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Ⅵ.蛋白质水平RNAi效果监测20
A.western-blot原理
B.western-blot操作步骤
C.western-blot上样液的制备
D.western-blot常用试剂的配制
Ⅶ.RNAi实验常见问题解答22
Ⅰ.RNAi简介
A.RNAi实验原理
RNA干扰(RNAinterfering,RNAi)现象是由与靶基因序列同源的双链RNA(double-strandedRNA,dsRNA)引发的广泛存在于生物体内的序列特异性基因转录后的沉默过程。
细胞中的核糖核酸酶III家族成员之一的,dsRNA特异性的核酸酶Dicer将dsRNA裂解成由21-25个核苷酸组成的小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA),随后siRNA作为介导子引起特异性地降解相同序列的mRNA,从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制。
B.RNAi实验流程
C.RNAi实验所需试剂
试剂种类
试剂用途
siRNAoligo
与您所要敲除靶基因的转录本(mRNA)完全互补
转染试剂
如脂质体法,lipofectamin2000(invitrogen),上海吉玛的转染试剂RNAi-Mate,电穿孔法等
实验对照
包括阴性和阳性及Mockingcontrol
基因表达的检测方法
如mRNA水平检测用qRT-PCR;
蛋白表达水平检测用westernblot
D.上海吉玛RNAi相关产品
普通siRNAOligo
上海吉玛siRNAOligo是在ISO9000质量标准下生产并经过了反复优化和严格测试;
产品质量高度稳定,以退火双链RNA冻干粉的产品形式提交给用户。
化学修饰siRNAOligo
上海吉玛化学修饰siRNAOligo不仅增强了siRNA在血清、体内及细胞培养中的稳定性,同时与标准siRNA作用时间相比,上海吉玛化学修饰siRNAOligo的作用时间可延长一倍左右。
荧光标记siRNAOligo
荧光标记siRNAoligo可用荧光显微镜、流式细胞仪、激光共聚焦显微镜等观察到,可直观地观察siRNA转染效率,优化转染条件;
荧光标记的
siRNA还可用于siRNA细胞定位及双标实验(配合标记抗体)来追踪转染过程中导入了siRNA的细胞,将转染与靶蛋白表达结合起来。
siRNA阴性对照
上海吉玛RNAinegativecontrol与哺乳动物基因无
同源性,作为实验的阴性对照,同时通过标记荧光,可以方便地在荧光显微镜下观察转染的效率,有利于优化转染条件。
荧光容易拍摄,它有很好的pH耐受性,因而在活细胞中更稳定。
siRNA阳性对照
上海吉玛RNAipositivecontrol用于确定实验中转染、RNA提取和检测方法的可靠性。
上海吉玛提供
的阳性对照包括LaminA/C、GFP22、LuciferaseGL2、MAPK1、Beta-Actin、Vimentin、P53、GAPDH、CyclophilinB等。
siRNA转染
RNAi转染试剂
RNAi转染试剂是一种基于脂质的转染试剂,专门用于转染,确保没有RNAse活性,细胞毒性低。
适用细胞广泛;
可在含有抗生素的完全培养基中转染;
即用型试剂,不必更换培养基,操作简便易行,重复性好,可在半小时内完成操作;
介导siRNA高转染细胞和体内高效导入,即使在含血清培养基中
也能表现高转染效率;
4℃下可长期保存。
RNAi表达载体法
shRNA表达载体
上海吉玛shRNA表达载体的特点是:
克隆载体具有两种形式的克隆酶切位点BamH1和Bbs1,可形成非对称互补粘末端,保证插入片断的方向正确,有效避免载体自体连接;
多种筛选标记确定稳定转染细胞系;
GFP报告基因帮助评价转染效率并指示RNAi发生位点。
上海吉玛现可提供8种shRNA表达载体,详见公司总目录C-6页。
EzolRNAExtraction
Reagent
Ezol试剂是用于总RNA抽提的试剂,适用于人类、动物、植物、细菌等组织或细胞的总RNA提
取;
无论是小量的细胞(5×
106)或组织(50-100mg)还是大量的细胞(107)或组织(>
1g)都可得到出
核酸抽提
色的结果;
操作简便,可实现RNA的快速抽提。
EnzolRNAExtraction
Enzol试剂是用于哺乳动物基因组DNA抽提的试剂,适用于组织、单层或悬浮细胞的基因组DNA提取。
通常使用本试剂,从20毫克组织可以抽提到约40微克基因组DNA,从106-107Hela细胞可以抽提到约25微克基因组DNA,是一种简单、快速、高效、经济的方法。
RNAi-StartupGAPDH
ControlKit
本试剂盒可以用来优化siRNA转染条件,也可作为RNAi实验的内参使用。
