拉曼光谱技术概述及应用Word格式文档下载.docx

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拉曼光谱最初用的光源是聚焦的日光，后来使用汞弧灯。

在随后的几十年内，由于拉曼散射光的强度很弱，激发光源（汞弧灯）的能量低等困难，它在相当长一段时间里未能真正成为一种有实际应用价值的工具。

自从傅立叶变换拉曼光谱技术、表面增强拉曼光谱技术、激光共振拉曼光谱、共焦显微拉曼光谱、高温拉曼光谱技术、拉曼光谱与光导纤维技术的联用、固体光声拉曼技术、拉曼光谱与其它光谱的联用等技术的出现，才使得拉曼光谱的应用范围更加广阔。

目前拉曼光谱已广泛应用于材料、化工、石油、高分子、生物、环保、地质等领域。

具体来说，可用于聚合物的研究、生物大分子的研究、多肽及蛋白质的构型的研究、无机物及金属配合物的研究、以及在文物考古中的应用、宝石鉴定中的应用、公安与法学样品分析中的应用、无机材料中的应用矿床学中的应用、癌症检测中的应用等。

就分析测试而言，拉曼光谱技术和红外光谱技术相配合使用

可以为更加全面地研究分子的振动状态提供更多的分子结构方面的信息。

一、拉曼光谱的发展简史

　　印度物理学家拉曼于1928年用水银灯照射苯液体,发现了新的辐射谱线:

在入射光频率ω0的两边出现呈对称分布的,频率为ω0-ω和ω0+ω的明锐边带,这是属于一种新的分子辐射,称为拉曼散射,其中ω是介质的元激发频率。

与此同时,前苏联兰茨堡格和曼德尔斯塔报导在石英晶体中发现了类似的现象,即由光学声子引起的拉曼散射,称之谓并合散射。

然而到1940年,拉曼光谱的地位一落千丈。

主要是因为拉曼效应太弱（约为入射光强的10-6）,人们难以观测研究较弱的拉曼散射信号,更谈不上测量研究二级以上的高阶拉曼散射效应。

并要求被测样品的体积必须足够大、无色、无尘埃、无荧光等等。

所以到40年代中期,红外技术的进步和商品化更使拉曼光谱的应用一度衰落。

1960年以后,红宝石激光器的出现,使得拉曼散射的研究进入了一个全新的时期。

由于激光器的单色性好,方向性强,功率密度高,用它作为激发光源,大大提高了激发效率。

成为拉曼光谱的理想光源。

随探测技术的改进和对被测样品要求的降低,目前在物理、化学、医药、工业等各个领域拉曼光谱得到了广泛的应用,越来越受研究者的重视。

　　70年代中期,激光拉曼探针的出现,给微区分析注人活力。

80年代以来,美国Spex公司和英国Rrinshow公司相继推出,拉曼探针共焦激光拉曼光谱仪,由于采用了凹陷滤波器（notchfilter）来过滤掉激发光,使杂散光得到抑制,这样入射光的功率可以很低,灵敏度得到很大的提高。

二、拉曼光谱简介

拉曼光谱（Ramanspectra），是一种散射光谱。

拉曼光谱分析法是基于印度科学家C.V.拉曼（Raman）所发现的拉曼散射效应，对与入射光频率不同的散射光谱进行分析以得到分子振动、转动方面信息，并应用于分子结构研究的一种分析方法。

1.拉曼光谱原理及特征

　　拉曼光谱是一种散射光谱，拉曼散射是光照射到物质上发生的非弹性散射所产生的。

单色光束的入射光光子与分子相互作用时可发生弹性碰撞和非弹性碰撞，在弹性碰撞过程中，光子与分子间没有能量交换，光子只改变运动方向而不改变频率，这种散射过程称为瑞利散射。

而在非弹性碰撞过程中,光子与分子之间发生能量交换，光子不仅仅改变运动方向，同时光子的一部分能量传递给分子，或者分子的振动和转动能量传递给光子，从而改变了光子的频率，这种散射过程称为拉曼散射。

