核转录因子E2相关因子2和Keap1的分子结构和功能及其信号通路调控分子机制研究进展Word文档格式.docx
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Nrf2/ARE信号通路本身也受到机体的严密调控,该调控网络的异常会导致多种疾病的发生。
本文综述其研究进展,以阐明Nrf2/ARE信号通路调控的分子机制。
1Nrf2的结构和功能
Nrf2分子质量为66ku,具有碱性亮氨酸拉链结构(basicleucinezipper,bZIP),是CNC(cap‘n’collar)转录因子家族中的重要成员,且转录活性最强[2]。
1994年,Moi等[5]首先发现并克隆出Nrf2蛋白,由于Nrf2蛋白可结合到转录因子AP-1和NF-E2结合的共有序列上,故得名。
除Nrf2外,CNC家族还包括P53,P45,Nrf1,Nrf3,Bach1和Bach2[6-7]。
Nrf2蛋白广泛表达于肝、肾、心、肺、神经组织、消化道上皮等多种组织细胞,由7个结构域组成,分别为Neh1~Neh7[8]。
Neh1包含1个CNC-bZIP结构,该结构可与Maf蛋白结合形成异二聚体并与DNA上的ARE结合[9]。
Neh2包含DLG和ETGE模体(motif),可招募Kelch样环氧氯丙烷(ECH)相关蛋白-1(Kelch-likeECH-associatedprotein1,Keap1)[10],从而负调控Nrf2的转录活性。
Neh2突变可使Nrf2失去与Keap1的结合能力,导致Nrf2的持续活化[11]。
Nrf2羧基端的Neh3可招募色素-ATP酶/螺旋酶DNA结合蛋白6,是Nrf2的反式激活结构域[12]。
Neh4和Neh5也是Nrf2的反式激活结构域。
Nrf2与Maf蛋白结合形成的二聚体即使与ARE结合也不能独立地激活靶基因的转录,尚需通过Neh4和Neh5与其他转录辅助因子(如CREB结合蛋白、受体相关辅助激活因子)结合才能启动靶基因的转录[13]。
Neh6包含DSGIS和DSAPGS模体,可借助DSGIS和DSAPGS与二聚体β转导子重复包含蛋白结合从而负调控Nrf2的转录活性[14-16]。
Neh7介导Nrf2与视黄酸X受体的物理性结合,这种结合可抑制Nrf2的转录活性[17]。
2Keap1的结构与功能
Keap1因与果蝇肌动蛋白结合蛋白Kelch相似而得名[18]。
是位于细胞质中的Nrf2的负调控蛋白,可与Nrf2和细胞骨架蛋白(肌动蛋白)结合,将Nrf2定位于细胞质而无法进入细胞核发挥其转录活性。
Keap1包含624个氨基酸残基,具有5个结构域:
NTR,BTB,IVR,DGR和CTR[8]。
DGR可与Nrf2的Neh1结合,也可与肌动蛋白结合[19]。
BTB可介导Keap1形成同二聚体,BTB的第104位氨基酸高度保守,该氨基酸的突变可使Keap1无法形成二聚体。
IVR结构域富含半胱氨酸,是氧化剂和亲电子剂的感受区。
当细胞内氧化水平异常升高或细胞暴露于亲电子剂时,IVR结构域的半胱氨酸残基(Cys226,Cys273和Cys288)可与氧化剂或亲电子剂反应,导致Keap1构象的改变,与Nrf2分离,后者则进入细胞核内,启动抗氧化基因或解毒酶基因的转录。
除了IVR结构域具有氧化剂和亲电子剂感受性外,BTB结构域的Cys151,DGR结构域的Cys434和CTR结构域的Cys613也可感受细胞内的氧化应激水平[20-24]。
