白芨组织培养实施方案设计文档格式.docx
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经过试验优化后的技术路线为:
白及→种子(采集优质种源蒴果)→表面消毒→无菌播种(MS培养基等)→原球茎(分化诱导)→白及小苗(分株、扩繁)→壮苗生根(炼苗)→完整小植株→炼苗20-25天→移栽→白及
三、实验准备:
种子:
白及的蒴果中有大量的种子,并且蒴果的消毒较方便,污染率低。
另一方面用种子作为外植体操作较容易,并且组培过程中萌发率高,培养的幼苗生长较为迅速,因此,种子作为外植体应用比较广泛,大部分的组培研究都选用种子。
本实验选取卢氏本地优质白及(Bletillastriata(Thunb.)Reichb.f.)蒴果,采收时间为8月下旬至9月中旬,此时间段胚龄大约为第8周至第22周。
器材:
高压灭菌锅、超净工作台、电子分析天平(精度为千分之一)、电磁炉、接种消毒器、高效能培养架、医用小推车、日光灯、加湿器、紫外灯、晾瓶架、酸度计(或PH试纸)、试管、容量瓶、胶头滴管、试剂瓶、烧杯、试管架、量筒、玻璃漏斗、移液管、三角瓶、广口培养瓶、称量纸、毛刷、洗耳球、塑料筐、无菌脱脂棉、无菌滤纸、酒精灯、喷壶、橡胶手套、医用白大褂、紫外灯、镊子、接种针、剪刀、解剖刀、器械架、接种托盘等。
(1)通用器械
①烧杯:
用来盛放、溶解化学药剂等。
常用的规格有50mL、100mL、250mL、500mL、1000mL。
②烘箱:
用来烘干器械。
③恒温水浴:
用来溶解琼脂等物质。
④玻璃搅拌棒:
用来配制培养基。
⑤洗耳球:
用来辅助吸取、转移少量液体。
⑥冰箱:
用来贮存化学药剂、植物材料等。
⑦牛角勺:
用来转移化学药剂。
⑧玻璃漏斗:
用来过滤溶液。
⑨剪刀:
用来修剪外植体或剪切嫩茎。
⑩器械架:
在无菌操作期间用来放置灭菌的器械。
(2)各种盛具
①搪瓷浅盘:
用来承载各种器械容器。
②塑料盆:
用于清洗培养容器。
③铁丝筐:
用来盛放灭菌容器等物品。
④纯水水桶:
用来存放去离子水或蒸馏水。
常用的规格有10L、20L。
⑤塑料桶:
用来存放洗涤溶液、废弃溶液。
⑥各种规格的磨砂玻璃瓶:
用来盛放培养母液,以及各种植物生长物质。
(3)计量器械
①量筒:
用来量取一定体积的液体。
常用的规格有25mL、50mL、100mL、500mL、1000mL。
②容量瓶:
用来配制标准溶液。
常用的规格有50mL、100mL、500mL、1000mL。
③大肚移液管:
用来吸取定量溶液。
常用的规格有1mL、5mL、10mL。
④刻度移液管:
用来吸取定量植物生长物质溶液。
常用的规格有1mL、5mL、10mL(或可用移液器替换)。
⑤移液管架:
用来放置、固定移液管。
⑥酸度计:
用来检测培养基的pH。
⑦药物天平:
用来称取配制培养基的药品。
⑧分析天平:
用来称取少量有化学试剂,进行化学分析。
(4)灭菌器械
①磨砂口玻璃瓶:
用来对植物材料进行表面灭菌。
②酒精灯:
用来进行接种器材的表面灭菌。
③细菌过滤器:
用来过滤不能进行高温灭菌的试剂溶液。
④无菌滤纸:
用来汲取器材、植物材料表面的水分。
⑤无菌脱脂棉:
用来进行器械、植物材料表面的灭菌处理。
⑥高压灭菌锅:
对培养基、接种器材进行灭菌处理。
⑦紫外线灭菌灯:
用来对接种室、培养室、操作室等工作环境进行灭菌处理。
(5)接种器械
①超净工作台:
用来过滤通过接种工作台面的空气,以便进行无菌操作。
②小型喷雾器:
装载灭菌药液,来给超净工作台等处喷雾灭菌。
③钝头镊子:
在接种操作、继代培养时移取植物材料。
④尖头镊子:
用来分离植物材料。
⑤解剖刀:
用来切割植物材料。
⑥接种针:
用来转移细胞团、愈伤组织。
