保护碱基添加总结.docx
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保护碱基添加总结
酶切位点保护碱基表6
酶
寡核苷酸序列
切割率%
2hr
20hr
PvuI
CCGATCGG
ATCGATCGAT
TCGCGATCGCGA
0
10
0
0
25
10
SacI
CGAGCTCG
10
10
SacII
GCCGCGGC
TCCCCGCGGGGA
0
50
0
>90
SalI
GTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC
GCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG
ACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA
0
10
10
0
50
75
ScaI
GAGTACTC
AAAAGTACTTTT
10
75
25
75
SmaI
CCCGGG
CCCCGGGG
CCCCCGGGGG
TCCCCCGGGGGA
0
0
10
>90
10
10
50
>90
SpeI
GACTAGTC
GGACTAGTCC
CGGACTAGTCCG
CTAGACTAGTCTAG
10
10
0
0
>90
>90
50
50
酶切位点保护碱基表2
关键词:
酶切位点保护碱基表2
酶
寡核苷酸序列
切割率%
2hr
20hr
NotI
TTGCGGCCGCAA
ATTTGCGGCCGCTTTA
AAATATGCGGCCGCTATAAA
ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTAT
AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAA
0
10
10
25
25
0
10
10
90
>90
NsiI
TGCATGCATGCA
CCAATGCATTGGTTCTGCAGTT
10
>90
>90
>90
PacI
TTAATTAA
GTTAATTAAC
CCTTAATTAAGG
0
0
0
0
25
>90
PmeI
GTTTAAAC
GGTTTAAACC
GGGTTTAAACCC
AGCTTTGTTTAAACGGCGCGCCGG
0
0
0
75
0
25
50
>90
PstI
GCTGCAGC
TGCACTGCAGTGCA
AACTGCAGAACCAATGCATTGG
AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA
CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT
0
10
>90
>90
0
0
10
>90
>90
0
PvuI
CCGATCGG
ATCGATCGAT
TCGCGATCGCGA
0
10
0
0
25
10
SacI
CGAGCTCG
10
10
SacII
GCCGCGGC
TCCCCGCGGGGA
0
50
0
>90
SalI
GTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC
GCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG
ACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA
0
10
10
0
50
75
ScaI
GAGTACTC
AAAAGTACTTTT
10
75
25
75
SmaI
CCCGGG
CCCCGGGG
CCCCCGGGGG
TCCCCCGGGGGA
0
0
10
>90
10
10
50
>90
SpeI
GACTAGTC
GGACTAGTCC
CGGACTAGTCCG
CTAGACTAGTCTAG
10
10
0
0
>90
>90
50
50
SphI
GGCATGCC
CATGCATGCATG
ACATGCATGCATGT
0
0
10
0
25
50
StuI
AAGGCCTT
GAAGGCCTTC
AAAAGGCCTTTT
>90
>90
>90
>90
>90
>90
XbaI
CTCTAGAG
GCTCTAGAGC
TGCTCTAGAGCA
CTAGTCTAGACTAG
0
>90
75
75
0
>90
>90
>90
XhoI
CCTCGAGG
CCCTCGAGGG
CCGCTCGAGCGG
0
10
10
0
25
75
XmaI
CCCCGGGG
CCCCCGGGGG
CCCCCCGGGGGG
TCCCCCCGGGGGGA
0
25
50
>90
0
75
>90
>90
酶
寡核苷酸序列
切割率%
2hr
20hr
AccI
GGTCGACC
CGGTCGACCG
CCGGTCGACCGG
0
0
0
0
0
0
AflIII
CACATGTG
CCACATGTGG
CCCACATGTGGG
0
>90
>90
0
>90
>90
AscI
GGCGCGCC
AGGCGCGCCT
TTGGCGCGCCAA
>90
>90
>90
>90
>90
>90
AvaI
CCCCGGGG
CCCCCGGGGG
TCCCCCGGGGGA
50
>90
>90
>90
>90
>90
BamHI
CGGATCCG
CGGGATCCCG
CGCGGATCCGCG
10
>90
>90
25
>90
>90
BglII
CAGATCTG
GAAGATCTTC
GGAAGATCTTCC
0
75
25
0
>90
>90
BssHII
GGCGCGCC
AGGCGCGCCT
TTGGCGCGCCAA
0
0
50
0
0
>90
BstEII
GGGT(A/T)ACCC
0
10
BstXI
AACTGCAGAACCAATGCATTGG
AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA
CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT
0
25
25
0
50
>90
ClaI
CATCGATG
GATCGATC
CCATCGATGG
CCCATCGATGGG
