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(4)51Cr-RBCT缩短,而肝脾均无明显异常的放射性聚集,见于某些免疫性溶血性贫血。
4.红细胞寿命测定时应注意:
(1)检查前三周及检查期间要避免输血,以保证51Cr标记的是自身红细胞以及标记红细胞不被非标记红细胞所稀释,否则会影响测定结果;
(2)标记红细胞时所加人51Cr的浓度应<
2µ
/ml红细胞,过量会影响红细胞存活期;
(3)检查前一周停服维生素C,因其可使六价51Cr还原成三价而降低标记率。
血浆游离血红蛋白
10~50mg/L
1.正常红细胞寿命为120天左右,因此每天均有不少红细胞衰亡,以至血红蛋白外溢。
但正常情况下,从红细胞中出来的血红蛋白量很低,并可经单核-吞噬细胞系统代谢为胆红素。
本试验利用血中血红蛋白具有过氧化物酶的作用来判断红细胞的破坏程度。
2.血浆游离血红蛋白增加是血管内溶血的指征,如蚕虫黄,阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH),阵发性寒冷性血红蛋白尿,冷凝集素综合征,温抗体型自身免疫性溶血性贫血,行军性血红蛋白尿,微血管病性溶血性贫血,黑热病,镰形红细胞性贫血,地中海贫血等。
血管外溶血,血浆游离血红蛋白正常,如遗传性球形红细胞增多症。
3.在整个试验过程中一切器皿要避免血红蛋白的污染,血标本要避免体外溶血。
如果当测定管光密度超过0.6,则应将血清作适当稀释后重新测定。
血清触珠蛋白
981.2~2739.2mg/L(火箭电泳法)
1.血红蛋白释放人血后,尤其在血管内溶血时,血红蛋白可与肝中合成的一种α-球蛋白-触珠蛋白结合。
这种结合型的血红蛋白-触珠蛋白(Hb-HP)复合物可以在几分钟内被单核-吞噬细胞系统从血浆中消除掉。
如果没有这种复合物,那么血浆中游离血红蛋白的消除很慢,半衰期为4天。
正常人血中触珠蛋白的浓度为100mg/L,在肝实质病变时,触珠蛋白的合成是减少的,但急性炎症时往往有明显的触珠蛋白量的升高。
2.血清触珠蛋白(HP)是一种球蛋白,各种溶血都可使HP减低,尤其是血管内溶血,甚至为“0"
。
肝细胞性肝病,传染性单核细胞增多症,先天性无触珠蛋白血症等,HP亦明显减低。
3.感染、创伤、肿瘤、红斑性狼疮、类固醇治疗、肝外阻塞性黄疸、霍奇金病等可使HP升高。
此时如HP正常,不能排除溶血可能。
4.本试验由于受到血红蛋白影响,所以要避免标本体外溶血,如经稀释后标本测不出HP含量,则应缩小稀释倍数,甚至以原倍来测定。
触珠蛋白测定可与游离血红蛋白和含铁血黄素尿检测同时进行,这些项目都被认为是溶血存在,尤其是血管内溶血的主要指标。
理论上认为,含铁血黄素尿的出现还预示着血浆中的血红蛋白大大超过触珠蛋白的结合能力,以α-β二聚体的形式从肾小球中滤过,但尚可被肾近曲小管细胞吸收;
一旦发生了血红蛋白尿,则更说明α-β二聚体的滤过负荷超出了肾小管细胞的吸收能力,意味着体内存在持续快速的血管内溶血。
这种情况的出现,也可从血清铁等检测出现缺铁表现得到旁证,也有利于对溶血程度的判断。
红细胞渗透脆性试验
开始溶血0.40%~0.44%(NaCl液)
完全溶血0.32%~0.36%(NaCI液)
1.红细胞膜,有人称为鬼影(ghost),是一种由磷脂、非酰化的胆固醇和糖蛋白等组成膜脂质和主体、膜蛋白质(转运蛋白和表面抗原)与周围膜蛋白质(膜骨架中的收缩蛋白和肌动蛋白以及膜骨架依靠的锚蛋白)所组成。