(6)培养器械
①试管:
用来作为外植体的培养容器。
常用的规格有2cm×
15cm、3cm×
15cm。
②培养皿:
常用的规格有直径9cm、12cm。
③锥形瓶:
即三角烧瓶,主要作为培养器材,常用的规格有50mL、100mL。
④铝箔:
用于培养容器封口。
⑤橡皮筋:
用来束紧培养容器的封口材料。
⑥空调:
用来调节操作间、培养室的温度。
药剂:
硝酸铵(NH4NO3)、硝酸钾(KNO3)、氯化钙(CaCl2)、硫酸镁(MgSO4•7H2O)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、碘化钾(KI)、硼酸(H3BO3)、硫酸锰(MnSO4•5H2O)、硫酸锌(ZnSO4•7H2O)、钼酸钠(Na2MoO4)、硫酸铜(CuSO4•5H2O)、氯化钴(CoCl2•6H2O)、乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA•2H2O)、硫酸亚铁(FeSO4•7H2O)、甘氨酸(C2H5NO2)、肌醇(C6H12O6)、烟酸(VB5)、盐酸吡哆醇(VB6)、盐酸硫胺素(VB1)、6-苄基腺嘌呤(6-BA)、萘乙酸(NAA)、腺嘌呤(AD)、赤霉酸(CA3)、蔗糖、琼脂
环境:
采用组培快繁技术进行白及的工厂化生产,包括外植体的筛选及获取、外植体灭菌诱导培养、无菌材料繁殖、继代扩繁、单株生根、出瓶炼苗、移栽等工艺程序。
由于组培苗生产从进瓶到出瓶都是在无菌条件下完成,所以离不开一个无菌环境,但实验室的规模大小需依据生产规模来确定。
组培实验室具体设计包括:
1、准备室:
(1)进行药品、器具和实验材料的保存、消毒以及培养基的配制、灭菌、分装等。
(2)器具的洗涤、干燥、消毒、储藏。
(3)生理生化指标的测定等。
2、接种室:
进行材料的接种,内置超净工作台,加装紫外线灯灭菌。
外设缓冲间放置拖鞋、工作服、工作帽等。
3、培养室:
开展白及幼苗的无菌生长提供场所,室内需要有培养架及控制温度、湿度、光照的各种设备。
四、实验流程
1.准备阶段
查阅相关文献,结合实际制订白及组织培养实施方案,根据实验方案配制实验所需的消毒剂和各类母液,确定不同培养阶段培养基配方。
MS培养基与其它培养基的基本成分相比,硝酸盐、钾和铵的含量高,有较高的无机盐浓度,无机养分的数量和比例比较合适,足以满足植物细胞在营养上和生理上的需要,对保证组织生长所需的矿质营养和加速愈伤组织的生长十分有利。
MS固体培养基可用来诱导愈伤组织,或用于胚、茎段、茎尖及花药培养,是目前普遍使用的培养基。
白及组培选取的培养基即为MS培养基。
配制培养基可分为以下几步:
(1)制备母液
为了避免每次配制培养基都要对几十种化学药品进行称量,应该将培养基中的各种成分,按原量10倍、100倍或1000倍称量,配成母液。
这样,每次配制培养基时,取其总量的1/10、1/100、1/1000,加以稀释,即成培养液。
MS培养基主要包含5种主要成分:
大量元素:
大量元素包括硝酸铵等用量较大的几种化合物。
制备时,按表中排列的顺序,以其10倍的用量,分别称出并进行溶解,以后按顺序混在一起,最后加蒸馏水,使其总量达到1L,此即大量元素母液。
微量元素:
因用量少,为称量方便和精确起见,应配成100倍或1000倍的母液。
配制时,每种化合物的量加大100倍或1000倍,逐次溶解并混在一起,制成微量元素母液。
铁盐:
铁盐要单独配制。
由硫酸亚铁(FeSO4·
7H2O)5.57g和乙二胺四乙酸二钠(Na—EDTA)7.45g溶于1L水中配成。
每配1L培养基,加铁盐5mL。
有机物质:
主要指氨基酸和维生素类物质。
它们都是分别称量,分别配成所需的浓度(0.1~1.0mg/mL),用时按培养基配方中要求的量分别加入。
