健脾养阴活血法对胃癌前病变p16cWord下载.docx
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中医采用整体调理与个体化用药相结合,不仅能改善症状,而且对癌前病变会部分逆转,但机理并不明确。
本实验研究健脾养阴活血法对胃癌前病变p16,c-myc蛋白的影响,并对其机理进行初步探讨。
1材料与仪器1动物健康、性成熟的雄性SD大鼠(由长春高新医学动物实验研究中心提供),体重170~180g共40只,验动物生产许可证号SCXK(吉)2003-0004。
2药物中药试剂,成分为黄芪、焦白术、沙参、百合、枳壳、紫苏、甘草、莪术、佛手、三棱、焦三仙、赤芍,由黑龙江中医药大学附属第一医院制剂室制成冲剂;
维霉素片,河北环海药业有限公司产品,批号为20070611;
脱氧胆酸钠,为北京奥博星生物技术有限责任公司产品,批号为20070815;
无水乙醇,为长春市化学试剂厂产品,批号为20070322;
一抗p16及c-myc试剂盒,由武汉博士德生物工程有限公司提供;
二抗免疫组化检测试剂:
由武汉博士德生物工程有限公司提供;
DAB显色剂:
由北京中山金桥生物技术有限公司提供。
3器材高速离心机(HitachiHimac1R21型,日本);
电热恒温水浴箱(600型,上海);
光学显微镜(OlympusBX60型,日本);
轮转式组织切片机(莱佧2135型,德国)。
2方法
分组方法将120只SD雄性大鼠随机分为4组,正常对照组20只,模型组30只,维酶素组35只,中药治疗组35只;
在相同条件下分笼饲养,除正常对照组外其余动物进行造膜。
造模方法恒温℃,湿度50%~60%。
造模用时间共13周。
模型组第1~5周自由饮用20mmol/L脱氧胆酸钠溶液(每天现配);
第6~13周每隔3d轮换1次,分别自由饮用20mmol/L脱氧胆酸钠溶液和15%乙醇溶液;
同时前5周每5天,后8周每7天按10ml/kg剂量,用150g/L75℃NaCl溶液加室温无水乙醇配制成60%的乙醇溶液,水浴恒温55℃后灌胃;
配合饥饱失常法即1~8周:
两天饱食、一天禁食;
9~13周:
两天饱食、一天禁食、水。
治疗方法中药治疗组和维酶素组在造模结束后中,中药组用制好的冲剂,配成g/ml的混悬液以10ml/灌胃,1次/d;
维酶素组将维酶素片研碎制成0.1g/ml的混悬液以10ml/灌胃,1次/d;
两用药组用药时间均为12周。
标本采集方法实验进行至预定阶段,大鼠禁食、水24h后处死,距贲门和幽门cm离断取出全胃并沿胃大弯侧剖开,用冰生理盐水冲洗,滤纸吸干铺开后,取小弯处2~3mm长条形胃黏膜。
常规石蜡包埋,连续切片,2张做免疫组化染色,1张做HE染色作病理组织学检验。
指标评定标准病理检验评定标准参照2006年上海会议的《中国慢性胃炎共识意见》进行诊断及分类,并分等级如下:
非肠化及异型增生(-);
肠化(+);
轻度异型增生(++);
重度异型增生(+++)。
其中将非肠化及异型增生(-)和肠化(+)归类为非强阳性;
将轻度异型增生(++)和重度异型增生(+++)归类为强阳性。
免疫组化的判断标准参照文献[3]制定。
将染色强度打分:
0分为无色;
1分为淡黄色;
2分为棕黄色;
3分为棕褐色。
(染色深浅需与背景着色相对比)。
再将阳性细胞所占的百分比打分:
0分为阴性;
1分为阳性细胞<10%;
2分为11%~50%;
3分为51%~75%;
4分为75%。
染色强度与阳性细胞百分比乘积进行计分,大于3分为免疫反应(+)。
统计学方法应用统计软件对数据进行分析;
计量资料采用t检验,计数资料采用χ2检验。
3结果
病理检验结果见表1。
表1各组大鼠的病理检验结果
阴性与阳性的计数对比:
中药治疗组和维酶素组分别与模型组进行比较均有统计学意义,且中药治疗组和维酶素组比较,中药治疗组亦优于维酶素组,差异有显着性意义。
见表2。
表2各组大鼠病理检验结果阴性与阳性的计数对比
与模型组比较,,;
与维酶素组比较,
非强阳性与强阳性的计数对比:
中药治疗组与模型组进行比较时有统计学意义;
维酶素组与模型组进行比较时无统计学意义;
中药治疗组与维酶素组进行比较有统计学意义。
见表3。
表3各组大鼠病理检验结果非强阳性与强阳性的计数对比
