梯度峰鬼峰形成原因Word下载.docx
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关键词:
梯度高效液相色谱法;
鬼峰;
系统峰;
色谱基线;
水,甲醇,乙腈溶剂;
反式脂肪酸;
文物
目录:
(省略)
1.介绍
在高度监管的制药行业“控制”是基本的生产和分析的所有方面。
梯度反相高效液相色谱法能使分析物混合体的分析在单次运行过程中拥有广泛的极性和保留的特点,对于许多应用来说,这种方法比等度方法有显著优势。
不过,梯度高效液相色谱法有时会受到看似随意的和无法控制的“鬼峰”问题困扰,尤其是在现有的设备和材料的质量不好时,或者是分析师没有意识到所涉及的敏感机制。
当鬼峰突然出现在梯度反相高效液相色谱时,分析师可能会觉得分析不受控制,并可能诉诸最终更耗时和昂贵的、效率较低的等度方法。
但是,如果有人明白鬼峰的起源,以及知道如何应对,那么梯度反相高效液相色谱法可以稳定、可靠的运行。
在以前的文献中使用的术语包括鬼峰,人工峰(和假峰)[1],系统峰[2],伪峰[3],空置峰[4],艾根峰[2,5],诱发峰[6]和寄生峰[7]等。
由于缺乏共同术语,使得研究问题变得困难[1],现在,“鬼峰”是较为常出现的术语[1,4,8–11],本文将全文应用该术语。
为什么梯度反相高效液相色谱法能观察到鬼峰也许有很多可能的原因,但鬼峰的出现几乎总是只有一个共同的机制。
这就是在流动相中紫外线吸收的有机杂质聚焦于液相柱的组成带。
稍后当流动相具有较高洗脱强度时就开始进行梯度洗脱,这些流动相杂质的潜在“源”是广泛的。
引起“鬼峰”的其他原因包括流动相传递的物理或机械方面原因、进样和固定相的影响。
色谱图可能包含众多来源的鬼峰,这可以使全面解决鬼峰的问题变得相当困难。
在以下的讨论中,将在鬼峰识别和整治的问题上讨论关于杂质机制更多的细节和一些新的、以前公认的原因。
2.实验
2.1测试设备
在这项工作中使用三种不同的高效液相色谱系统,具体情况在文本中有具体描述。
图2,5,7,9和12是使用液相2695色谱仪和沃特世公司的液相2487(米尔福德,马萨诸塞州)的可变波长检测器获得的。
图3,8,11及13是使用安捷伦科技公司(特拉华州威尔明顿)HP1100的脱气(G1322A)、四元泵(G1311A)、自动进样器(G1313A)和VWD检测器(G1314A)组成的系统获得的。
图4使用类似的系统,但用的是二元泵,而不是四元泵(G1312A)。
图10是使用一个2795液相和液相996探测器获得的,而精确质量的测量是用联机一个微团的液相色谱飞行时间质谱仪(LC–TOF)在+ESI模式下运行的,使用以下设置:
毛细管电压=3000V,锥孔电压=25V,脱溶剂温度=250◦C,源温度=120◦C气体流量(N2);
锥=45升/小时,脱溶剂=356升/小时。
紫外光谱是使用Unicam有限公司(英国剑桥)具备1厘米石英样品池和一个空引用单元格的UV2-300紫外-可见光谱仪获得的。
ZORBAX高效液相色谱柱是由安捷伦科技公司(特拉华州威尔明顿)提供,源柱头是由琼斯色谱有限公司(Hengoed英国)提供的,Hichrom柱是由Hichrom有限公司(英国雷丁)提供。
2.2材料
水分析是使用由威立雅水务系统有限公司(海维康,雄鹿队,英国)提供的英国ELGA超纯水机和Maxima设备进行纯化的。
甲醇,乙腈和四氢呋喃是通过各种未公开的英国供应商获得的。
甲酸(98/100%)是由Fisher科技(拉夫堡大学,英国)提供的。
三氟乙酸(99%的档次和分光级)和邻苯二甲酸二辛酯99%(二(2-乙基己基)邻苯二甲酸)则是由Sigma-Aldrich公司(吉林汉姆,赛特,英国)提供的。
3.结果与讨论
3.1流动相污染和带紧缩机制
