异丙醇,小心混匀,挑出DNA。
离析:
加入适量lmol/LNaCI,必要时可65℃助溶,然后离心,取上清。
将上清液转入另一离心管,加入2倍体积的无水乙醇,轻轻旋转试管,一20℃沉淀过夜。
收稿日期:
2008—01—18;
修回日期:
20嘴~02—2l
基金项目:
河南科技大学人才科学研究基金项目资助(09001168;
河南科技大学校基金项目(2007QN014资助
作者简介:
郭大龙(1978一,男,副教授,从事园艺植物种质资源研究。
Email:
guodalong@mail.haust.edu.∞。
洗涤:
离心,沉淀用70%乙醇洗涤,将DNA风干。
溶解:
用‘rE溶解DNA,然后加入5山RNA酶(5metaL,37℃水浴2h,重复抽提和沉淀步骤一次。
将DNA样分装,一20℃保存,用于近期研究。
1.2.2DNA纯度检测
将提取DNA样液按一定倍数稀释后,用紫外分光光度计测定0‰值、0%值,按照1个0‰值相当于50吲山和稀释倍数来换算DNA的浓度,并计算DNA的产率,用0D知/0D细的比值表示DNA样品的纯度,最后将DNA样液稀释,DNA琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,凝胶成像系统观察和拍照,检测DNA的完整性。
1.2.3限制性内切酶分析:
在20ta反应体积中,DNA样品5pg。
限制性内切酶H/ndm10U,在37。
C水浴过夜。
1.2.4PCR扩增
SRAP扩增参照郭大龙和罗正荣【41的方法,所用引物为Me25’一TGAGTCCAAACCGGAGC一3’:
Em357一GACTCCCTACGAATI℃AC一3’。
2结果与分析
2.1DNA紫外和电泳检测’
样品DNA的‰/A瑚值均高于1.8,说明该方法提取的DNA具有较高的纯度。
各基因组DNA经电泳后图谱如图1所示。
由电泳图谱可以看出,改良CrAB法提取的不同种基因组DNA条带清晰,亮度均一,DNA片段大小较一致,无降解弥散,说明提取的DNA纯度高、完整性好。
使用上述改进的DNA分离技术,可有效地除去细胞内的杂质.防止多酚的氧化,所得到的DNA无色透明,而对照方法所得到的DNA为黄褐至深褐色。
电泳分析表明,无论从完整性和纯度上来看,用改进后的方法提取的DNA完全符合分子生物学操作要求。
图1基因组IJ、A凝胶电泳图
M:
D[2000marker;
1,2,3。
4为牡丹、葡萄、扁豆、苦瓜。
Fig.1A乎Imsegeleletw44aoresis
genomicDNA
1,2,3,4representfor慨peony,grape,purpleharicot.bittermelon.
2.2DNA的酶切和SRAP~PcR检测
从酶切的结果来看(图2,改进方法所得的DNA能被内切酶所彻底消化,而常规方法所得的DNA均不能被内切酶酶切。
SRAP—PCR扩增的结果间样说明以上改进方法所得的DNA作模板可以得到清晰整齐的条带(图3。
3讨论
有关植物基因组DNA提取针对不同试材特点及试验要求进行方法改良的报道很多^,且各有所侧重。
GaliceH孥“采用了一种从干的褐藻组织中提取并纯化DNA的有效方法。
但
是需要特殊的设备。
利用CTAB法对不同种的基因组DNA进
2008年18(5生物技术
围2基因组I-、A的限制性内切酶的酶切图谱
lVI:
DL2000marker;
1,2,3.4为牡丹、葡萄、扁豆、苦瓜。
Fig.2
Analysis
digested
DNAfromdifferent
pla
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