与维酶素组比较,
免疫组化检验结果在综合计分后,乘积大于3分为免疫反应(+)作为标准时,中药治疗组与模型组进行比较时有统计学意义;
见表4。
表4p16,c-myc免疫组化检验结果阴性与阳性的计数对比
与模型组比较,,;
综合计分后对积分的均数进行组间比较:
中药治疗组和维酶素组分别与模型组进行比较均有统计学意义,且在中药治疗组和维酶素组的比较中,中药治疗组亦优于维酶素组,差异有显着性意义。
见表5。
表5p16,c-myc免疫组化检验结果积分均数的组间比较
3讨论
胃癌是一种常见的恶性肿瘤,是许多癌基因、抑癌基因经过多阶段、多途径协同作用,逐步发展形成的。
在正常胃粘膜到癌前病变过程以及癌前病变至胃癌过程中,存在特异的基因差异表达,目前已发现多种胃癌相关基因[3]。
p16蛋白是多重肿瘤抑制基因1(MTS1)编码产物,MTS1在1994年首次由美国报道,此基因位于人类染色体9p21,基因长度为23kb,含3个外显子,编码产物为pl6,p16基因座编码两不同的翻译产物,它是正常细胞周期的调控者之一,具有负性调节细胞周期的作用[4]。
一旦p16基因发生突变或缺失,p16蛋白也随之失活或缺失,细胞不断增殖,DNA甲基化是p16基因失活的一个重要机制[5]。
c-myc是一个多功能的癌基因,位于人类染色体8p24上,有转录因子活性,可以启动细胞增殖、抑制细胞分化、调节细胞周期并参与细胞凋亡的调控,具有促进增殖和诱导凋亡的双重作用;
是在细胞恶性化过程中较早出现的分子改变,与肿瘤启动和恶性增生密切相关[6]。
能和靶DNA调控序列(如Inr序列)特异结合从而对细胞内基因表达进行直接调控[7]。
最近研究指出,c-myc基因导致细胞生长、癌变的重要机制也可能和刺激rRNA的合成、堆积有关[8]。
在治疗胃癌前期病变中,应“治病求本”,补益脾胃之气。
李东垣指出:
“善治者,唯有调和脾胃。
”这是逆转胃癌前期病变的关键,故以健脾为首。
胃癌前病变是长时间迁延过和,久病伤津耗液、瘀阻脉络,故辅以养阴活血。
我们的研究显示中药在有效治疗胃癌前病时,p16的表达增强,c-myc的表达减弱,这说明中药对胃癌前病的较好疗效是通过作用于多基因而实现的,其对p16,c-myc表达的调节可能是其作用机制之一。
维酶素在治疗胃癌前病变时有一定的作用,但在病变较重时疗效不佳。
以健脾养阴活血法为指导的中药方剂能增强抑癌基因p16的表达,同时使原癌基因c-myc的表达减弱;
【参考文献】
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[2]TestinoG,GornaggiaM,DeIacoF.Intestinalmetaplasia,highgradeepithelialdysplasiaandgastriccancer[J].ScandJGastroenterol,2002,37(12):
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[3]张维铭,刘文天,徐垚,等.应用荧光差异显示法对胃癌及癌前病变相关基因的研究[J].癌症,2004,23(3):
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[4]DECastroIP,BenetM,JimenezM,et p10,analternativesplicedformofp15INK4b,inhibitscellcycleprogressionandmalignanttransformation[J].CancerRes,2005,65(8):
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[8]Grandori,Carla,Gomez-Roman,et bindstohumanribosomalDNAandstimulatestranscriptionofrRNAgenesbyRNApolymeraseI[J].NatureCellBiology,2005,7(3):
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- 健脾养阴 活血 胃癌 病变 p16c