例如,当暴露于气态递质(gasotransmitter)硫化氢时,Cys226可与Cys613形成二硫键,从而使Keap1构象发生改变[25]。
3Nrf2活性调控的分子机制
3.1蛋白质水平的活性调控
目前,多数观点认为细胞对Nrf2活性的调控主要发生在蛋白质稳定性水平。
细胞在基础状态下即有足量Nrf2表达,此时大部分Nrf2被Keap1介导的泛素化降解途径所降解;
氧化应激时,Keap1构象改变,失去对Nrf2的降解作用,Nrf2由细胞质进入细胞核,发挥转录活性。
此外,氧化应激和化学应激也可激活某些蛋白激酶,使Nrf2发生磷酸化而活化。
3.1.1Keap1抑制Nrf2活性
Keap1是Nrf2活性调节的分子开关。
生理状态下,Keap1可通过C端的Kelch重复结构域与Nrf2N端的Neh2结构域结合,将Nrf2锚定在微丝上,并可介导Nrf2的泛素化降解。
Keap1的N端具有BTB结构域,与其他具有BTB结构域的蛋白一样是滞蛋白(cullin)依赖性泛素连接酶E3的作用底物,可介导Nrf2的泛素化,并最终为26S蛋白酶体所降解。
这个过程中Keap1起了连接Nrf2和Cul3-Rbx1-E3泛素连接酶复合体的作用[26]。
综上,生理状态下Keap1通过将Nrf2锚定在细胞质中及介导Nrf2的泛素化降解抑制Nrf2活性的。
当细胞内氧化物或自由基增多时,或细胞暴露于亲电子物质时,Keap1上的敏感氨基酸残基(主要是半胱氨酸残基)可与氧化剂、自由基或亲电子剂反应,进而导致Keap1构象改变,失去与Nrf2的结合能力,后者则可游离并在Nrf2的Neh1结构域核转位信号的指导下由胞质进入胞核,在细胞核内不断蓄积并启动靶基因的转录。
关于Keap1和Nrf2的相互作用,目前提出了一个“铰链与门闩”或两位点底物识别的模型(hingeandlatch或two-sitesubstraterecognitionmodel)[27]。
该模型认为Keap1同二聚体的Kelch结构域可与Nrf2的Neh2结构域N端的DLG模体和ETGE模体结合。
Keap1与DLG的结合是弱结合(门闩),与ETGE的结合是强结合(铰链),铰链的强度是门闩的100倍[28]。
每2个Keap1可结合1个Nrf2上的DLG和ETGE模体,这种结合可使位于这两种模体之间的可接受泛素的7个氨基酸残基排列成合适的构象,以利于泛素的连接[29]。
当处于氧化或化学应激时,Keap1上的敏感氨基酸残基发生反应,导致Keap1构象改变,破坏了Kelch与DLG的弱结合(门闩破坏),但是Kelch与ETGE的强结合不受影响(铰链保留)。
此时,Nrf2依然与Keap1结合,但是Nrf2的泛素化明显减弱,结果导致Keap1被Nrf2饱和,新生成的Nrf2不断地自胞质进入胞核,启动靶基因的转录。
值得注意的是,当Nrf2表达增加时,Nrf2本身可诱导Keap1的表达。
显然这是Nrf2的一种负反馈调节机制,可能会防止Nrf2/ARE通路的过度活化或者有利于该通路的及时终止。
3.1.2蛋白激酶激活Nrf2的活性
除了Keap1,多种蛋白激酶对Nrf2的磷酸化也可实现对Nrf2活性的快速调节。
有研究指出,当细胞内ROS产生时可激活某些蛋白激酶,后者可直接作用于Nrf2,促使其发生磷酸化修饰和构象改变,进而与Keap1分离,进入细胞核内发挥转录活性。
一种典型的使Nrf2发生磷酸化激活的物质是冈田酸,它是一种高效的蛋白磷酸酶抑制剂,可高效地促使细胞内蛋白质发生磷酸化。
冈田酸处理HepG2细胞能促进Nrf2的核蓄积和含ARE转基因的转录[30]。