拉曼散射分为斯托克斯散射和反斯托克斯散射，通常的拉曼实验检测到的是斯托克斯散射，拉曼散射光和瑞利光的频率之差值称为拉曼位移。

拉曼位移就是分子振动或转动频率，它与入射线频率无关，而与分子结构有关。

每一种物质有自己的特征拉曼光谱，拉曼谱线的数目、位移值的大小和谱带的强度等都与物质分子振动和转动能级有关。

2.拉曼散射的产生

　　光子和样品分子之间的作用可以从能级之间的跃迁来分析。

样品分子处于电子能级和振动能级的基态,入射光子的能量远大于振动能级跃迁所需要的能量,但又不足以将分子激发到电子能级激发态。

这样,样品分子吸收光子后到达一种准激发状态,又称为虚能态。

样品分子在准激发态时是不稳定的,它将回到电子能级的基态。

若分子回到电子能级基态中的振动能级基态,则光子的能量未发生改变,发生瑞利散射。

如果样品分子回到电子能级基态中的较高振动能级即某些振动激发态,则散射的光子能量小于入射光子的能量,其波长大于入射光。

这时散射光谱的瑞利散射谱线较低频率侧将出现一根拉曼散射光的谱线,称为Stokes线。

如果样品分子在与入射光子作用前的瞬间不是处于电子能级基态的最低振动能级,而是处于电子能级基态中的某个振动能级激发态,则入射光光子作用使之跃迁到准激发态后,该分子退激回到电子能级基态的振动能级基态,这样散射光能量大于入射光子能量,其谱线位于瑞利谱线的高频侧,称为anti-Stokes线。

Stokes线和anti-Stokes线位于瑞利谱线两侧,间距相等。

Stokes线和anti-Stokes线统称为拉曼谱线。

由于振动能级间距还是比较大的,因此,根据波尔兹曼定律,在室温下,分子绝大多数处于振动能级基态,所以Stokes线的强度远远强于anti-Stokes线。

拉曼光谱仪一般记录的都只是Stokes线。

3.拉曼散射光谱的特征

（1）拉曼散射谱线的波数虽然随入射光的波数而不同，但对同一样品，同一拉曼谱线的位移与入射光的波长无关,只和样品的振动转动能级有关。

（2）在以波数为变量的拉曼光谱图上，斯托克斯线和反斯托克斯线对称地分布在瑞利散射线两侧,这是由于在上述两种情况下分别相应于得到或失去了一个振动量子的能量。

（3）一般情况下，斯托克斯线比反斯托克斯线的强度大。

这是由于Boltzmann分布，处于振动基态上的粒子数远大于处于振动激发态上的粒子数。

4、拉曼光谱技术的优越性

拉曼光谱要的是无损伤的定性定量分析，它无需样品准备，样品可直接通过光纤探头或者通过玻璃、石英、和光纤测量。

其该技术的优越性主要有以下几点:

（1）由于水的拉曼散射很微弱，拉曼光谱是研究水溶液中的生物样品和化学化合物的理想工具。

（2）拉曼一次可以同时覆盖50-4000波数的区间，可对有机物及无机物进行分析。

相反，若让红外光谱覆盖相同的区间则必须改变光栅、光束分离器、滤波器和检测器。

（3）拉曼光谱谱峰清晰尖锐，更适合定量研究、数据库搜索、以及运用差异分析进行定性研究。

在化学结构分析中，独立的拉曼区间的强度可以和功能集团的数量相关。

（4）因为激光束的直径在它的聚焦部位通常只有0.2-2毫米，常规拉曼光谱只需要少量的样品就可以得到。

这是拉曼光谱相对常规红外光谱一个很大的优势。

而且，拉曼显微镜物镜可将激光束进一步聚焦至20微米甚至更小，可分析更小面积的样品。

（5）共振拉曼效应可以用来有选择性地增强大生物分子特个发色基团的振动，这些发色基团的拉曼光强能被选择性地增强1000到10000倍。

三．拉曼光谱技术分类及相关原理、优缺点及主要应用领域

随着拉曼光谱学、仪器学、激光技术的发展，拉曼光谱技术作为一种成熟的光谱分析技术，已发展了多种不同的分析技术，如傅里叶拉曼光谱（FT－Raman）、表面增强拉曼光谱（SERS）、激光共振拉曼光谱（RRS）、共焦显微拉曼光谱、光声拉曼技术、高温高压原位拉曼光谱技术。