荧光标记的dsRNA可直观地观察细胞转染情况;
包含GAPDHsiRNA阳性对照和阴性对照;
应用Real-TimePCR方法准确评价转染前后GAPDH基因的RNAi抑制情况;
为优化转染条件提供直观依据。
BasicControlKit
应用
Real-TimePCR评价转染前后GAPDH基因活性时,本试剂盒适用于Real-timePCRCoreReagent(目录号QSG-070)。
RNAiGene-Knockdown
EasyKit
使用本试剂盒可以完成从“向细胞中导入siRNA及转染效率评价”到“实时RT-PCR验证RNAiKnockdown效果”的全部过程;
荧光标记的dsRNA可直观的观察细胞转染情况;
内含GAPDHsiRNA
基因表达检测
阳性对照和阴性对照及PCR扩增引物和探针,可应用定量PCR方法直观评价转染效率及验证GAPDH的RNAi抑制效果;
可作为RNAi实验的阳性和阴性对照使用。
RNAi-StartupIFN
ResponseBasicControlKit
哺乳动物细胞中长链的双链RNA(dsRNA)能够诱导干扰素效应,引起非特异性的转录抑制。
如果您不确定您的siRNA序列是否会诱发非特异性的IFN效应,则可用本试剂盒进行验证;
应用Real-TimePCR检测非特异性IFN效应时,本试剂盒适用于Real-timePCRCoreReagent(目录号
QSG-070)。
ResponseControlKit
如果您不确定您的siRNA序列是否会诱发非特异性的IFN效应,则可用本试剂盒进行RealtimePCR验证;
同时检测PKR,OAS-1和hStat1三个IFN效应基因并提供GAPDH管家基因对照;
检测灵敏度高,结果直观且易于判断。
常备的RNAi管家基因Control试剂盒
上海吉玛制备了一些常用管家基因的RNAi实验ControlKits,以方便广大科研工作者开展RNAi实验。
详见上海吉玛产品目录荧光定量PCR分册C8页。
Ⅱ.siRNA设计
A.哺乳动物siRNA设计
哺乳动物siRNA设计需要注意的几个方面
基因抑制的有效性很大程度取决于目的基因1.从转录本(mRNA)的AUG起始密码开始,寻找“AA”二连序列,序列的选择。
目的序列可以随机选择也可以并记下其3'
端的19个碱基序列,作为潜在的siRNA靶位点。
正义链通过在目的基因的不同区域上测试不同的序和反义链都采用这19个碱基(不包括AA重复)来设计。
列以决定何种序列是最有效的。
2.避免在起始密码子或无义区域附近选择目的序列。
3.siRNA序列的GC含量应为30%-60%左右。
4.在设计siRNA时不要针对5'
和3'
端的非编码区(untranslatedregions,
UTRs),原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域,而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果。
5.将挑选的序列在公共数据库中进行比较以确保目的序列与其它基因没有同源性。
6.将潜在的序列和相应的基因组数据库(人,或者小鼠,大鼠等等)进行比较,排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。
例如使用
BLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。
7.选出合适的目标序列进行合成。
通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA,以找到最有效的siRNA序列。
8.阴性对照:
一个完整的siRNA实验应该有阴性对照,作为阴性对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成,但是和mRNA没有明显的同源性。
通常的做法是将选中的siRNA序列打乱,同样需要检查它和其他基因是否具有同源性。
9.有结果显示,UU结尾和dTdT结尾的siRNA在效果上没有区别,因为这个突出端无需和靶序列互补。
合成siRNA时可直接提供以AA打头的21个碱基序列。
B.上海吉玛siRNA产品特点
上海吉玛拥有处于国际领先水平的siRNA化学合成的全部核心技术,包括RNA单体合成、普通siRNA合成、化学修饰siRNA合成、荧光标记siRNA合成等。
siRNAoligo合成是在ISO9001质量标准及严格控制的流程和条件下完成的,确保了产品质量的高度稳定。
化学合成siRNA有操作简便、转染效率高、对细胞的或者组织的毒副作用小、可大规模制备等优点,特别适用于基因靶位点不确定情况下,进行siRNA有效片段的筛选。
化学修饰的siRNAOligo不仅增强了siRNA在血清、体内及细胞培养中的稳定性,同时也延长了siRNA的作用时间。