这些成分要保证红细胞在120天寿命内50000次通过“急流旋涡"
仍能生存;
要控制Na十和K+在细胞内的浓度,任何导致K+漏出增高超过Na+的漏人,均会导致细胞内单价阳离子和水分的丢失。
这些生理功能的完善与否,可用简单且明白的膜渗透脆性试验来了解。
2.正常红细胞为双凹盘形,在低渗盐水中吸水膨胀的适应性大(可增加70%的体积而不破裂),遗传性球形红细胞增多症(HS)等红细胞的S/V比率小,对低渗盐水的适应性小(脆性大),所以红细胞渗透脆性试验是检测HS最有用的方法,当红细胞混悬于不同浓度的NaCl低渗溶液时,正常红细胞于0.40%~0.44%NaCl浓度时开始溶血,于0.32%~0.36%NaCl浓度时完全溶血。
HS病人的红细胞大多于0.50%~0.75%NaCl时开始溶血,于0.40%NaCl浓度时完全溶血,患者红细胞渗透脆性试验与正常对照组相比提高0.04%(NaCl液)以上即为阳性,还可见于遗传性椭圆形红细胞增多症,某些伴有球形红细胞增多的自身免疫性溶血性贫血。
3.红细胞渗透脆性试验显示,低于参考溶血的NaCl浓度可见于地中海贫血,血红蛋白C、D、E病,缺铁性贫血和肝脏疾病。
4.在试验过程中要严格控制加血量的准确性和防止血标本在体外溶血,否则易影响试验的准确性。
蔗糖溶血试验
定性:
阴性
定量:
溶血率<
5%
1.本试验意义和原理与酸溶血试验相似,阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)患者红细胞膜对补体非常敏感在低离子强度蔗糖溶液中,经孵育加强了补体和红细胞膜的结合,使对补体敏感的细胞溶血。
2.阳性或溶血率>
5%示PNH,此试验可作为PNH的筛选试验,阴性可基本排除PNH,如阳性应再作酸溶血试验证实。
3.某些白血病或骨髓纤维化虽定性为阳性,但其溶血率<
10%。
轻度阳性见于巨幼细胞性贫血,再生障碍性贫血,自身免疫性溶血性贫血和HS。
冷热溶血素试验
阴性反应
1.冷热溶血素试验是诊断阵发性冷性血红蛋白尿症(PCH)的主要指标。
这种罕见的自身免疫性溶血是起因于存在血液P抗原组冷反应抗体IgG介导的红细胞破坏。
这种非凝集的自身IgG能有效地激活补体,而发生血管内溶血。
2.阳性反应主要见于阵发性寒冷性血红蛋白尿,冷热溶血素试验是确诊阵发性寒冷性血红蛋白尿最有用的试验。
阵发性寒冷性血红蛋白尿是一种冷反应性抗体引起的血管内溶血,此病的发生与一种和补体有关的自身抗体有关,称为D-L型冷溶血素,D-L溶血素是一种7sIgG的冷反应性抗体,具有强烈的溶血作用,这种抗体有时称为“双相"
抗体,应先将温度降至0~4℃,然后再升至37℃,则其溶血作用最强。
3.PCH现在更多的是作为一些病毒感染的并发症,因此在某些相关疾病的各种阶段和病理生理反应时都会有冷热溶血素试验的阳性,如三期梅毒,传染性单核细胞增多症,麻疹和流行性腮腺炎。
但此时的PCH一般是短暂的。
热溶血试验
阴性反应
1.本试验意义和原理与酸溶血试验相似,利用患者自己血清中的补体和葡萄糖,经37℃孵育24小时,使糖分解酸化,使对补体敏感的细胞溶解。
2.由于PNH患者红细胞对热抵抗力低,所以阳性主要见于PNH,另外HS和自身免疫性溶血性贫血亦可阳性,但阳性率比PNH为低,本试验用于PNH筛选试验。
自溶试验
24小时不加葡萄糖管<
4.5%,加葡萄糖或加ATP管<
0.4%
1.本实验意义和原理与红细胞渗透脆性试验相似,但不如低渗盐水。
观察不加纠正物(以生理盐水代替)和加纠正物(葡萄糖或ATP)的红细胞在自身血浆中的溶血度。