1.傅里叶变换拉曼光谱技术

傅立叶变换拉曼光谱（FT－Raman）原理是傅里叶变换技术采集信号，1064nm的激光光源。

来自试样的拉曼散射光通过干涉仪进入探测器，获得一干涉图，随后进行傅里叶变换得到拉曼光谱。

该技术优点：

针对荧光强、颜色深的样品更适用、克服了荧光干扰，测量波段宽、热效应小、光谱频率精度高及灵敏度高等。

且具有多通路的特点，能同时测定所有频率。

其缺点是温度漂移，试样移动对光谱影响大。

主要应用领域于样品的结构分析，如蛋白质二级结构分析，染色纤维检验等。

2.表面增强拉曼光谱技术

表面增强拉曼散射（SERS）原理是衡痕量分子吸附于金属胶粒和粗糙金属（如银、金、铜等）表面作用下,试样的拉曼散射强度会增加104～106倍。

检测快速、灵敏度高，所需样品浓度低、无破坏性。

其缺点是基衬重线性和稳定性难以控制。

该技术主要用于分子的理化研究，病理分析，药物分析等研究领域，如Ｌ-天冬氨酸在银胶中的吸附研究。

3.激光共振拉曼光谱技术

激光共振拉曼光谱技术（RRS）原理是当激发光波长与分子的电子跃迁波长相等时将发生共振拉曼散射，激光频率与待测分子的某个电子吸收峰接近或重合时，信号增强104～106倍。

灵敏度高，所需样品浓度低、量少等，特别适用于生物大分子试样检测。

其缺点是荧光干扰，热效应，要求光源可调。

该技术主要用于低浓度和微量样品检测，药物、生物大分子检测等领域，如色素蛋白的研究。

4.共聚焦显微拉曼光谱技术

共聚焦显微拉曼光谱技术通常是指装备有显微镜系统的拉曼光谱仪。

其原理是使光源、样品、探测器三点共轭聚焦，消除杂散光，信号增强104～106倍。

采用了低功率激光器、高转换效率、检测灵敏度高、时间短、所需样品量少、样品无需制备、所需样品浓度低，信息量大。

柯惟中等采用显微激光拉曼谱仪对各类司法文件作了无损检测。

其缺点是受荧光干扰。

该技术主要用于电化学研究，宝石中细小包裹体的测量、检测、司法鉴定等领域。

5.固体光声拉曼技术

光声拉曼光谱术是通过光声方法来直接探测样品中因相干拉曼过程而存储的能量的一种非线性光谱技术。

灵敏度高，分辨率高，避免了非共振拉曼散射的影响。

其缺点是要求激光具有

高度。

该技术主要用于气体、液体、固体介质的特性分析领域。

6.高温高压原位拉曼光谱技术

高温高压原位拉曼光谱技术原理是高温下发生理化反应，得到反应物和产物的结构信息以及反应中间体和变化过程的信息。

空间分辨率高、消除杂散光、样品可程序控温。

其缺点有热辐射。

主要用于晶体生长、冶金熔渣、地质岩浆等物质的高温结构等研究领域。

四、拉曼光谱技术的应用

1.拉曼光谱技术在生物学领域的应用

随着当代科学技术的迅猛发展,对核酸、蛋白质、磷脂等生物大分子的研究已经不能满足于一般性质的描述,而在分子水平上探讨其具体的化学结构则成为新的研究课题,以进一步揭开生命的奥秘。

例如,人们利用表面增强拉曼技术解决了生物化学、生物物理和分子生物学中的许多难题,包括分子的特殊基团,如氨基酸中的氨基、羧基、苯环等与界面的相互作用,生物分子与金属表面的键合方式，DNA、RNA、卟啉在银溶胶上的吸附状态等。

用常规的方法难以检测多肽及蛋白质的结构,或者是方法过于复杂,不易操作。

拉曼光谱可以提供丰富的关于蛋白质结构的信息。

蛋白质拉曼光谱不仅可以反映肽链的骨架振动,而且可以反映侧链周围微环境的变化。

近年来,拉曼光谱已应用于研究蛋白质或多肽的一级结构,非折叠蛋白质,蛋白质装配的特征描述,基于蛋白质制药的流程监控和质量控制，动脉硬化操作中的钙化沉积和红细胞膜的等诸多方面的研究均有文献报道。

