大学动物植物细胞工程 +植物细胞工程文档格式.docx
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原因:
每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质,都有发育成为完整个体所必需的全部基因
外延:
每一个活细胞都因该具有全能性。
受精卵的全能性最高。
生殖细胞分化程度很高,但仍然具有全能性——孤雌生殖。
体细胞的全能性比生殖细胞的全能性低的多。
生物体内细胞并没有表现出全能性,而是表现出基因的选择性表达
表现:
孤雌生殖:
有一个卵细胞分化形成各种类型细胞,如:
雄蜂、雄蚁
离体组织:
外界条件(营养、激素、其他条件)适宜形成小植株,表现出全能性
2.植物组织培养
(1)培养基:
成分
主要内容
作用
水
水(H2O)
为细胞代谢提供条件,参与细胞代谢
无机盐
大量元素:
N、P、S、K、Ca、Mg
微量元素:
Fe、Mn、Mo、B、Cu、Zn
满足植物对各矿质元素的需求,参与各种物质合成、代谢调节,生长必需
碳源
蔗糖
重要营养成分:
愈伤组织不光合,利用蔗糖异养生活
大气CO2
重要碳源:
完成组织分化,形成营养器官后,叶片能进行光合自养
氮原
NH4+、NO3—
合成核酸、蛋白质、辅酶、核苷酸等
生长因子
细胞分裂素、生长素
必不可少的调节物质:
诱导脱分化形成愈伤组织,诱导愈伤组织再分化成植株
维生素
明显促进离体组织的生长
状态
固体培养基或半固体培养基
形成植物地上、地下部分,利于生长
培养要求
无菌操作条件
常温培养
光照条件
更换培养基
细菌繁殖速度快,会产生污染
植物细胞在常温下生长正常
满足愈伤组织,及植株的光照需求
防止代谢废物积累,满足营养需求
(2)过程:
脱分化:
高度分化的植物器官、组织或细胞产生愈伤组织的过程
再分化:
愈伤组织继续培养,重新分化成根或芽等器官的过程
愈伤组织:
排列疏松、无规则,高度液泡化的无定型状态的薄壁细胞
激素使用:
①能强烈刺激愈伤组织的形成(细胞分裂素、生长素共同使用)
②影响再分化过程中根和芽的发生
细胞分裂素、生长素浓度比
应用:
<
1>
快速繁殖、培育无病毒植株
2>
细胞培养生产药物、食品添加剂、香料、色素、杀虫剂(发酵罐中诱导分离的愈伤组织)
3>
人工种子:
胚状体+人工种皮
4>
转基因植物的培育
3.3.
植物体细胞杂交
(1)来自两个不同植物的体细胞融合成一个杂种细胞(植物细胞融合)
(2)把杂种细胞培育成植株(植物组织培养)
过程:
4.植物细胞杂交与传统细胞杂交比较:
传统杂交
细胞杂交
依据
杂种优势
细胞全能性、原生质体融合
过程
自然发生,在母体完成胚发育
人工诱导融合,需组织培养
本质
精、卵两种生殖细胞结合,完成遗传物质的重新组合
不同生物的体细胞融合,完成和遗传物质的融合
优点
杂种第一代生长整齐、植株健壮、产量高、抗虫抗病能力强
克服远源杂交不亲和障碍,实现不同种间的杂交
缺点
存在生殖隔离;
杂种第二代会出现生长不齐、产量下降等现象
很多理论、技术问题未解决,距离推广应用有一定差距
目的
获得杂种优势,提高产量
获得优良性状
意义
自然发生、方便生产
扩展了用于杂交的亲本组合
应用范围
种内
种内、种间均可
(三)动物细胞工程:
A.动物细胞培养
1.培养基:
状态液体培养液动物细胞生活的液体环境
成分葡萄糖满足能量需求、作为细胞碳源
氨基酸合成蛋白质
无机盐重要的细胞组成物质
维生素、动物血清等生长调节作用
条件恒温动物细胞生长温度
无菌条件防止微生物污染
2.2.