红细胞对阳离子的转运需要能量,经孵育的红细胞消耗能量,ATP储备量减少,钠离子在细胞内储积,细胞体积增大而易于破裂。
2.自溶试验溶血率增加见于球形、椭圆形、口形和棘形红细胞增多症等,加人葡萄糖和ATP溶血都被纠正。
3.非球形细胞性溶血性贫血I型虽也呈阳性,但溶血率较低,加人葡萄糖溶血可被纠正;
Ⅱ型溶血率显著增加,加入葡萄糖不被纠正,但加入ATP后溶血则被纠正。
自身免疫性溶血性贫血,溶血率也增高,但不被葡萄糖和ATP纠正。
酸化甘油溶解试验
AGLT50(光密度降至50%的时间)>
180s
AGLT10(光密度降至10%的时间)>
1800s
△A,/min(最初1分钟光密度变化值0.12±
0.04
1.本试验与渗透脆性试验意义相近,在微酸性含甘油的缓冲液中,正常人红细胞会发生缓慢溶血,并随细胞溶解的增加出现光密度逐渐下降。
其发生机制不详,可能是由于甘油与膜脂质的亲和性等能提取膜脂质或与它起化学反应,使红细胞膜减少而产生溶血,HS患者红细胞的特点是膜脂质减少,表面积/体积的比值降低,细胞球形化和膜代谢异常,加人酸化甘油缓冲液后,膜脂质更加减少,加速了表面积减少,细胞球形化和膜代谢异常的过程,因而溶血加速。
2.AGLT50比红细胞渗透脆性试验敏感,有症状的HS患者100%为阳性,其值显著缩短(27~106秒);
无症状HS患者50%~86%为阳性。
3.AGLT10和△A2/min二个指标可大大提高特异性,有症状的HS患者都为阳性(AGLT10<
200秒;
△A2/min明显增高)而其它疾病极少阳性,无症状的HS也为阴性。
4.以上三个指标综合分析能将有症状的HS与其它疾病鉴别。
5.本试验易受温度影响,温度过低溶血加快,温度过高溶血减慢。
高铁血红蛋白还原试验
高铁血红蛋白还原率>
75%(光电比色法)
阴性:
标本呈红色(目测法)
1.本试验是利用亚硝酸钠使血液中的亚铁血红蛋白氧化成高铁血红蛋白(MHb)。
如果红细胞内6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PD)活性正常,可通过磷酸戊糖旁路形成还原型辅酶Ⅱ(NADPH),在递氢体美蓝参与下,它作为高铁血红蛋白还原酶的辅酶,使MHb还原成亚铁血红蛋白,如果G6PD缺乏,NADPH形成障碍,则MHb还原成亚铁血红蛋白的速度较正常人慢,通过测定MHb的还原速度来间接反映G6PD活性。
2.目前,本试验是国内使用较多的方法.此法简单易行,已发展了微量法,适用于G6PD缺陷症的过筛试验,G6PD缺陷症杂合子型目测结果为棕色,还原率为31%~74%,纯合子型目测法为棕褐色,还原率为<
30%,而组织化学洗脱法则对检出杂合子较好,此法缺点是NADPH-MHb还原酶缺乏(罕见)也可出现阳性结果。
患者如果存在HbH,不稳定血红蛋白,高脂血症,巨球蛋白血症等均可造成假阳性结果,但这些疾病尚有其它特点,可与G6PD缺乏症不难区别。
3.本试验对于贫血患者应将红细胞比积调整在35%~40%,由于草酸盐具有还原性,故草酸盐不宜作本试验的抗凝剂,血液与反应试剂的比例要准确,否则易产生假阳性或假阴性。
红细胞6-磷酸葡萄糖脱氢酶
紫外分光光度计法:
2.8~7.3IU/gHb
荧光斑点法:
有荧光点
1.红细胞中的葡萄糖90%通过糖酵解途径转化成乳酸,其产生的ATP是维持红细胞的正常生理功能的重要基础。
另外10%左右的葡萄糖在红细胞内是经磷酸己糖旁路代谢来提供还原型辅酶II(NADPH),而足够的NADPH是保持红细胞内相对高浓度还原型谷胱甘肽(GSH)的重要保证。