Song等在研究多肽物质聚L-谷氨酸、聚L-赖氨酸无规则卷曲、A-螺旋和B-折叠构象的紫外共振拉曼光谱的过程中,依据溶液pH值、温度与二级结构的依赖关系,建立了以酰胺键的频率、强度为依据的蛋白质二级结构的研究基础。

王斌等采用傅立叶光谱技术对蛋白质样品进行多次扫描,从而对蛋白质二级结构进行定量分析。

拉曼光谱是研究生物大分子的有力手段，由于水的拉曼光谱很弱、谱图又很简单，故拉曼光谱可以在接近自然状态、活性状态下来研究生物大分子的结构及其变化。

在生物的遗传、变异、生长发育、以及繁殖起至关重要作用的DNA承载了生命体的遗传信息,是现代分子生物学研究的热点。

对于维持生命体正常活动的生物大分子的研究,拉曼光谱是被公认的最有效的方法之一。

拉曼光谱技术在测量生物大分子时,具有样品需要量小、结构信息量大、测量速度快、操作方便、对样品无损伤和实时监测等优点,尤其是在测定水溶液时,几乎不受水的干扰。

由于许多生物大分子电子吸收位于紫外区，所以特别适用于生物样品的检测。

如果再与SERS相结合检测水平已经达到了单分子水平。

赵晓杰等研究了卟啉类光敏剂与DNA的相互作用机理。

分析表明:

水溶卟啉是以沟槽连接与DNA作用，卟啉与DNA作用后吡啶基团向垂直卟啉环平面方向转过一个小的角度，在445nm脉冲激光激发下,卟啉易于与DNA形成电子激发态复合物。

周殿凤等研究了小牛胸腺DNA水溶液经紫外辐射的拉曼光谱图,试验结果表明紫外辐射使小牛胸腺DNA的构象受到破坏,构型发生变化,除部分单双键发生了断裂外,4种碱基也均受到不同程度的影响,其中嘧啶、嘌呤碱基受到的损伤较为严重。

另外,该试验也表明,在水溶液中,DNA以B型结构为主,局部的A型结构仍然存在。

Takashi等用拉曼光谱研究了端粒DNA的溶、液二级结构和核苷构象,发现单链和双链端粒DNA都显示了结构的多态性,其B型DNA中双螺旋是不均匀的。

王杰芳等采用傅立叶变换拉曼光谱研究了质粒pUC18DNA经过C射线电离辐射以后结构的变化,发现其脱氧核糖与酸主链中各振动模式产生的谱带强度有所增加,而各碱基震动谱带的相对强度则非常弱,其结果表明碱基受损,主链断裂,超螺旋结构部分解旋。

董瑞新等测定了不同温度下DNA纤维和溶液的拉曼光谱,结果表明当温度变化时,碱基、磷酸根等特征振动都不同程度地受到影响,谱线强度、频率随温度呈非线性变化。

在所有的振动模式中,腺嘌呤（A）的特征振动受到温度的影响最大。

余多慰等对鲱精DNA纤维用酸溶液处理不同时间后,将样品进行拉曼光谱分析。

结果表明DNA分子发生明显的质子化作用,酸可以导致DNA中部分嘌呤、嘧啶的脱落并探讨了其产生原因可能与质子化强度有关。

DNA结构、构型的变化（如质子化、氢键断裂、碱基受损伤等）、超螺旋结构等在DNA的复制、遗传、变异及修饰等方面至关重要,拉曼光谱可以探测到核酸水溶液中主链、碱基及磷酸基团的振动。