过程:
幼龄动物组织
剪碎组织
胰蛋白酶处理
细胞培养(培养瓶)
3.概念:
原代培养:
将动物组织用胰蛋白酶处理成单个细胞,配制成一定浓度的悬浮液,放入培养瓶中在培养箱中培养的过程
传代培养:
培养瓶中的细胞越来越多,用胰蛋白酶处理使细胞从瓶壁上脱离下来,配制成悬浮液,分瓶培养的过程
细胞株:
原代培养细胞传至10代左右就不容易传下去,细胞生长停滞,大部分细胞衰老死亡,少数细胞能存活传到40~50代,这部分细胞称为细胞株
细胞系:
细胞株传到50左右不能再继续传代,部分细胞遗传物质改变,具有癌变细胞的特点,可以在培养条件下无限制的传代下去,这部分细胞称为细胞系
4.生长特点:
(1)贴壁生长:
培养瓶中的悬浮液细胞,紧贴培养瓶内壁才能生长
(2)接触抑制:
当培养瓶中内壁生长细胞彼此紧密接触时,细胞不再分裂
5.应用:
(1)生产有重要价值的蛋白质产品分泌性的蛋白质产品
(2)培养皮肤细胞用于移植形成组织
(3)检测有毒物质致癌致畸引起染色体数目和结构改变
(4)理论研究培养正常或异常细胞用于生理、病理、药理研究
B.单克隆抗体
单个B淋巴细胞进行无性繁殖获得的细胞群,产生化学性质单一,物质特异性强的抗体
基本原理:
(1)一种淋巴细胞克隆只产生一种特异性抗体
(2)细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可以保持亲代双方的特性
(3)杂交瘤细胞的筛选,体外培养大量增殖,获得所需抗体
优点:
项目
分泌
特点
生产
单克隆抗体
杂交瘤细胞
特异性强、灵敏度高
产量高,易纯化分离
常规抗体
各淋巴B细胞
特异性差、灵敏度低
产量低,分离困难
细胞来源:
B淋巴细胞能产生特异性强抗体,在体外不能无限繁殖
骨髓瘤细胞不产生专一性强抗体,体外能无限繁殖
制备过程:
(1)理论研究中具有重要意义
(2)用于疾病的诊断、治疗、预防
单抗诊断试剂盒简单、快速、准确
生物导弹定向消灭癌细胞,不损伤健康细胞
C.哺乳动物胚胎移植,核移植
胚胎移植:
动物
排卵
体外受精
胚胎
母牛子宫
试管牛
(激素处理)(激素处理)
核移植:
克隆动物
鲤鲫(兼有鲤鱼、鲫鱼特点,具有正常生殖能力)
D.动物细胞培养、植物细胞培养比较:
植物细胞培养
原理
细胞的增殖
细胞的全能性
细胞来源
胚胎或幼龄动物组织或器官
离体植物器官、组织或细胞
培养
基
液体
固体
天然培养基
合成培养基
组成
葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清
矿质元素、蔗糖、维生素、植物激素、有机添加物
器皿
培养瓶
锥形瓶
原代生长,传代生长
更换培养基,细胞增值分化
生长特点
贴壁生长,细胞增值不分化
诱导形成愈伤组织,细胞增值分化
细胞进行异养需氧代谢
接种前处理
灭菌、用胰蛋白酶使组织分散成单个细胞
灭菌
培养条件
恒温、无菌、无需光照
常温、无菌、光照条件
培养目的
1.生产蛋白质生物制品
2.获取大量细胞
3.检测有毒物质
1.1.
快速繁育无病毒植株
生产药物、食品添加剂、香料、色素、杀虫剂等
培养结果
细胞株→细胞系
愈伤组织→植株
五.