GSH可以保护红细胞免受氧化剂的损害。
几乎所有的磷酸己糖旁路缺陷是因葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏所致。
目前已知G6PD缺陷是基因改变所引起的,这种改变至少有300种,其中有些可以致病,如GdA-、GdMed和GdCanton变异等;
另一方面,定位于X染色体的G6PD基因,在遗传学上可属性联遗传,这说明男性可有一种类型G6PD,而女性可有两种。
2.G6PD缺陷症患者无荧光点或小于2.8IU/gHb(杂合子型为0.6~2.8IU/gHb,纯合子型为<
0.6IU/gHB)。
杂合子的检出G6PD缺陷症确诊和对遗传学的研究都很重要。
由于杂合子为二个细胞群构成,如果缺G6PD,细胞群较少,则可被正常细胞群掩盖,测定值可能在正常范围内,这时用组织化学洗脱法判断杂合子更加可靠,如采用MHb还原试验洗脱法,四氢唑蓝组织化学洗脱法等。
3.应当指出:
由于在体外G6PD活性测定是在“标准”情况进行的,不能完全反映体内情况,因此以出现酶活性高低与症状不相平行的情况。
这是需要结合临床表现作出判断,有条件时可进行酶动力学的进一步鉴定。
由于酶的本质是蛋白质,所以影响蛋白质的一切因素均能影响酶的活性,如pH、温度等,故配制缓冲液时需用pH计校正至要求范围。
在测定中如采用校正温度常数的方法,则所有试剂必须准确复温至室温才能进行测定。
待测标本必须要新鲜,溶血液在室温中G6PD活性会逐渐下降故操作尽快进行,在溶血液制备过程中要尽量减少白细胞、血小板及网织红细胞的数量,否则结果偏高。
4.诊断G6PD缺乏症虽然可用高铁血红蛋白还原试验,但这种试验的敏感性有限必须异常细胞达到30%~40%时才被测出;
目前所用的G6PD活性测定实际上是直接测定NADPH的产量,虽说比筛选试验敏感,但仍需有20%~30%的G6PD缺乏细胞才能得出不正常的结果。
因此,在本试验应用中,最好比较G6PD和其他年龄相关的酶的水平加以修正,才可明显提高敏感性。
红细胞丙酮酸激酶
紫外分光光度法:
PK活性10.1~20.1IU/gHb(紫外分光光度法)
荧光斑点法:
无荧光点
1.如果说红细胞抗氧化作用依赖磷酸己糖旁路中的G6PD活性,那么红细胞能量ATP保证则借助于糖酵解途径中的丙酮酸激酶(PK)。
而丙酮酸激酶的缺乏伴溶血的酶缺陷病例的90%以上。
几乎所有的糖酵解中酶缺陷为常染色体隐性遗传,但溶血只发生于纯合子。
2.本试验是在反应体系中加入受检者溶血液,磷酸烯醇式丙酮酸(PEP),二磷酸腺苷(ADP),乳酸脱氢酶(LDH)和还原型辅酶I(NADH)。
如果受检者溶血液中存在PK活性,则PK在ADP存在下能催化PEP转变为丙酮酸,再由LDH将丙酮酸转变为乳酸,同时将NADH转变为NAD+,NADH在波长340nm有一吸收峰,通过测定单位时间内NADH减少的两来反映PK活性。
3.红细胞PK活性测定是诊断丙酮酸激酶缺陷症最直接和可靠的证据,不过这种检查方法比较复杂,目前国内外大多数临床单位均尚未建立,因此在实用上受到了限制。
另外骨髓增生异常综合征(MDS)、急性粒细胞性白血病(AML)和慢性粒细胞性白血病(CML)等,也可有获得性PK活性降低。
在试验中由于白细胞、血小板、网织红细胞均可使结果增高,故应尽量除去。
同时试剂的pH值、温度要准确。
4.丙酮酸激酶缺乏症时,网织红细胞会不可思议地升高至60%~70%,且生存时间延长,可以看作是网织红细胞内线粒体氧化磷酸化反应产生ATP对PK缺乏的替代。