因此利用拉曼光谱的变化推测生物大分子的结构及其变化有利于研究遗传信息的特性,并为基因突变、转基因、诱变育种等提供有力技术保证。

2.拉曼光谱技术在临床医学及制药方面的应用

拉曼光谱在医学和药学上的应用主要有以下几个方面：

一是利用拉曼光谱进行体内和体外的医学诊断；

二是研究人体内部的和由外部吸收的外部试剂，其中包括有意摄入的（如药物和探测物）和无意感染的（如病毒和污染物）物质与人体的相互作用；

三是药物成分和结构鉴定。

由于检测技术的非侵入性和非破坏性，最近十几年内，拉曼光谱在医药学上的发展十分迅速。

拉曼光谱对白内障、硅肺、动脉粥样硬化等疾病的诊断已见报道，在癌症诊断方面的巨大潜力尤其受到众多研究者的重视。

拉曼光谱具有很强的分辨相似分子（药物及其代谢物）的能力，对药材和药物有效组分成分、浓度和细微结构的无损分析和鉴定非常有效，特别是最近表面增强拉曼光谱的发展，使探测药物及其它有意义的化学物质的药理特性成为可能。

拉曼光谱可以对生物材料样品进行测定而不会改变样品的性状，为此应用这项技术对动物组织和细胞进行研究可用于医学诊断为癌症诊断和机理分析提供重要的信息和数据。

这对于癌症的诊断具有重要的临床意义。

据文献报道，林文硕等采用近红外拉曼光谱对山药成分进行分析。

并在山药的拉曼光谱的基础上，获得山药拉曼一阶导数谱。

拉曼谱中出现的477cm-1，863cm-1，936cm-1强峰，可认为是山药的特征峰。

郭萍等采用傅里叶变换红外（FTIR）光谱和拉曼（FT-Raman）光谱，对中草药绞股蓝进行了定性分析。

在绞股蓝的FT-Raman光谱中，在700cm-1—3500cm-1的波数范围内均有散射特征峰出现，表明它具有糖类的一些基团，比如羟基、醛基等特征。

将绞股蓝的FT-Raman光谱与FTIR光谱比较发现，绞股蓝的红外光谱图中各官能团的特征伸缩振动产生的吸收带比较稀疏，而拉曼光谱检测谱较为精细。

陈伟炜等利用银胶表面增强对白术煎剂进行鉴别，结果表明其SERS光谱信号明显增强，在396cm-1、548cm-1、等处出现了6个明显的拉曼信号，分别归属于卤代烯烃、蛋白质、色氨酸等成分。

结果表明中医药煎剂的某些基团的分子振动峰在银胶体系中得到了增强。

刘蓬勃等采用傅里叶变换拉曼光谱法鉴别八角茴香及其伪品。

结果表明，八角茴香在2936cm-1处有一强特征峰，红茴香、莽草则分别出现2925cm-1和2918cm-1。

八角茴香的1607/1318两个峰的强度比与莽草1602/1336、红茴香的1605/1320有明显不同。

根据这两个特点，即可将八角茴香与莽草、红茴香很容易地区分开。

由以上资料表明，拉曼光谱已成为药物成分鉴定、药物真伪鉴别的又一有效手段。

据文献报道，J.RenwickBeattie等采用拉曼光谱技术和多变量分析技术对肺组织中的生育酚及其氧化产物进行了准确测定和定位，实现了活体组织的无损测试。

李一等收集了10例正常的口腔黏膜组织、20例鳞状细胞癌组织、30例白斑，并进行近红外拉曼光谱扫描。

观察不同病变类型的特征谱线，并通过化学计量法建模来分析其分类诊断效力。

结果表明，近红外拉曼光谱检测与分类建模技术相结合，可以检测到口腔正常黏膜、白斑及鳞状细胞癌样本中的生化物质变化，并进行准确分类建模诊断。

Hiroya等利用近红外拉曼光谱对甲醛保存后的肺部肿瘤进行了检测，结果表明肿瘤组织的拉曼光谱1610cm-1和1627cm-1处出现了特征峰，而且在1448cm-1和1662cm-1的强度比正常组织的明显增强。

佟倜等为了探索共聚焦激光拉曼光谱仪在检测癌组织及其癌旁正常组织的特征峰差异，提供分子在光谱水平检测组织样本共聚焦激光拉曼光谱方法，对多种鳞癌组织和正常组织进行了拉曼光谱分析，发现鳞癌组织的拉曼光谱在1200cm-1和1600cm-1出现了两个特征峰，而正常组织均未见特征峰。