学习指导:
1.植物组织培养培养基含有植物生长发育所需要的各种营养物质(各种无机盐、有机成分,维生素、植物激素等),这些营养成分同时也是细菌等微生物的营养,但细菌生长、繁殖更快,在培养过程中要求消毒、灭菌,保持无菌状态
2.植物细胞融合是用酶解法去掉细胞壁,植物细胞被诱导膜融合后,在第一次分裂时才进行核融合,形成新的细胞壁是成为完整的融合杂种细胞
3.植物细胞的全能性是植物组织培养的基础,受精卵的全能性最高,生殖细胞的全能性比体细胞的全能性高;
形成层细胞具有分裂能力,通常切取有形成层的部分作为外植体培养,容易成功
4.伤组织的形成和形态发生是植物组培的主要目标,愈伤组织的形成需要有外界刺激因素和激素诱导
5.植物的种类不同、器官的来源及生理状况不同外植体脱分化的难易程度不同;
愈伤组织特点:
细胞分裂快,结构疏松、颜色浅、透明、高度液泡化的薄壁细胞;
愈伤组织细胞在一定的外界条件下才会再分化,产生芽和根,进而发育成植株
6.动物细胞工程的技术基础是动物细胞培养,通常用动物细胞培养获取分泌型蛋白
7.体内的每一种B淋巴细胞只能产生一种抗体,一个B淋巴细胞不能在体外培养条件下无限繁殖,在进行淋巴B细胞筛选时首先要对动物进行免疫,使其产生相应的B淋巴细胞
8.骨髓瘤细胞在体外条件下可以无限繁殖,能产生抗体在但是特异性差,结合能力差;
杂交瘤细胞既能产生特异性抗体,在体外条件下可以无限繁殖,具备B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的特点,用于单克隆抗体的生产
9.哺乳动物的胚胎移植,在体外完成受精作用和早期的胚胎发育,然后将早期的胚胎转移到母体的子宫发育,试管动物是指的体外受精和早期胚胎发育生物
10.核移植动物是动物克隆技术的基础,克隆羊供移植的核来自高度分化的体细胞
名词
1、原生质体融合(体细胞杂交):
是指通过物理方法或化学方法使原生质体融合经培养获得具有双亲全部(或部分)遗传物质的后代的方法
2、植物遗传转化:
是指利用分子生物学的手段通过载体或物理、化学方法将外源基因DNA导入受体植物细胞,并整合到植物基因组中,使外源基因在植物细胞中得以表达和稳定遗传,获得人们所需要的具有新的性状特征的转基因植株的技术
3、微型质粒:
一般作为目的基因的植物表达载体,需要根据中间载体的要求对原始的Ti质粒进行改造,切除了对转移没有作用的部分,分子质量较小,故称为微型Ti质粒
4、载体卡盒:
是将标记基因、多克隆位点、细菌标记基因和光谱的质粒复制起始位点等聚为一体的载体系统。
构建完整的载体卡盒在某种条件下可以直接插入(或是替换)外源基因,简化植物表达载体的构建工作,应用起来比较方便。
5、植物细胞悬浮培养:
指将植物的细胞或小的细胞聚集体,以一定的细胞密度悬浮在液体培养基中进行培养,使之在体外生长发育,并在培养过程中保持很好的分散性。
6、有丝分裂指数:
有丝分裂的细胞占总细胞的百分数。
有丝分裂指数只反映群体中每个细胞用于分裂所需时间的平均值,还反映细胞分裂的同步化程度。
7、饲养层培养:
把用X射线处理的细胞作为培养的条件因子,包埋在培养基中作为饲养层细胞,促进细胞分裂提高植板率的技术。
8、种子资源离体保存:
指对离体培养的小植株、器官、组织、细胞和原生质体等材料,采用限制、延缓或停止其生长的处理使之保存,在需要时可重新恢复其生长,并再生植株的方法。
9.图位克隆:
定位+克隆利用这些标记就可以把目的基因定位在某一个染色体的某段区域内。
然后利用染色体步移技术逐步靠近并最终克隆目的基因