所有色谱纵向扩散以增加分离组件的带宽。
在等度高效液相色谱中试图洗脱组件之前,纵向扩散变得难以管理、峰也过于宽泛。
在梯度洗脱色谱法,是一个动态的聚焦机制(带/峰值压缩),可以动态压缩组件带。
在梯度高效液相色谱运行中观察到的峰宽是同步扩散和聚焦过程的产品。
在一个线性溶剂梯度中,峰宽在整个运行过程中应该是恒定的[12]。
聚焦机制可合理化如下:
想象一个组件带在高效液相色谱柱头广泛扩散。
当溶剂梯度被应用于有机溶剂的浓缩时,在组件带后面的总是高于在组件带前面的。
因此,在带前面的组件分子固定相的保留比在后面的更强。
这样,在组件带后面的组件分子总是移动,任何落后的分子将迅速被强洗脱液挑出,并迅速地追赶上其他因子。
假设柱足够长,坡度足够陡峭,峰聚集(或压缩)到达扩散和聚焦过程的平衡点决定最终峰宽度,图1,使用较小直径的球形颗粒使纵向扩散最小化,例如,使用3微米而不是5微米的二氧化硅。
带压缩机制是通过增加梯度陡度来实现最大化的。
图1示意图显示通过增加洗脱强度的溶剂梯度来压缩组件带。
甲醇的%数值是任意值以说明不论其在柱的位置如何,高甲醇的浓缩始终在组件带之后。
带压缩机制可能同样聚焦在流动相中存在的有机杂质。
杂质显示一些保留物在低洗脱液强度下因为梯度的进展可能会集中成峰。
如同用于环境分析的“跟踪浓缩”机制,将农药及有机残留物装于有大量水样的柱中,然后用聚焦溶剂梯度洗脱[13]。
经过充分的聚焦,流动相鬼峰的出现与注入的待测峰相同,但是,其聚焦是不完整的,他们可能会更广泛,或拥有一个非典型形状。
图2显示了聚焦机制,观察杂质在流动相1毫微克/毫升水平左右的一个空白的梯度运行。
虽然邻苯二甲酸二辛酯的鬼峰较小,但它仍可能在药物分析中干扰低层次有机杂质的定量。
图2洗脱液色谱添加邻苯二甲酸二辛酯(DOP),柱型:
ZORBAXXDB-C8,150毫米×
4.6毫米,5微米;
温度:
40◦C,1.5mL/min,λ=265nm处。
洗脱液A:
水+1毫微克/毫升DOP(邻苯二甲酸二2-乙基己);
洗脱液B:
乙腈。
时间表(分钟,%B级):
(0,20),(15,95),(17,95),(17.1,20),(22,20)。
理想的梯度高效液相色谱流动相到达柱的顶部应只包含预期的溶剂和试剂,绝对没有别的。
梯度高效液相色谱法不仅只有对样品的分析,也分析仪器流动相和溶剂途径的杂质。
为了真正从这些系统(或鬼)峰区分出待测峰,空白注射的检查是必不可少的。
3.1.1水
梯度高效液相色谱法中使用的水必须尽可能的纯净、新鲜。
理想情况下,它应该没有痕量有机物、无机物和微粒。
幸运的是,对忙碌的医药分析师来说,商用设备可提供实验室的对水的需求,这样水的问题就不应该是值得关注的问题,但是,要获得良好饿结果,这些净化系统就必须被安装并维持较高的标准。
Milli-Q和ELGAMaxima公司就可以提供拥有这种质量标准的典型系统。
这些系统的重要组成部分首先包括大量的活性炭和5微米预过滤器(去除颗粒和低于微克/毫升水平的低含量氯),一个反渗透装置(除去大部分离子物种)和紫外线光氧化装置以杀死细菌和氧化有机物种[11,14]。
离子交换和碳吸附介质用于进一步降低无机和有机的内容,超微滤过装置(ElgaMaxima的为0.05微米)用于最终消除细菌和微粒。
该系统应定期的进行消毒,并更换易损件。
间歇性的回收也应在系统中被执行以定期重新净化水。
还有许多其他可能的方法生产纯净水,但很少有以上所述的实用或有效的商用系统。
几位作者因为成本和效率的原因不重视蒸馏[14-18],将许多低分子量的有机化合物保留在蒸馏过程中。
国产品尝试用反相杂质吸附来净化经常失败,因为所使用的净化媒体比水本身更加含有杂质[19,20]。