植物激素:
最常用的有生长素和细胞分裂素。
这类物质使用浓度很低,一般为0.01~10mg/L。
可按用量的100倍或1000倍配制母液,配制时要单个称量,分别贮藏。
配制植物生长素时,应先按要求浓度称好药品,置于小烧杯或容量瓶中,用1mol/L氢氧化钠溶解,再加蒸馏水稀释至所需浓度。
配制细胞分裂素时,应先用少量1mol/L的盐酸溶解,然后加蒸馏水至所需量。
以上各种混合液(母液)或单独配制药品,均应放入冰箱中保存,以免变质、长霉。
至于蔗糖、琼脂等,可按配方中要求,随称随用。
(2)配制培养基的具体操作
①根据配方要求,用量筒或移液管从每种母液中分别取出所需的用量,放入同一烧杯中,并用粗天平称取蔗糖、琼脂放在一边备用。
②将①中称好的琼脂加蒸馏水300~400mL,加热并不断搅拌,直至煮沸溶解呈透明状,再停止加热。
③将①中所取的各种物质(包括蔗糖),加入煮好的琼脂中,再加水至L,搅拌均匀,配成培养基。
④用1mol/L的氢氧化钠或盐酸,滴入③中的培养基里,每次只滴几滴,滴后搅拌均匀,并用PH试纸(或酸度计)测其PH值,直到将培养基的PH值调到5.8-6.0。
⑤将配好的培养基,分装到组培瓶中,盖好瓶盖并做好标记,瓶中培养基的量约为20-25mL。
培养基的成分比较复杂,为避免配制时忙乱而将一些成分漏掉,可以准备一份配制培养基的成分单,将培养基的全部成分和用量填写清楚。
配制时,按表列内容顺序,按项按量称取,就不会出现差错。
(3)培养基的灭菌与保存
培养基配制完毕后,应立即灭菌。
培养基通常应在高压蒸汽灭菌锅内,在压力0.1-0.15Mpa、温度122℃条件下,灭菌15—20min。
期间需排出灭菌锅内的冷空气,具体操作方法为:
通电后,待压力上升到0.05MPa时,打开放气阀,放出冷空气,待压力表指针归零后,再关闭放气阀。
灭菌后的组培瓶取出后整齐摆放在室内,2h后即可冷却凝固成白色半透明状固体,经过灭菌的培养基要在配制后的一周内使用完,在多数情况下,应在灭菌后两周内用完。
2.外植体选择与消毒
选择合适的部位作为外植体,采回后经过适当的预处理,如清除残留的茎秆、剪去干枯的花序、分类筛选等,然后进行消毒处理。
白及组织培养采用白及种子无菌播种的方法,因此要采集无杂菌感染、无病虫害、生长健壮的优良白及品种种子。
实验选取白及种植基地的白及蒴果备用,蒴果采收时间为8月下旬至9月上旬。
白及蒴果采回后,先用清水洗净,洗衣粉溶液浸泡10min再用清水冲刷洗净,在超净工作台上采用70%乙醇消毒30s,再用0.1%升汞消毒10-15min,用无菌水冲洗3-4次,在滤纸上吸干水分,从果实中部拨开,快速接种到培养基上。
无菌播种培养基配方为:
MS+6-BA0.05mg/L+NAA0.1-0.5mg/L,其中含蔗糖3%、琼脂粉0.7%、PH5.8。
种子萌发条件为昼温20-25℃,夜温18-20℃,暗培养7d再转入光培养。
观察种子萌发情况,以周围统计单位,统计萌发个数及生长情况,发现染菌需及时清理。
如白及蒴果采集数量较多,无法一次性保存,可用报纸逐个包裹后放入冰箱,每周更换报纸避免发霉,在4℃左右可长期保存。
3.丛生芽诱导
无菌播种培养基中种子萌发出现圆球状绿色芽点,及时转入诱导培养基中,萌发大量丛生芽。
诱导丛生芽培养基为:
MS+6-BA0.1mg/L,其中含蔗糖3%、琼脂粉0.7%、PH5.8。
4.生根壮苗培养
刚形成的白及芽苗往往比较弱小,多数无根,此时可降低细胞分裂素浓度或不加,提高生长素浓度,促进小苗生根,提高其健壮度。
待白及丛生芽长到2cm高后分离成单株转入生根培养基中,以每瓶20-30株为最佳。
培养基为:
MS+6-BA0.05mg/L,其中含蔗糖2%、琼脂粉0.7%、PH5.8。