10、Ω元件是烟草花叶病毒基因翻译起始位点上游一段核苷酸序列,作为增强子能有效提高基因的翻译活性。
(名词)
11、酵母双杂交系统:
是用来分离与已知蛋白相互作用的未知蛋白,或者用来检测两种蛋白是否相互作用的系统。
填空
1、原生质体培养方法:
(固体平板培养法)(液体浅层培养法)(固液结合培养法)
2、细胞融合的方式可分为(对称融合)(不对称融合)和(微原生质体融合)
3、1994年,首例转基因植物产品-------晚熟番茄。
4、目前在植物表达载体中广泛应用的启动子有三种类型:
组成型启动子、诱导型启动子、组织特异型启动子。
5、利用植物病毒构建表达载体可以采用四种方法:
基因置换、基因插入、基因互补、表位展示。
6、Ti质粒可分四个功能区(填图)
⑴T-DNA区⑵Vir区⑶Con区⑷Ori区
7、在次生物质生产中含氮化合物的数量和种类对次生物质的形成有很大影响,无机磷酸盐的消耗很快
8、培养细胞的起始密度:
103-105
9、影响生长周期长短的主要因素:
细胞起始密度
10、悬浮细胞的测定方法:
细胞计数、细胞密实体积的测定、细胞干重和鲜重的测定、有丝分裂指数的测定
11、连续培养分为封闭式连续培养,开放式连续培养
12、单细胞培养方法:
平板培养、看护培养、微室培养、饲养层培养、双层滤纸植板技术
13.真核基因包括转录区和非转录区两部分。
转录区包括转录起始位点、起始密码子、外显子、内含子、终止密码子和poly(A)信号。
其中,翻译成蛋白质的部分(从翻译起始密码子ATG开始至翻译终止密码子)被称为开放读码框;
非转录区包括启动子、终止子、调控序列。
14.真核生物加尾信号序列:
AATAAA
15.抑制性消减杂交:
原理---杂交动力学,即丰度高的mRNA同源杂交的速度远远高于丰度低的mRNA同源杂交速度,从而抑制非目的基因的扩增。
16.目前蛋白质组学所应用的基本技术是蛋白质双向电泳技术和质谱技术。
双向电泳技术由等电聚焦(IEF)电泳和SDS聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)电泳共同组成。
17.限制性核酸内切酶及DNA连接酶的发现为基因的分子操作提供了工具。
18.世界第一例转基因植物:
烟草第一例转基因食品:
晚熟的西红柿
19.基因表达调控的不同水平
(1).基因组水平细胞质细胞核
基因扩增(很少)
DNA重排
染色质解聚
可被表达的DNA
(2)转录水平RNA聚合酶II
基本的mRNA转录子
(3)mRNA加工和转位水平mRNA加工(加帽、加尾、拼接)和是否降解
细胞核中的mRNA
mRNA通过核孔转运到细胞质
细胞质
(4)翻译水平细胞质中的mRNA
mRNA降解
翻译,可能定位到核糖体
在细胞质或核糖体中的多肽链
(5)翻译后水平蛋白折叠或组装
蛋白剪切
蛋白修饰蛋白进入细胞器
功能蛋白
蛋白降解
20、体细胞杂种选择是要采取有效的方法将异核体和真正的杂种植株选出来
21、植物表达载体要求三点:
(填空)
⑴在T-DNA区内含有外源基因的嵌合基因和筛选标记基因的嵌合基因
⑵大肠杆菌的复制起始位点
⑶细菌的筛选标记基因
25、各种植物转化系统及相应转化方法(填空)
转化系统名称
载体
转化原理
转化方法
受体材料
种质转化系统
生殖细胞
花粉粒
花粉管通道法
细胞
卵细胞
种子浸泡法
原生质体
直接转化系统
无需载体
化学原理
聚乙二醇法
脂质体法
物理原理
显微注射法
电激法
各种受体
基因枪法
载体转化系统
病毒
DNA
