慢病毒包装浓缩纯化滴度实验步骤Word下载.docx
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1.当细胞传代次数过多(超出50代),细胞状态变差时或细胞出现污染事故时,需要丢弃并对开端冻存的细胞停止复苏.
2.打开水浴锅,设置温度为40℃.
3.检查细胞库记录,根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞(需戴上棉手套,防止被冻伤),迅速丢入水浴锅中并疾速晃动,在1~2min内使细胞溶液完全溶解.
4.将1ml细胞溶液加入9ml完全培养基中并混匀后转入10cm培养皿.
5.放回37℃、3%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养.
6.第二天观察细胞存活率.倒掉旧的培养基,加入10ml新鲜培养基.
二、慢病毒的包装、稀释和滴度测定
1.所用病毒检测引物为WPRE特异引物,序列如下
5'
-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3'
(forwardprimer),
-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3'
(reverseprimer)and
-FAM-ACTCATCGCCGCCTGCCTTGCC-TAMRA-3'
(probe)
2.TaqManUniversalPCRMasterMix(AppliedBiosystems,cat.no.4304437)
3.TaqManDNATemplateReagentKit(AppliedBiosystems,cat.no.401970)
4.TaqManRNasePcontrolreagent(AppliedBiosystems,cat.no.4316844)
用于包装的293T细胞的培养
用于包装的293T细胞(ATCCNo.CRL-11268)必须选择处于生长旺盛期,细胞状态较佳,存活率90%以上,细胞边沿清晰,传代次数较低.任何时候细胞汇合率都不准达到100%.
慢病毒的包装
1.预先准备3个T150瓶的293T细胞,培养基为DMEM+10%FBS,1%Glutamax,1%青霉素-链霉素.
2.将细胞分到12分到12个T150瓶中,每瓶的细胞密度是8×
106个.
3.第二天,镜下检查细胞.细胞融合度应大致为30-40%,分布平均.
4.转染前1小时,取出细胞板,去除原有细胞培养基,加入20ml的Opti-MEM培养基,将细胞送回培养箱.
5.取两支无菌的50ml离心管,其中一支中加入252μgpNL-EGFP/CMV/WPREDU3载体质粒,168μgpCD/NL-BH*DDD包装质粒和84μgpLTR-G质粒,用Opti-MEM培养基补齐到18ml.另外一支中加入500μlTrans-EZ溶液和17.5mlOpti-MEM培养基,用电动移液器轻轻混匀.将Trans-EZ稀释液滴加到质粒管中,边加边轻轻晃匀.
关键步调:
推荐使用Qiagen质粒大抽试剂盒或相当的试剂盒所制备的质粒.
6.室温孵育20分钟,使DNA和Trans-EZ充分连系形成转染复合体.
7.取1支5ml的移液管,将得到的DNA-Trans-EZ复合体平均滴加入到细胞培养板中,每板3ml.往返晃动培养板,混匀后放回到5%二氧化碳培养箱.每皿细胞培养盘不要超出6盘.
8.6小时后,移去细胞上清,更换为17ml的DMEM完全培养基.
9.转染后一天观察细胞,所有的细胞应当都是健康的而且密度接近60-80%.如果所转染质粒带有GFP荧光,那末这时候可以看到大于95%的细胞都是带有荧光的.
10.将细胞送回培养箱继续培养2天(36-48小时).在这个过程中,细胞会逐渐融合形成多核体,大多数的细胞依然贴壁.
11.收集所有的上清,分装到50ml离心管中.
12.4℃,500g离心10分钟,除去脱落的细胞和大的细胞碎片.
13.总的上清约为204ml,用250-ml0.45μmPVDF过滤装置过滤.如果发现滤膜被堵住,表示为过滤速度变慢,更换新的滤器.
慢病毒的稀释与纯化
方法一超速离心沉淀法
1.取6个Ultra-clearSW28离心管,用70%乙醇消毒后,放在超净工作台中打开紫外灯继续消毒30分钟.
2.每个Ultra-clearSW28离心管中加入约32ml的预先处理的病毒上清液.
3.取一支10ml的移液管,吸取12ml20%的蔗糖溶液.将移液管一直拔出到离心管的底部,缓慢将蔗糖溶液打出4ml.同样地,将剩下8ml的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中.另取一支干净的移液管,对剩下3管停止同样处理.
4.用PBS调整各管的重量,使对应的离心管之间的重量相差不超出0.1g.
5.顺次序将所有6个离心管放入BeckmanSW28超速离心转头中.
7.小心将管子从转头中取出.倒掉上清,将离心管倒扣在纸巾上放置10分钟使剩余的上清流干.吸掉剩余的液滴.在管底应当有可见的沉淀.
8.每管中加入100ml不含钙和镁的PBS洗下沉淀.
9.将SW28超速离心管拔出到50ml锥底离心管中,盖上盖子.
10.在4℃溶解2小时,每隔20分钟轻轻震荡.
11.4℃,500g离心1分钟,使溶液集中于管底.