由于分化形成的芽、原球茎数量有限,为了大量获取幼苗,可采用适当的继代培养基(本实验采用MS+NAA0.1—0.5mg/L,其中含蔗糖2%、琼脂粉0.7%、PH5.8),经多次分割转接,当芽苗繁殖到一定数量后,再将一部分用于壮苗生根,另一部分保存或继续扩繁。
采用此方法工序较多,产生的人工成本和材料成本较大,故在本实验中不采用。
(5)炼苗移栽
当白及组培小苗在培养瓶中长到3-5cm高时,即可出瓶。
一般来说,春季气温逐渐回升,有利试管苗适应自然环境,最宜移栽。
为使试管苗移栽后适应自然环境,移栽前要先揭开瓶盖,放在室内自然光下炼苗3-7d,以提高小苗的抗性和适应性。
在组培瓶中时间不宜超过2个月,时间过长
出瓶取苗要小心操作,尽量不要折断根部,可用镊子轻夹根部拔出(镊子头部可用棉花捆绑),用软毛刷洗净根部培养基,正常组培苗先在自来水中洗净培养基,特别要洗掉琼脂,以免琼脂发霉引起烂根,再换自来水清洗一次,然后用800-1000倍百菌清或多菌灵液浸泡根部0.2h,待幼苗放在通风阴凉处晾半天,用湿润毛巾盖住叶片,只把根部裸露,至根部发白时即可栽植,移栽前用1000倍生根剂溶液蘸根,植入土壤基质中。
深度不宜过深,以入土3-5cm深为宜,使根部自然伸展,轻轻压实,株行距5*5cm。
栽好后,浇足定根水,置于阴凉处。
注意保持较高的空气湿度(80%-90%)和适当通风,并使环境温度维持在20-25℃。
当移栽小苗新叶展开、苗根伸长后,每月用MS大量元素1000倍稀释液或花宝一号1000倍稀释液喷施追肥,促进生长发育。
待小苗成活后,再移栽到大田。
驯化时间3-5个月后等外界气温逐渐回升,有利组培苗适应自然环境,最宜移栽。
因白及喜湿润,怕积水,积水会使根茎腐烂,叶片脱落而死。
因此,移栽过程中基质的透气性和保湿性直接决定了白及苗成活率的高低。
对白及组培苗移栽基质可以使用珍珠岩30%+膨化蛭石30%+泥炭10%+炭渣10%+新鲜黄土20%等基质均能达到很好的效果,移栽成活率可达90%以上。
另外,苔藓(水苔)的保湿性和透气性良好,可作为移栽基质,将其平铺于白及幼苗根部保湿。
关键点:
1、温度
白及适合在温湿的环境中生长,加之白及组培苗长期在温室里面恒温培养,所以白及组培苗适应外界环境中,温度很关键。
全国范围从季节上来讲,春季和秋季驯化最为理想。
本地种植,在夏季需要降温措施,冬季需要保温措施方可驯化。
温度在10℃以上,30℃以下,都能正常生长,20℃左右最为理想。
2、湿度
白及在驯化过程中保持基质湿润即可,下苗的时候浇透定根水,平时视天气3到5天可以喷雾一次,每次喷水不要过多。
3、关照强度
白及组培苗在培养室的强度一般在3000-4000lux,而外界环境一般在50000lux以上,中午时甚至接近100000lux,所以白及组培苗需要逐步适应外界环境。
4、基质
白及属于根茎类植物,为了有个良好的根域环境,需要选用肥沃疏松的基质作为驯化基质。
例如:
林下腐殖土、杂草秸秆腐熟土、黑色沙壤土加少量锯末等都可以,推荐主要成分使用珍珠岩30%+膨化蛭石30%+泥炭10%。
为了很好的控制白及组培苗驯化的温湿度,需要搭建大棚(棚高2m以上为宜),棚外覆盖遮阳网,随着驯化时间的推移,逐渐揭去遮阳网。
大棚建好后,在棚里开沟起垄,宽1.2m。
在翻土的时候,喷两到三次杀虫剂,在翻土中看到害虫捕捉杀灭。
将垄整平整细后铺上提前准备的驯化基质,然后将组培苗用2-3d逐渐开瓶,并放在棚里适应7—10d。
棚外覆盖遮阳网,视温度情况确定遮阳网层数,温度过高,注意白天通风。
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- 白芨 组织培养 实施方案 设计