RNA
叶盘法
原生质体共培养法
共感染法
农杆菌
Ri质粒
Ti质粒
22、植物细胞悬浮培养特点:
1.细胞通过悬浮培养能产生大量的比较均一的细胞;
(填空、选择)
2.悬浮细胞增殖的速度比愈伤组织快,适合大规模培养。
23..转基因生物安全性评价(填空)
(1)中间试验——生存竞争、遗传稳定性、性状
(2)环境释放——(漂移、杂草化、靶标、非靶标、生态环境)
(3)生产性试验——食品安全
24、转化受体系统的类型:
⑴愈伤组织再生系统⑵直接分化再生系统⑶原生质体再生系统⑷胚状体再生系统
⑸生殖细胞再生系统
选择
1、正选择法:
一般抗性细胞突变体的筛选用正选择法
负选择法:
适用于营养缺陷型细胞突变体的筛选
2.蛋白质组学:
指的是对细胞内所有蛋白质进行系统分析的科学。
3持家基因:
常作为对照基因用于比较其他基因的表达水平。
4、删除选择标记基因的技术:
共转化技术、重组酶系统(位点特异性重组)、转座子方法
5、转基因沉默可发生在染色体DNA、转录和转录后3种层次上。
根据作用机制和水平不同可分为3种:
位置效应、转录水平的转基因沉默和转录水平后的转基因沉默
6、转录水平的转基因沉默的原因:
⑴转基因及其启动子甲基化⑵外源基因的拷贝数⑶同源基因间的反式失活
7、目前研究用于植物基因转化的病毒载体系统有三种:
单链RNA植物病毒载体系统、单链DNA植物病毒载体系统、双链DNA植物病毒载体系统
8、选择标记基因按照基因产物作用的机理,选择标记基因可以分为抗生素抗性型、除草剂抗性型和非植物生长调节剂依赖性。
9、报告基因:
是一类编码可被迅速检测的蛋白质或酶的基因。
报告基因有:
绿色荧光蛋白(GFP)葡萄苷酸酶(GUS)氯霉素乙酰转移酶(CAT)
冠瘿碱合成酶基因(胭脂碱合成酶基因nos,章鱼碱合成酶基因ocs)
10、外源蛋白在一个相对稳定的环境中产生积累包括:
叶绿体、内质网、液泡。
Wandelt等和Schouten等将内质网定位序列(四肽KDEL的编码序列)与外源蛋白基因相连,发现外源蛋白在转基因植物中的含量有了显著提高。
可在外源基因上连接适当的定位信号序列,使外源蛋白产生后定向运输到质体内,需采取措施保证外源蛋白运输到一个相对稳定的环境中,以提高外源蛋白的稳定性和积累量
11.启动子:
TATA盒:
转录起始复合体的结合位点。
CAAT盒:
促进转录起始复合体的组装
12、
简答
一、葡萄叶片原生质体分离用酶液组合(必考)
MaceozymeR-10
降解果胶酯
CellulaseOnozukaRs
降解纤维素
MES(PH缓冲剂)
稳定PH值,5.6
CaCl2•2H2O
稳定质膜透性(提高膜的钙含量)
甘露醇
稳定渗透压
葡萄糖硫酸钾
稳定质膜透性(抑制酶液中某些酶的活性)
二、转基因植株的检测及遗传稳定分析:
⑴分子生物学检测①PCR检测:
外源基因是否转入
②SouthernBlot:
外源基因是否整合及拷贝数
③RT-PCR/NorthernBlot:
外源基因是否转录及表达量
④WesternBlot:
外源基因是否表达及蛋白质含量
⑵目的性状检测①生理生化指标检测
②生物学鉴定法a、生长状态b、农艺性状c、产量性状d、品质性状
⑶遗传稳定性分析①获得纯合体
②是否稳定遗传
③遗传规律
三、选择转化系统的原则:
⑴对于农杆菌敏感的植物应优先选择农杆菌介导法
⑵原声质体培养容易的植株应该选择直接转化系统
⑶转化难度大(对农杆菌不敏感,并且原生质体培养困难)的植物,应采取基因枪法
⑷多胚珠植物可试用花粉管通道法;