杨继朋等利用显微拉曼光谱仪对胃癌单细胞进行了研究。

相对正常细胞的拉曼光谱而言，胃癌细胞的拉曼光谱在1250cm-1处的峰强度降低，而1094cm-1的峰强度却升高了。

I1315/I1340的值从正常细胞的1.8降到了肿瘤细胞的1.1，I1655/I1450的比值从正常细胞的1.26降到了肿瘤细胞的1.00，以此为标准，可以区分肿瘤细胞和正常细胞。

Xun-LingYan等发现胃癌细胞的拉曼光谱与正常胃细胞的拉曼光谱相似，但拉曼光谱的强度比正常胃细胞的低很多；

肠癌细胞的拉曼光谱比胃癌的拉曼光谱弱，很多谱线已经消失。

通过这些特征拉曼谱线的不同，为癌症的诊断和治疗提供了有力的实验依据，表明拉曼光谱技术能够为癌症的早期检测和诊断提供一种有效手段。

3.拉曼光谱技术在食品中的应用

食品的种类十分丰富，其成分因品种不同而有所差异，但综合各种食品，其营养成分主要是糖分、油脂、蛋白质和维生素。

常规的化学分析方法，如液相色谱法（ＬＣ）、气相色谱法（ＧＣ）等，操作步骤繁琐、消耗化学药品、需制备试样，而拉曼光谱技术能够克服这些缺点，因此在食品成分的分析及食品安全监测研究中得到广泛应用。

拉曼光谱可用于分析检测食品中糖类、蛋白质、脂肪、ＤＮＡ、维生素和色素等成分，还可应用于食品工业快速检测、质量控制、无损检测等方面。

如奶粉中三聚氰胺的快速检测；

水果蔬菜表面农药残余量检测；

酒制品的乙醇、含糖量检测，产地及真假鉴别；

酱油、果汁等产品的品质、真假鉴定；

肉制品中的蛋白质、脂肪、水分等含量分析以及新鲜及冷冻程度、产品种类鉴别；

加工过程（如混合、加热及胶凝等）中对结构变化敏感的各个独立组分的检测。

近年来，食品安全成为人们关注的焦点，在食品安全检测及非法添加物检测中，拉曼光谱技术，因其快速，敏度高等特性，得到了进一步的发展。

糖分一般含有Ｃ-Ｈ，Ｏ-Ｈ，Ｃ=Ｃ,C=Ｏ等，虽然基团简单，却是大分子结构，存在许多同分异构体，所以分析相对困难。

Ｐａｒａｄｋａｒ等利用傅里叶拉曼光谱获得了甘蔗糖、甜菜糖的拉曼光谱。

采用偏最小二乘（ＰＬＳ）和主成分回归对掺杂在枫树糖浆中的甘蔗糖和甜菜糖含量进行建模，结果决定系数R２＞0.92，准确率达95％。

Barron等用拉曼光谱定性分析了小麦阿拉伯木聚糖的分子化学键和骨架结构。

Ｓilva等选择激发波长1064nm，检测了玫瑰果中的类胡萝卜素和亚麻油酸以及玫瑰果种子的不饱和脂肪酸。

钱晓凡等在室温环境下用激光显微拉曼光谱测试5种新鲜水果，结果测得的拉曼谱线均为β-胡萝卜素的谱线，不同水果的谱线位置略有偏移，可作为判别不同水果的依据。

Synytsya等人采用傅立叶变化拉曼光谱和傅立叶变换红外光谱，对聚半乳糖醛酸（果胶酸），果胶酸钾盐及其甲酯和乙酯衍生物、柑橘果胶及糖用甜菜果胶进行区分，并可利用特征谱带来判断果胶中阿魏酸基团含量。

朱科等人采用显微激光拉曼光谱仪研究了小麦胚芽8S球蛋白的二级结构，结果表明小麦胚芽8S球蛋白的二级结构主要为β-折叠，另外还含有一定量的α-螺旋和无规卷曲构象。

而应用拉曼光谱对蛋白质二级结构进行定量研究始于1976年。

Lippert等由已知二级结构的蛋白质的拉曼光谱得到1组峰强参数，然后用蛋白质拉曼光谱的酞胺III和酞胺I（重水溶液）谱带强度建立联立方程，从而求解蛋白质的二级结构。

方一行等人用Li