12.用200μl移液器轻柔吹打使沉淀重悬.防止发生泡沫.将所有管中的液体集中到一个SW28离心管中.
13.集中后的病毒悬液分装成50μl每份,保管在成品管中.用碎干冰速冻后储存在-80℃.
方法二PEG-8000稀释法
PEG(聚乙二醇)是高分子聚合物,具有高亲水性,在溶液中会吸收大量水分,减少病毒之间的间隔,使病毒与病毒可以很容易的聚合在一起,病毒的相对浓度提高,达到沉淀稀释的目标.
5XPEG8000+NaCl配制称取NaCl8.766g;
PEG800050g溶解在200mlMilli-Q纯水中;
121摄氏度30min湿热灭尽30min;
保管在4℃.
1.使用0.45μm滤头过滤慢病毒上清液;
3.每20~30min混合一次,共停止3-5次;
4.4度放置过夜;
5.4度,4000g,离心20min;
6.吸弃上清,静置管子1~2分钟,吸走残存液体;
7.加入适量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀;
8.集中后的病毒悬液分装成50μl每份,保管在成品管中.用碎干冰速冻后储存在-80℃
病毒滴度的测定
稀释计数法
滴度单位:
TU/ml,指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数.”TU”为”transducingunits”的缩写,中文为“转导单位”,暗示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数.
第一天细胞准备
将生长状态杰出的293T细胞消化计数后稀释至1×
105/ml,加入96孔板,100μl/孔,为每个病毒准备10个孔.放入37℃,5%CO2培养箱中培养.
第二天加病毒
在EP管中做10倍梯度稀释,持续10个稀释度.稀释方法如下:
每种病毒准备10个1.5mlEP管,每管加入90μl培养液,往第一个管中加入10μl病毒原液,混匀后,吸取10μl加入第二个管混匀.依此类推,做十个稀释度(10~10-8).
吸取96孔板中原有的培养基,加入含稀释好的病毒液.并做好标识表记标帜.
第三天追加培养液
在每个孔再加入100μl完全培养液,利于细胞的生长.
第五天观察成果并计算滴度
在荧光显微镜下观察成果,并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数.假设为X和Y,则滴度(TU/ml)=(X+Y*10)*1000/2/X孔的病毒液的含量(μl).
定量PCR法
病毒感染1天前,取6孔板接种HOS细胞.每孔细胞为5×
104个.
接种细胞24小时后,取两个孔的细胞用血球计数板计数,确定感染时细胞的实际数目,记为N.
弃去其他培养板中的培养基,更换为含有5μg/mlpolybrene的新鲜培养基.将稀释病毒用培养基稀释200倍,也就是取1μl病毒加入到199μl的培养基中.在3个培养孔中分别加入0.5μl,5μl和50μl的稀释病毒.
感染开端后20小时,除去培养上清,换为500μl含DNaseI(TakaraMirusBio,终浓度为10U/ml)的新鲜培养基.在37℃消化15分钟,这一步是要除去残存的质粒DNA.然后换为2ml正常的培养基,继续培养48小时.
用0.5ml0.25%胰酶-EDTA溶液消化细胞,在37℃放置1分钟.用培养基吹洗下,离心收集细胞.依照DNeasy试剂盒的说明抽提基因组DNA.每个样品管中加入200μl洗脱液洗下DNA.用DNA定量试剂盒定量(Bio-Rad).基因组DNA可以稳定保管在-20℃至少2个月.
准备PCR所需的试剂和样品.为病毒序列检测引物配总管Ⅰ:
2×
TaqManMasterMix
25μl×
n
Forwardprimer(100pmolml-1)
0.1μl×
n
Reverseprimer(100pmolml-1)
Probe(100pmolml-1)
H2O
19.7μl×
n=numberofreactions.例如:
总反应数为40,将1ml2×
TaqManUniversalPCRMasterMix,4μlforwardprimer,4μlreverseprimer,4μlprobe和788μlH2O混和.震荡后放在冰上.
为人基因组序列检测引物配总管Ⅱ:
10×
RNasePprimer/probemix
2.5μl×
17.5μl×
TaqManUniversalPCRMasterMix,100μl10×
RNasePprimer/probemix和700μlH2O混和.震荡后放在冰上.
在预冷的96孔PCR板上完成PCR体系建立.从总管Ⅰ中各取45μl加入到A-D各行的孔中,从总管Ⅱ中各取45μl加入到E-G各行的孔中.
分别取5μl质粒尺度品和待测样品基因组DNA加入到A-D行中,每个样品重复1次.另留1个孔加入5μl的水做为无模板对照(no-templatecontrol).
分别取5μl基因组尺度品和待测样品基因组DNA加入到E-G行中,每个样品重复1次.另留1个孔加入5μl的水做为无模板对照(no-templatecontrol).
所使用定量PCR仪为ABIPRISM7000定量系统.循环条件设定为:
50℃2分钟,95℃10分钟,然后是95℃15秒,60℃1分钟的40个循环.