蛋白激酶C(proteinkinaseC,PKC)、细胞外信号调节激酶、PKR样内质网激酶、PI3K和MAPK等均可使Nrf2发生磷酸化激活。
目前研究比较清楚的是PKC可使位于Nrf2的Neh2结构域上的Ser40发生磷酸化,导致Nrf2与Keap1的解离[31]。
已经证明Ser40是PKC的作用靶点,因为用Ala40置换Ser40后,PKC对Nrf2的激活作用明显减弱[32]。
但如以Glu40代替Ser40,即使没有PKC,也会出现Nrf2磷酸化的系列表现,Nrf2在细胞核内大量蓄积[33]。
但并非所有的蛋白激酶对于Nrf2的磷酸化都是产生激活效应的,这可能与磷酸化位点的不同有关。
酪氨酸蛋白激酶Fyn可使Nrf2的Tyr568发生磷酸化,进而促使Nrf2从细胞核移出[34]。
因此,不同蛋白激酶对Nrf2不同位点氨基酸残基的磷酸化修饰可能导致Nrf2的激活或抑制,充当了Nrf2活性的分子开关。
值得指出的是,各种蛋白激酶对Nrf2活性的调节只是一种“微调”,因为当敲除Keap1基因或使用siRNA技术沉默Keap1时,Nrf2和下游靶基因处于持续的活化状态,此时蛋白激酶诱导剂刺激Nrf2活化的作用并不能显现出来。
这说明Keap1对Nrf2活性的调节可能是一种最为重要的总体调节,而蛋白激酶对Nrf2活性的调节可能只是一种精细的微调[35]。
3.1.3其他蛋白质因子对Nrf2活性的调控
细胞对Nrf2活性调节最主要的方式是Keap1的抑制和蛋白激酶的活化作用,此外还有许多蛋白因子可影响Nrf2的活性。
Bach1与Nrf2一样也属于CNC-bZIP转录因子家族,广泛表达于各种组织细胞。
Bach1也可与Maf蛋白结合,Bach1-Maf蛋白复合物也可识别并结合ARE,但却不能启动ARE下游基因的转录,从而竞争性地抑制Nrf2与Maf蛋白的结合及Nrf2-Maf复合物与ARE结合,最终抑制ARE靶基因的转录。
当细胞处于氧化应激状态时,Bach1基于某种未知的机制,与Maf蛋白解离并移出胞核降解。
此时Nrf2与Keap1解离,移入胞核,并与Maf蛋白形成复合物,与靶基因上游的ARE结合启动靶基因的转录。
现在已经知道,Bach1可与Nrf2靶基因之一的血红素加氧酶1基因的ARE结合,抑制人类和小鼠的血红素加氧酶1基因转录[36]。
还有研究指出Nrf2对血红素加氧酶1的转录启动作用是以Bach1的出核降解为前提的[37]。
当进入细胞核内的Nrf2增多时,可诱导Bach1的重新合成和入核,进而抑制Nrf2的活性[36]。
显然,Nrf2的这种负反馈调节作用有利于Nrf2/ARE信号通路的及时终止和避免Nrf2活性的剧烈波动。
Chen等[38]发现P21蛋白可通过其KRR模体直接与Nrf2的DLG模体和ETGE模体相互作用,增加Nrf2蛋白的稳定性;
由于可与Keap1竞争性地结合Nrf2,因而还可减少Keap1介导的Nrf2泛素化降解。
事实上,细胞内还具有许多蛋白质因子(P62/SQSTM1,二肽基肽酶3/DPP3等)可通过竞争性地结合Keap1而使Nrf2活化,这可能是基础状态下Nrf2/ARE信号通路仍然具有部分活性的原因。
3.2Nrf2活性调控的表观遗传学机制
Nrf2活性调控主要发生在蛋白质水平,但是近年来发现Nrf2的表观遗传学调控也可能具有重要意义。
尽管Nrf2广泛表达于多种组织细胞,但不同类型细胞的Nrf2mRNA表达水平却相差很大[39],造成这种差异的原因尚不清楚。
但在前列腺肿瘤发生过程中,发现Nrf2的表达量显著降低,这是因为在Nrf2的启动子区域具有5个CpG序列,这些CpG序列发生了高度的甲基化[40]。