子房中有较大单培珠的植物可试用子房微注射法
⑸根据受体植物的再生情况选择合适的转化方法
四、选择标记基因和报告基因的选择策略:
(1)根据选择剂的敏感度选择合适的选择标记基因(抗生素抗性基因)
(2)考虑选择的时期
(3)考虑转基因安全的问题
(4)报告基因的选择要依研究目的、内容和方法而定
五、植物细胞悬浮培养意义:
1.为植物遗传工程研究提供了理想的材料和途径;
2.是一个理想的突变体选择系统;
3.为植物的原生质体培养提供了理想的材料和途径;
4.进行多倍体的诱导,从而应用于植物的倍性育种上;
5.研究代谢物的生物合成;
6.用于人工种子的生产。
六、悬浮细胞同步化的方法
1.物理方法
体积选择法:
利用不同孔径的尼龙网,并利用不连续密度梯度离心获得形态大小一致的细胞。
(过筛、不连续离心、纯化)
冷处理法:
使用冷处理和营养饥饿相结合的方法使细胞同步化(使细胞同时开始分裂)
2.化学方法:
饥饿法(营养饥饿、生长素饥饿)
抑制法:
使用DNA合成抑制剂使细胞积累在某一特定时期(G1、S期的边界上),解除抑制使细胞同时分裂
3.有丝分裂抑制法:
在纺锤体形成时利用秋水仙碱阻止细胞使其停留在分列中期。
七、利用细胞工程如何获得突变体?
(简答)
1.细胞材料配备
1起始材料的选择
②细胞的分离:
通过细胞悬浮培养和单细胞培养分离和培养细胞
2..诱变处理采用物理和化学诱变
3细胞水平的突变体筛选直接筛选法和间接筛选法
4.突变细胞的植株再生
5.再生植株的鉴定:
八、农杆菌介导遗传转化流程及注意事项(必考简答)
⒈目的基因分离及载体构建
⒉受体材料的选择及预培养
⒊农杆菌的活化OD600=0.5~0.7
⒋侵染
⒌共培养农杆菌附着Vir基因活化T-DNA转移T-DNA整合
⒍除菌杀死或抑制农杆菌生长
⒎选择(筛选)
论述
一、如何提高外源基因的转录效率?
⒈在转录水平上提高转录活性
①启动子增强子加尾信号的应用
根据受体植株的类型研究目的及其特点选择合适类型的启动子并配套使用增强子,以及添加加尾信号AATAAA、AATTAA、AACCAA
②MAR(核基质结合区)的应用
通过MAR-gene-MAR的方式使外源基因在核基质相对独立的区域内转录,提高转录效率
⒉提高外源基因的翻译水平
⑴添加5端到3端非翻译序列
⑵优化起始密码周边序列
Kozak序列植物起始密码子周边序列ACCAUGGC
⑶对基因编码区加以改造
1根据密码子偏爱性对基因进行改造
2更改编码区GC含量
⑷利用叶绿体转化系统
在基因的两端加上叶绿体同源片段,通过同源重组的方式,将基因重组到同源片段之间
二、野生型Ti质粒具有不利于直接应用的缺点,在植物基因工程中如何应用农杆菌Ti质粒?
⑴一般采用二元载体系统进行农杆菌介导转化。
由于双元载体系统的T-DNA和Vir区在两个独立的质粒上,通过反式激活T-DNA转移,称双元载体又称反式载体。
其中一个质粒的作用是在有诱导物诱导时表达Vir区基因,激活T-DNA的转移,故称为辅助Ti质粒。
另一个质粒是含有T-DNA的质粒,分子质量较小,故称为微型Ti质粒。
⑵在构建表达载体时,是利用体外DNA重组技术将外源基因和选择标记基因构建在微型Ti质粒上的T-DNA左右边界间,然后用三亲本杂交法或冻融法将重组微型Ti质粒转移到含辅助Ti质粒的根癌农杆菌内,可用于农杆菌介导的转化
三、.植物基因克隆与分离的方法(论述)
㈠、利用基因已知序
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