而同时测定红细胞内2,3-DPG,可见升高2~3倍,并可伴有多种红细胞代谢中间产物含量的改变。
红细胞还原型谷胱苷肽测定和稳定性试验
GSH试验:
0.46~1.00(平均0.732)g/I。
稳定性试验:
加乙酰苯肼温育2小时,GSH<
20%
1.还原型谷胱苷肽(GSH)在正常红细胞内可达2mmol浓度,能保护红细胞免受超氧阴离子(O2-),过氧化氢(H2O2)和羟基等这些氧化剂的影响。
GSH的量和稳定性既受G6PD活性的影响,更受谷胱苷肽合成酶和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的调节。
两者缺一的红细胞,其GSH水平必定很低,但一般无明显过多的溶血发生。
2.GSH缺乏可因GSH合成的第二步中谷胱苷肽合成酶(GSH-Syn)缺乏所致,但近年发现也可因第一步中γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶缺乏所致,氧化型谷胱苷肽还原酶(GSSGR)及G6PD缺乏症也可使GSH减低,GSH缺乏时可产生轻度溶血性贫血,在应用氧化剂药物时,贫血加重。
3.临床上GSH与G6PD活性需同时测定,而不应过多考虑是否存在溶血。
由于GSH的易被氧化特征,因此为检测制备的溶血液不能放置而应立即测定。
红细胞5,-尿嘧啶核苷酸酶
成人:
12.15±
2.52nmol/(Lpi.h.gHb)
新生儿:
2.52umol/(Lpi.h.gHb)
缺乏引起的溶血性贫血在溶贫比例中可占第三~第四位,其缺乏直接影响胞嘧啶核苷酸的代谢,造成的RNA和RNA部分降解产物在红细胞内的堆积,形态上表现中嗜碱性点彩,在铅中毒时亦有类似抑酶活性作用,可造成轻、中度溶血性贫血。
红细胞2,3-二磷酸甘油酸
4730~6450(平均5590)nmol/ml红细胞
1.凡位于2,3DPG合成途径中的各种酶(如己糖激酶)先天性缺乏,则2,3DPG减低。
2.凡位于2,3DPG分解途径中的各种酶(如己糖激酶)先天性缺乏,则2,3DPG增高。
红细胞磷酸烯醇丙酮酸
8~22(平均14.8)nmol/ml红细胞
增高见于遗传性丙酮酸激酶缺乏症。
红细胞丙酮酸
31.4~62.0(平均47.5)nmol/ml血液
同PEP。
红细胞三磷酸腺苷
1186~1524(平均1355)nmol/ml红细胞
减低见于丙酮酸激酶,磷酸甘油酸酶,己糖激酶,磷酸葡萄糖异构酶和磷酸甘油酸变位酶缺乏症。
红细胞乳酸形成试验
1220~1700(平均1460)nmol/ml红细胞
增高见于红细胞糖无氧酵解通路的酶缺陷如己糖激酶,磷酸葡萄糖异构酶,磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶缺乏等。
红细胞磷酸果糖激酶
9~13IU/gHb
低于参考范围下限为相应红细胞缺陷。
红细胞醛缩酶
2.5~4.0IU/gHb
红细胞磷酸丙糖异构酶
1710~2500IU/gHb
红细胞二磷酸甘油酸变位酶
4.1~5.4IU/gHb
红细胞磷酸甘油酸激酶
280~360IU/gHb
红细胞6-磷酸葡萄糖
24~44(平均32.6)nmol/ml红细胞
增高主要见于红细胞磷酸果糖激酶(PFK)缺乏症。
红细胞1,6-二磷酸果糖
3~13(平均8.1)nmol/ml红细胞
减低见于磷酸果糖激酶缺乏症;
增高见于磷酸丙糖异构酶缺乏症。