上海吉玛siRNA产品特性
质量控制
siRNAoligo合成是严格控制的流程和条件下完成的;
在ISO9000质量标准下生产;
产品经过分光光度计精确定量。
纯化
HPLC纯化;
全长双链siRNA含量>
97%
标记和修饰
在3'
和5'
末端标记生物素、荧光素和磷酸等更加方便监测siRNA的抑制特异基因表达的效果
长度
19~23碱基/链
储存和稳定性
建议在-20°
C的环境中存贮,避免多次冷冻和化冻处理。
上海吉玛保证在上述条件下寡核苷酸的稳定性可达到6个月,荧光标记的RNA必须避光保存。
技术数据表
技术数据表与siRNAoligo一同交付,包括名称、序列、浓度、OD和nmols的精确数量、纯化类型。
个性服务
按照客户要求分装;
免费设计服务。
C.siRNAoligo技术数据
与siRNA相关的一些技术数据及注意事项
1.siRNA的平均分子量13,300。
2.siRNAoligo的OD、nmol和质量间有相应的公式可以计算;
一般情况下,对于一个21bp的siRNAoligo,有如下简单关
系:
1ODduplex=3.0nmols=40ug
3.1OD的siRNA欲溶解为20uM的样品,可用150uLDEPC
H2O去重悬1OD的siRNA,溶解后为20uM的样品。
4.由于OligoRNA呈很轻的干膜状附在管壁上,打开时极易散失,所以打开管子前先离心,然后再慢慢打开管盖,溶解时请加足量DEPC水后盖上管盖,振荡溶解。
5.荧光标记的RNA,如FAM、HEX、TAMRA等标记的Oligo因为对光敏感,必须避光保存。
Ⅲ.siRNA对照
A.普通阴性对照
上海吉玛可提供与目的基因序列无同源性的通用阴性对照和将选中的siRNA序列打乱(scrambled)的普通阴性对照。
1.siRNA实验应该有阴性对照;
2.通用阴性对照为与目的基因的序列无同源性的普通阴性对照;
3.Scrambled阴性对照和选中的siRNA序列有相同的组成,但是和mRNA没有明显的同源性;
4.阴性对照需要确定和目的靶细胞中其它基因没有同源性。
B.荧光标记阴性对照
上海吉玛可提供与目的基因序列无同源性的荧光标记(6-FAM)通用阴性对照。
1.上海吉玛RNAinegativecontrol与哺乳动物基因无同源性;
2.通过标记荧光,可以方便地在荧光显微镜下观察转染情况;
3.可用于优化转染条件和评价转染效率;
4.具备很好的pH耐受性,在活细胞中更稳定。
C.siRNA阳性对照
阳性对照作为一个实验系统检查是很重上海吉玛可提供的siRNA阳性对照要的。
您可以利用阳性对照来确认RNAiLaminA/C
实验中转染、RNA提取和基因表达检测方GFP22法是可靠的。
D.转染试剂对照
成活率等细胞转染的各个因素影响。
E.避免Off-target对照
对于RNAi研究来说,在哺乳动物中,off-target效应是一个十分关注的问题。
有大量的报道,一个siRNA影响多个基因的表达。
因此,大量研究关注于用针对同一个基因的不同区域的多个siRNA进行实验,然后分析各自对基因表达效果的影响。
理想的结果是针对不同区域的siRNA对同一个靶基因产生相似的干扰效果。
上海吉玛公司的技术人员为您针对同一个靶基因设计多对siRNAoligos,为您解决off-target的难题。
对于一个完善的对照系统,转染试剂对照(Mocktransfection)是不可缺的。
转染试剂对照可以检测转染试剂对细胞的毒性、细胞的
Ⅳ.siRNA转染
A.siRNA转染的方法
哺乳动物转染的常见方法有:
磷酸钙共沉淀、电穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene、机械法(例如,显微注射和基因枪)、阳离子脂质体试剂,其中阳离子脂质体试剂转染法是目前最常用的转染方法。
应用脂质体型转染试剂进行转染需要注重的几个方面:
1.转染试剂的用量
2.siRNA的用量
3.转染时的细胞密度
4.转染时的操作顺序
5.细胞与转染试剂/siRNA复合物的温浴的时间
B.Lipofectamin2000转染试
剂
Lipofectamin2000的应用领域:
选择最适合的转染试剂和转染条件,往往取决于不同的哺乳动物细胞类型和不同的核酸分子。
Lipofectamin2000适用于核
酸的体内和体外操作,可应用于DNA、RNA、反义寡核苷酸、siRNA的转染,也可应用于DNA/siRNA的共转染操作;
是一种新型的高效siRNA转染试剂。
□原代培养细胞和转化细胞株的基因转染
□siRNA高通量转染试验
□DNA转染;
DNA和siRNA的共转染
□核酸(siRNA、DNA、RNA)的体内导入试验
□贴壁细胞和悬浮细胞转染
Lipofectamin2000的特点:
□不必更换培养基,操作简便易行,可在半小时内完成操作