此外,吸附系统可能需要太多的维护以便能长期运行,杂质的突破总是时有发生[18]。
迄今为止最实用建议已被Ringo所描述[21],他建议使用一次性聚苯乙烯二乙烯基苯在标准溶剂过滤装置中提取磁盘。
这些磁盘从水和水缓冲溶液中吸收疏水紫外线活性有机物。
这些一次性磁盘的大小和格式意味着他们可以轻松被更换,或用干净的有机溶剂再生。
McCown等人[18]曾报道用氦气(48小时)或长时间煮沸(3小时)以连续脱气,显著减少低沸点杂质的量,但这些对许多用户来说是不切实际的程序,而且这两种方法不能去除高沸点杂质。
一些与高效液相色谱流动相一致的净化系统已被证明能有效地运行,但这些通常必须使用二元泵系统和线开关阀,使之能够反冲洗滤料[22,23]。
图3比较清洁和污染了的顺序等度步色谱。
柱型:
源柱C18,150毫米×
4.6毫米,4微米,温度:
25◦C,1.5mL/min,λ=235nm处。
750甲醇,250水;
900甲醇,100水。
时间表(最小值,%B级):
(0,0),(45,0),(46,100),(60,100),(60.1,0),(70,0)。
图3演示了梯度高效液相色谱系统对水质的敏感性。
较低的轨迹,代表了医药相关物质的方法,用75%甲醇“连续梯度等度步”,加强了45分钟后,以90%甲醇。
上跟踪相同的方法,表现出严重的梯度鬼峰呈现分析无用。
这些污染物开始打破,通过对等度第一期结束,终于洗洗脱液强度增大。
这个总系统污染的原因是没有充分的证实,但强烈怀疑是由于一个被忽视和细菌感染的水净化系统。
非常广阔的杂质保留的范围是各种细菌污染所产生的材料相关。
当细菌被摧毁了他们的聚合物的分泌物和lipopolysaccaride细胞碎片仍然[24],这可能包括极地,不容易吸附方法去除的物质[11]。
一个“生物膜”的细菌可能会形成仪器和油管内,如果长时间持续高水溶剂。
色谱溶剂入口过滤器应定期更换或彻底清洗这些高表面积,使得细菌的“迷路的避风港”。
高水溶剂生产线,用纯甲醇或乙腈的定期冲洗,将有助于限制微生物的生长,并进一步用二氯甲烷冲洗,将完全删除任何系统的脂质和油脂。
碰到的主要生物是革兰氏阴性菌(如假单胞菌),它可以在纯净水生活和成长[25]和蓬勃发展feedant材料,如磷酸盐或醋酸的存在。
他们在20-35℃迅速成长,并在短短数天就可以在高效液相色谱洗脱出检测到。
低温储藏显著降低了增长,但它通常不会实际冷藏高效液相色谱洗脱液。
贝里[11]表明,甚至pH值9的缓冲区,来防止增长是不够的。
我们自己的微生物学家建议使用至少15%甲醇的混合物,以抑制细菌的生长和他人推荐使用至少5%的乙腈[26]。
贝里已提到0.04%(W/V)之间的使用[11]和0.00004%(W/V)[27]叠氮化钠作为抗菌剂在水溶液中的缓冲区,虽然股票的解决方案往往分解杜兰描述的0.004%(W/V)(0.4克溶于10L水中)的准备工作,为有效地利用检测波长为210nm[28]。
一些细菌对二氧化氯产生耐药性,季铵化合物和0.25%乙酸[25]。
通常情况下,他们能适应恶劣的条件下,使流动相玻璃器皿应定期用有机溶剂清洗,并完全干涸,而不是常规的“突破”洗脱液。
其他细菌鬼峰问题的零星的例子包括一个内部的情况下,HPLC泵“的印章洗”的解决方案中的细菌增长。
随后有机质含量50:
50乙腈:
水密封洗涤液减少了蒸发和细菌的生长。
更换“略微浑浊”的印章洗与一个新的混合物解决方案完全从色谱鬼峰。
此外,尽管它可能是诱人的,应该从来不使用实验室洗涤瓶来弥补高效液相色谱洗脱液的体积水。
这水不仅会从洗瓶塑料提取物饱和,但也可能与微生物的生命的蓬勃。
3.1.2.在水中的无机杂质
现代反相H
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