红细胞6-磷酸果糖
3.9~16.3(平均10.8)nmol/ml红细胞
增高主要见于红细胞磷酸果糖激酶(PFK)缺乏症。
红细胞磷酸二羟丙酮
8~22(平均14.8)nmol/ml红细胞
同FDP。
抗碱血红蛋白
成人男性:
0.17%~2.27%
女性:
0.13%~1.56%
新生儿:
55%~85%2岁以后降至2%以下
1.血红蛋白F(HbF,或称胎儿血红蛋白)即为抗碱血红蛋白,因为其具有抵抗弱碱的作用。
血红蛋白F早在胚胎卵黄囊形成初时就与HbPortland(δ2γ2)和HbGowerI(δ2ε2)Hb
GowerⅡ(α2β2)等同时存在,只是当妊娠11周以后,红细胞生成转移至肝、脾后,HbF、
(α2γ2)才取代了上述三种早期血红蛋白成为胎儿的主要血红蛋白。
至妊娠38周以后;
开始了HbA为主的血红蛋白合成,这一转换可引起HbA的急速上升HbF的突然下降,同时伴有次要血红蛋白HbA2(α2γ2)的合成。
在正常情况下,HbA在出生后呈主要地位,可达95%~98%,而HDF不超过1.5%。
HbF和HbA基因的表达主要受早期干细胞的调控而不是在幼稚或成熟的红细胞。
目前认为BFU-E保持着表达HbF的最高活力。
当机体在病理状态下,未分化的BFU-E可以代偿性的步人到红细胞里细胞池中参与红细胞增殖成熟,以至于血红蛋白F大量增高。
2.半数轻型β-地中海贫血抗碱血红蛋白轻度增高,重型β-地中海贫血抗碱血红蛋白显著增高,α、F、A2F和γ-地中海贫血抗碱血红蛋白也增高,HbH病患者抗碱血红蛋白可增高,因HbBart'
s具有抗碱性,再生障碍性贫血(AA),阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH),真性红细胞增多症,铁粒幼细胞性贫血,白血病等抗碱血红蛋白可轻度升高,γ地中海贫血,抗碱血红蛋白不升高。
3.本试验在操作过程中应注意,血红蛋白液必须新鲜,碱化时间要准确,过滤后须在1小时内比色测定。
并结合血红蛋白电泳分析,其结果更加可靠。
异丙醇试验
1.“不稳定”血红蛋白是由于氨基酸替换致使溶解度降低或造成对氧化敏感的血红蛋白。
至今已报道约100种变异体。
引起不稳定血红蛋白的突变大多干扰氢键与疏水性相互反应,从而影响二聚体形成。
溶解度降低最常见的生物化学基础是血红素对珠蛋白结合的强度降低。
在循环红细胞内沉淀的血红蛋白形成细胞内涵体,称之为“海因茨体"
(Heinzbodies)。
机体内单核一吞噬细胞系统试图扣留或消除这些带“海因茨体"
的红细胞就会发生溶血。
与珠蛋白生成障碍性贫血比较,不稳定血红蛋白相当少见,而其中有症状的不稳定血红蛋白主要发生在β链,并在遇“氧化”压力加重,如感染或暴露于氧化药物(奎宁)时,一些不稳定血红蛋白才出现症状。
2.不稳定血红蛋白病为强阳性反应,HbH、HbE、HbF增高及葡萄糖6磷酸脱氢酶(G6PD)缺陷,患者均可出现阳性,正常脐带血呈强阳性,1个月后逐渐转为阴性。
3.本试验血红蛋白液需新鲜配制,且血红蛋白液制备时不要用有机溶剂,最好采用冻融法制备血红蛋白液,同时要作正常对照。
17%异丙醇溶液pH不得低于7.2,要保证试剂的预温时间,血红蛋白液浓度不能低于7.5%,否则易产生假阳性,如果HbF>
4%,可产生假阳性,血红蛋白制备时,须高速离心以完全除去细胞膜残渣,否则也可出现假阳性。
4.不稳定血红蛋白是否存在,往往不
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