由此可推测,不同类型正常细胞的Nrf2表达差异也可能与表观遗传学调控有关。
目前关于Nrf2表观遗传学调控的研究并不多,这里主要介绍Nrf2启动子多态性和miRNA对Nrf2表达水平的调节及机制。
3.2.1Nrf2启动子多态性对Nrf2表达的影响
研究发现,小鼠Nrf2基因启动子区域的单核苷酸多态性可影响Nrf2基因的表达,该多态性位点位于转录起始点上游-336bp的位置,与不同品系小鼠对急性肺损伤的易感性差异有关[41]。
值得注意的是,在人类NRF2基因启动子区域也发现了一个单核苷酸多态性调控Nrf2表达的例子,该单核苷酸多态性位于一个ARE样序列(rs6721961)中,与人Nrf2表达量降低和对肺损伤易感性增加有关[42]。
3.2.2miRNA对Nrf2表达的调控
miRNA可抑制Nrf2mRNA的翻译过程,这是因为这些miRNA可与Nrf2mRNA的3′非翻译区互补配对,降低Nrf2mRNA的稳定性并阻遏其翻译过程。
迄今,所有miRNA对Nrf2表达水平影响的实验都是体外人为增加某种miRNA的表达水平,观察到Nrf2mRNA和蛋白表达量降低。
但在自然状态下,miRNA对Nrf2表达水平是否有影响,以及这种调控作用在所有Nrf2活性调控机制中的相对重要性仍有待进一步研究。
细胞实验证实,在人MCF-7乳腺癌细胞中异位表达miR-28可以降低Nrf2mRNA和蛋白的表达量[43];
在人SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中过表达miR-27a,miRNA-142-5p,miRNA-144及miR-153也可降低Nrf2mRNA和蛋白的表达量[44];
同样,在人MCF-10A和T47D乳腺癌细胞中过表达miR-93,可降低Nrf2mRNA和蛋白的表达[45]。
目前关于lncRNA对Nrf2表达水平调控的研究很少,但是与miRNA类似,lncRNA很可能也参与了Nrf2活性的表观遗传学调控,因而需要更深入的探索和研究。
总的来看,Nrf2活性的表观遗传学调控可能是一种对Nrf2活性的长期调控或基础调控,对外界环境因子的敏感性和反应性可能不及Keap1或蛋白激酶。
Keap1和蛋白激酶对Nrf2活性的调控是一种直接、迅速、即时的调控,对于细胞应对氧化应激和化学应激可能更为重要。
3.3小分子化学物对Nrf2活性的调控
Nrf2/ARE信号通路与多种疾病密切相关,是很有前景的药物作用靶点。
目前已有许多可调节Nrf2活性的天然和人工合成化学物。
它们可分为Nrf2活性激活剂和抑制剂2类。
值得指出的是,这些小分子化学物对Nrf2活性的调节多是间接性和激活性的。
今后需要加大直接调节Nrf2活性和抑制Nrf2活性小分子化学物的研究,因为已有研究表明,Nrf2过度活化与肿瘤细胞的耐药性有关,利用Nrf2的抑制剂可增加肿瘤细胞对药物的敏感性。
抗坏血酸是一种高效的抗氧化剂,可降低细胞内过氧化物水平,最终抑制Nrf2与GCL基因启动子区域的ARE结合。
用抗坏血酸处理具有伊马替尼抗性的细胞系KCL22/SR导致细胞谷胱甘肽水平降低和对伊马替尼敏感性的增强。
KCL22/SR细胞对伊马替尼敏感性的增强至少部分是由于抗坏血酸对Nrf2活性的抑制[46],但抗坏血酸对Nrf2活性的抑制显然是一种间接依赖Keap1的方式。
Wang等[47]发现全反式视黄酸可显著抑制Nrf2的活性,其机制是在全反式视黄酸的存在下,Nrf2可与视黄酸受体α形成Nrf2-视黄酸受体α复合体,因而无法与靶基因启动子区域的ARE结合。