□在含血清培养基中也能表现高转染效率
□细胞毒性低;
适用细胞广泛
□即用型试剂,可在含有抗生素的完全培养基中转染
□基于脂质的转染试剂,确保没有RNAse活性
□可介导siRNA高转染细胞及体内siRNA的高效导入
C.Lipofectamin2000适用的细胞类型
Lipofectamin2000转染试剂可广泛应用于多种细胞系的DNA和siRNA转染如:
HeLa(人颈部癌细胞)、MCF-7(人乳房癌细胞)、Hep3B(人肝细胞癌细胞)、COS-7(猴肾细胞)、Neuro-2a(鼠神经母细胞瘤细胞)、NIKS(人角质化细胞)、B16(鼠黑素瘤细胞)、DLD-1(人结肠癌细胞)、NIH/3T3(鼠胚胎成纤维细胞)、HT-29(人结肠腺癌细胞)、A549(人肺癌细胞)、CHO-k1(仓鼠卵巢细胞)和293(腺病毒5DNA转化的人胚胎肾细胞),SVRbag4细胞等。
D.转染前细胞培养
在细胞板上培养细胞时,应使细胞汇合在24小时内达到
70-90%。
细胞培养用品
表面积(mm2/孔)
细胞密度
培养基(μL/孔)
96孔板
50
1.5×
104-5.0×
104
100μL
48孔板
100
3.0×
104-1.0×
105
200μL
24孔板
200
8.0×
104-2.0×
500μL
12孔板
401
1.6×
105-4.0×
1.0mL
6孔板
962
105-8.0×
2.0mL
35mm
60mm
2827
1.0×
106-2.5×
106
6.0mL
E.合适的lipofectamin2000用量
合适的siRNA(DNA):
lipofetamin2000比例对核酸的高效
转染有重要影响;
我们推荐的DNA:
lipofetamin2000为1:
0.5—1:
5(ug:
ul),siRNA:
lipofectamin2000为1:
0.01-1:
0.1(pmol:
ul)一般情况下,此范围内都可获得高的转染效率。
siRNA/DNA
培养基最终体积
Lipofectamin2000(siRNA/DNA)
5pmol/0.2μg
0.25μl/0.5μl
20pmol/0.8μg
1μl/2μl
40pmol/1.6μg
1mL
2μl/4μl
100pmol/4.0μg
2mL
5μl/10μl
600pmol/8.0μg
5mL
10μl/20μl
F.贴壁细胞转染程序
1.转染前一天,4-5×
104细胞接种在24孔板上,0.5mL含FBS基。
和抗生素的DMEM(或Opti-MEM,其他培养基)细胞培养
选用生理状态良好的细胞对提高转染效率很2.选择用于初期接种的细胞数量,应能在24小时内使细胞汇合
重要。
siRNA(DNA)和lipofectamin的用量和
达到70-90%。
两者的比例可在推荐范围内适当调整。
3.在50μl的DMEM(或Opti-MEM,或其他无血清培养基)无血清培养基加入20pmolsiRNA(或0.8μgDNA),柔和混匀;
4.混匀lipofectamin试剂,用50μl无血清的DMEM或Opti-MEM,或其他无血清培养基)稀释1μllipofectamin试
剂(DNA转染时,则加入2μllipofectamin试剂),轻轻混匀,室温放置5分钟;
5.将稀释好的siRNA和RNAi-Mate试剂混合;
轻柔混匀,室温放置20分钟,以便形成siRNA/lipofectamin(或
DNA/lipofectamin)复合物。
6.将100μlsiRNA/lipofectamin(或DNA/lipofectamin)复合物
加到含有细胞和培养基的培养板的孔中,来回轻柔摇晃细胞培养板板。
7.细胞在CO2培养箱中37℃温育24h-48h后,进行转染后的其它检测步骤。
如果细胞株比较敏感,孵育4-6小时后,除去复合物,更换培养基。
G.悬浮细胞转染程序
1.转染的当天,收集细胞离心,用含FBS的培养基重悬。
2.在50μl的DMEM(或Opti-MEM,或其他无血清培养基)无
血清的培养基加入20pmolsiRNA(或0.8μgDNA),柔和混匀;
3.混匀lipofectamin试剂,用50μl无血清的DMEM或Opti-MEM,或其他无血清培养基)稀释1μllipofectamin试剂(DNA转染时,则加入2μllipofectamin试剂),轻轻混匀,室温放置5分钟;
4.将稀释好的siRNA和lipofectamin试剂混合;
5.再加入400μL细胞悬浮液(细胞数量决定于细胞类型和转染后分析测试的时间)。
6.细胞在CO2培养箱中37℃温育24h-48h后,进行转染后的其它检测步骤。
H.DNA和siRNA共转染细胞
1.在转染的前一天,4-5×
104细胞接种在24孔板上,0.5mL含
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