数据分析:
测得的DNA样品中整合的慢病毒载体拷贝数用基因组数加以标定,得到每基因组整合的病毒拷贝数.
滴度(integrationunitsperml,IUml-1)的计算公式如下:
IUml-1=(C×
N×
D×
1000)/V
其中:
C=平均每基因组整合的病毒拷贝数
N=感染时细胞的数目(约为1×
105)
D=病毒载体的稀释倍数
V=加入的稀释病毒的体积数
慢病毒的储存与稀释
慢病毒的储存
1.病毒的运输采取干冰保温,收到病毒液后若几天内用于实验,可于4℃保管(于一周内用完).
2.若病毒量较大,需长期保管.则根据每次实验用量分装后放于-80℃冰箱.一般病毒可以放于-80℃约12个月以上,但若超出6个月后使用,请重新检测病毒滴度.
3.防止反复冻融,否则会降低病毒滴度.每次冻融会降低病毒滴度10%.
慢病毒的稀释
需要稀释病毒时,将病毒取出后置于冰上融解,用细胞培养用D-Hank'
s、PBS或培养基稀释到所需浓度后混匀分装后4℃保管,并尽快用于实验(于一周内用完).
慢病毒在细胞水平的使用
什么是MOI?
“MOI”为”multiplicityofinfection”的缩写,中文为“感染复数”或“复感染指数”,含义为感染时病毒和细胞数量的比值,即平均每个细胞感染的病毒活性单位数(TUnumber/cell).在实验中将某种细胞感染达到80%时的MOI定义为这种细胞的MOI.
MOI与整合事件以及目标基因的表达相关.一定范围内,表达水平和MOI呈正相关.MOI取决于多种因素,如细胞状态,目标基因的大小与性质,细胞的感染效率等.所以,实验前需查阅相关文献,确定慢病毒对目标细胞的亲嗜性、MOI以及在体(invivo)注射所需病毒量.若无文献支持,可以通过预实验得到合适的MOI.实际上,即使有文献支持,但由于所用细胞代数、细胞状态以及目标基因的差别,实际的MOI和文献报导也会分歧,所以要安插预实验以确定所需MOI以及病毒对细胞生长的影响.
目标细胞感染预实验及实验体系的放大
实验目标:
确定细胞感染所需的MOI,以及是否需要添加感染增强剂Polybrene.
实验资料:
96孔板,1.5mlEP管,长势杰出的目标细胞一瓶,已知滴度的慢病毒溶液,Polybrene(10mg/ml),目标细胞培养基等.
第一天:
细胞准备
将长势杰出的目标细胞接种到96板,消化好细胞(悬浮细胞不需要消化,直接离心收集细胞后加新鲜培养基重悬即可)后把浓度调为3×
104~5×
104个/ml,按90μl/孔加入.接种细胞数量因细胞的生长速度而略有分歧,一般是包管第二天停止病毒感染时细胞汇合率介于30~50%之间.
第二天:
病毒感染
感染实验分两组,一组直接添加病毒液,一组同时添加Polybrene.病毒稀释方法同病毒滴度测定时方法,10倍倍比稀释,共三个稀释度,MOI值依次为100,10和1(细胞颠末一天的生长数量约为1×
104个/孔,对应的病毒数量为1×
106TU、1×
105TU和1×
104TU).每个MOI值加两个孔,取出一组加入感染增强剂,比例为1:
2000,终浓度为5μg/ml.
换液
感染实验同一天,8-12小时后,弃去上清液,更换为新鲜培养基,100μl/孔.
第五天:
观察荧光表达情况
在倒置荧光显微镜下观察荧光,估计慢病毒感染目标细胞的效率.对于生长缓慢的细胞,可以适当推迟观察的时间,中途可以传代和换液,以坚持细胞杰出的生长状态.通过细胞感染的效果,确认目标细胞的感染MOI以及是否需要添加Polybrene.
对于因目标基因较大,载体无法携带标记基因的,可以通过定量PCR来检测目标基因的表达来评估感染效率.
实验体系的放大
正式实验时,由于细胞数量较大,所需的病毒用量也需相应增大.放大的原则是坚持细胞的密度不变,将培养基体积,病毒量按实际细胞数与预实验细胞数的比例放大.即使这样,正式实验时由于体系的改变,加上预实验的MOI值设置跨度较大,可停止对MOI的再次优化.MOI的设置值为预实验最佳值0.5倍,1倍和1.5倍或自己设置合理的数值.
单孔底面积(cm2)
正常培养体积(μl)
感染时体积(μl)
MOI=1病毒量(TU)
MOI=10病毒量(TU)
MOI=100病毒量(TU
96孔板
100
1×
104
48孔板
200
105
106
24孔板
500
6×
12孔板
3.8
1000
107
6孔板
2000
T25瓶
25
5000
2500
5×
*表中可培养板底参数数值为CORNING公司产品参数.
*对于孔面积较小的培养板,由于溶液张力的关系,培养基体积太少会导致病毒的分布不均与,所以不做减半处理.
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