最近Olayanju等[48]发现一种苦木苦味素化合物鸦胆子苦醇(brusatol)能迅速和一过性地降低Nrf2蛋白质水平,且证明这种抑制是发生在Nrf2转录后水平(即只有Nrf2蛋白表达降低,而Nrf2mRNA表达并未下降),是Keap1、蛋白激酶等非依赖性的,但是鸦胆子苦醇导致Nrf2蛋白表达降低的具体机制尚不清楚。
木犀草素(lute⁃olin)是一种黄酮类植物化学物,可以氧化-还原非依赖性方式抑制ARE基因的表达[49]。
已知非小细胞性肺癌A549中Nrf2组成型活化,木犀草素处理细胞后能显著降低Nrf2的mRNA和蛋白质水平,致使Nrf2无法入核与ARE结合,进而下调ARE基因的表达。
木犀草素的这种作用可能与其加速Nrf2mRNA的降解有关。
但是,Lin等[50]却在PC12细胞中得出了完全相反的结论,在PC12细胞中木犀草素能促进血红素加氧酶-1mRNA和蛋白质的表达,抑制细胞凋亡,增加Nrf2与ARE的结合。
事实上,目前对抑制Nrf2活性的小分子化学物的研究很少且争议颇多。
今后需加强这方面的研究,如通过高通量筛选和基于结构的药物设计等方法开发安全、高效、可逆的Nrf2小分子抑制剂,以便于实验室和临床上的应用。
4Nrf2/ARE信号通路调控的靶基因
4.1抗氧化蛋白/酶类基因
Nrf2/ARE信号通路是氧化应激时机体激活的最主要的通路,可激活许多抗氧化蛋白/酶类的表达。
抗氧化蛋白/酶类可有效代谢各种自由基、ROS及其他过氧化物,避免过氧化物对细胞的损伤,有利于细胞在氧化应激状态下的存活。
现已证明,Nrf2/ARE通路激活的抗氧化酶类有血红素加氧酶1、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷胱甘肽还原酶2和4和依赖还原型辅酶Ⅱ/醌氧还蛋白1等,这些酶类都具有抗氧化功能,能减少过氧化物的产生或加速过氧化物、自由基的清除。
Nrf2/ARE通路激活的抗氧化蛋白很多,主要包括过氧化氧还蛋白1和6、巯基氧还蛋白1、硫氧还蛋白(thioredoxin)和谷胱甘肽等。
它们对于清除自由基、避免生物大分子氧化损伤具有重要意义[8]。
4.2解毒酶类基因
Nrf2/ARE信号通路也是化学应激时机体激活的主要通路,可以激活许多代谢、转运、排泄有毒化学物的蛋白和酶类,有利于细胞在化学应激状态下的存活。
Nrf2促进转录的解毒酶类包含了Ⅰ,Ⅱ和Ⅲ相解毒酶[8],Ⅰ相解毒酶主要是催化外源化学物的氧化、还原和水解反应,可以直接破坏毒物的结构,降低毒性。
Ⅱ相解毒酶主要催化外源化学物或外源化学物经Ⅰ相解毒酶代谢的中间产物的结合反应,增加化学物的水溶性,促进其排出体外。
Ⅲ相解毒实质上是细胞将细胞内的外源化学物泵出细胞的过程,主要由一些依赖ATP的主动转运蛋白承担。
5结语
Nrf2/ARE信号通路是机体应对氧化应激和化学应激的主要通路,参与细胞增殖、三大营养物质代谢、细胞凋亡和衰老等多种生物学过程,与肿瘤、心血管疾病、糖尿病、慢性阻塞性肺病、肝肾疾病和炎症等多种疾病的发生密切相关。
该通路主要受胞浆蛋白Keap1和各种蛋白激酶信号通路的调控,而表观遗传学调控也具有一定的意义,这方面的研究较少,需要进一步的探索。
Nrf2活化的靶基因绝大多数都是细胞保护基因,可促进细胞存活,避免细胞受到损害,因而是很有前景的药物作用靶点。
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