0
0
>90
50
0
0
>90
50
EcoRI
GGAATTCC
CGGAATTCCG
CCGGAATTCCGG
>90
>90
>90
>90
>90
>90
HaeIII
GGGGCCCC
AGCGGCCGCT
TTGCGGCCGCAA
>90
>90
>90
>90
>90
>90
HindIII
CAAGCTTG
CCAAGCTTGG
CCCAAGCTTGGG
0
0
10
0
0
75
KpnI
GGGTACCC
GGGGTACCCC
CGGGGTACCCCG
0
>90
>90
0
>90
>90
MluI
GACGCGTC
CGACGCGTCG
0
25
0
50
NcoI
CCCATGGG
CATGCCATGGCATG
0
50
0
75
PCR引物设计原则
信息来源:
本站原创 更新时间:
2004-12-210:
44:
00
PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段,使其能有效地扩增模板DNA序列。
因此,引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。
要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。
同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。
如这个区域单链能形成二级结构,就要避开它。
如这一段不能形成二级结构,那就可以在这一区域设计引物。
现在可以在这一保守区域里设计一对引物。
一般引物长度为15~30碱基,扩增片段长度为100~600碱基对。
让我们先看看P1引物。
一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%。
而且四种碱基的分布最好随机。
不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。
否则P1引物设计的就不合理。
应重新寻找区域设计引物。
同时引物之间也不能有互补性,一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补。
引物确定以后,可以对引物进行必要的修饰,例如可以在引物的5′端加酶切位点序列;标记生物素、荧光素、地高辛等,这对扩增的特异性影响不大。
但3′端绝对不能进行任何修饰,因为引物的延伸是从3′端开始的。
这里还需提醒的是3′端不要终止于密码子的第3位,因为密码子第3位易发生简并,会影响扩增的特异性与效率。
综上所述我们可以归纳十条PCR引物的设计原则:
①引物应用核酸系列保守区设计并具有特异性。
②产物不能形成二级结构。
③引物长度一般在15~30碱基之间。
④G+C含量在40%~60%之间。
⑤碱基要随机分布。
⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。
⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。
⑧引物5′端可以修饰。
⑨引物3′端不可修饰。
⑩引物3′端要避开密码子的第3位。
PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段,使其能有效地扩增模板DNA序列。
如前述,引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。
对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功,但遵循某些原则,则有助于引物的设计。
1.引物的特异性
引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。
2.避开产物的二级结构区
某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响,选择扩增片段时最好避开二级结构区域。
用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构,有助于选择模板。
实验表明,待扩区域自由能(△G°)小于58.6lkJ/mol时,扩增往往不能成功。
若不能避开这一区域时,用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。
3.长度
寡核苷酸引物长度为15~30bp,一般为20~27mer。
引物的有效长度:
Ln=2(G+C)+(A+T+,Ln值不能大于38,因为>38时,最适延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度(74℃),不能保证产物的特异性。
4.G+C含量
G+C含量一般为40%~60%。
其Tm值是寡核苷酸的解链温度,即在一定盐浓度条件下,50%寡核苷酸双链解链的温度,有效启动温度,一般高于Tm值5~10℃。
若按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估计引物的Tm值,则有效引物的Tm为55~80℃,其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。
5.碱基础随机分布
引物中四种碱基的分布最好是随机的,不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。
尤其3′端不应超过3个连续的G或C,因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。
6.引物自身
引物自身不应存在互补序列,否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。
这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。
若用人工判断,引物自身连续互补碱基不能大于3bp。
7.引物之间
两引物之间不应不互补性,尤应避免3′端的互补重
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- 保护 碱基 添加 总结