异育银鲫病原温和气单胞菌表型及分子鉴定与溶血素基因检测Word文件下载.docx
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文章编号:
DetectionofhemolysingeneandphenotypicandmolecularidentificationofpathogenicAeromonassobriafromgibelcarp(Carassiusauratusgibelio)
ZHANGXiao-jun1,YANBin-lun1,BINGXu-wen2,QINLei1,QINGuo-min1
(1.CollegeofOcean,KeyLaboratoryofOceanicBiotechnologyofJiangsu,HuaihaiInstituteofTechnology,Lianyungang,Jiangsu222005;
2.KeyLaboratoryofGeneticBreedingandAquacultureBiologyofFreshwaterFishes,MinistryofAgriculture,FreshwaterFisheriesResearchCenter,ChineseAcademyofFisheryScience,Wuxi,Jiangsu214081)
ABSTRACTInOctober2008,highmortalitiesofculturedgibelcarpoccurredinsomefarmsofYanchengcityofJiangsuprovince,dominantbacteriawereisolatedfromliver,kidney,bleedandasciticfluid.Thephenotypiccharacteristicsoffourstrains(JY081016-1toJY081016-4)wereexamined,includingmorphologicalcharacteristics,physiologicalandbiochemicalcharacteristics,the16SrRNAandgyrBwereamplifiedbyPCRandcomparedwithsequencesdepositedindatabases,molecularphylogenetictreeswereconstructed.Theresultsshowedtheisolateshavestrongpathogenicitytohealthygibelcarpbyartificialchallenge;
theamplified16SrRNAgeneofstrainJY081016-1(GenBankaccessionNo.GQ232759)was1448bpinlength,theamplifiedgyrBgene(GenBankaccessionNo.GQ232760)was1177bpinlength,andtwogenesallexhibitedhighsimilarity(over97%)withthe16SrRNAandgyrBgeneofAeromonasveroniiandA.veroniibv.sobriafromGenBankdatabase;
theisolateswereidentifiedasAeromonassobriabasedontheirphenotypicandmolecularcharacteristics.Detectionoftheactivityofextracellulaseandhemolysinshowedthattheisolatecouldproducedproteinase,lipase,lecithinase,andwithβ-haemolysisincontaining7%defibrinatedrabbitbloodagarplates,andhemolysingenecouldbeamplifiedbyPCRusingspecificprimer.
KEYWORDSGibelcarp(Carassiusauratusgibelio);
Aeromonassobria;
16SrRNAgene;
gyrBgene;
hemolysingene
*农业部淡水鱼类遗传育种和养殖生物学重点开放实验室开放基金资助(BZ2009-03);
江苏省自然科学基金项目(BK2009163)
作者简介:
张晓君(1969—),女,博士,教授,主要从事水产动物病害及病原微生物学研究.E-mail:
zxj9307@.
温和气单胞菌(AeromonassobriaPopoffandVé
ron1981)亦被称为寡源气单胞菌,也有的将其记作苏伯利气单胞菌,分类于气单胞菌科(AeromonadaceaeColwellMacDonellandDeley1986)气单胞菌属(AeromonasKluyverandvanNiel1936)。
该菌为条件致病菌,可以引起多种水产养殖动物的感染发病,可单独引发感染或与嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌及其他病原菌混合感染,有报道该菌可导致鳗鲡、罗非鱼、河鲈、暗纹东方鲀、牛蛙、中华鳖、大鲵等感染发病[1-7],近年也有在冷血动物、水禽等引起感染发病的报道[8-9],另外,该菌可导致人类的食物中毒、腹泻、宫颈糜烂等疾病[10],属于人兽共染的病原细菌。
2008年10月江苏省盐城市大丰几家养殖场所精养的异育银鲫发生疾病,病情严重,病鱼死亡惨重,所养异育银鲫500亩左右,异育银鲫鱼种重30~40克,投喂商品颗粒饲料。
对送检的30尾(来自5家养殖户)濒死或新鲜死亡异育银鲫进行了检验,病鱼表现为眼球突出,部分病鱼鳃框有血丝,鳍条中央变白,鳞片疏松,腹部膨胀,剖开鱼腹,可见腹腔积有大量黄色腹水,肝脏颜色变白,肾脏轻微肿大,个别病鱼内脏外有一层淡黄色胶冻状物。
取被检鱼的肝脏、肾脏、腹水及血液做细菌学及致病性检验,结果表明其病原为气单胞菌属(AeromonasKluyverandvanNiel1936)的温和气单胞菌(Aeromonassobria)。
为丰富该菌在生物学性状、宿主范围及分子生物学等方面的内容,对其进行了
致病性、形态特征、理化特性、16SrRNA基因和gyrB基因序列及系统发育学、对抗菌类药物的敏感性及胞外酶及溶血素等毒力因子检测,旨在能为对该菌的有效检验及深入研究等提供一定的参考。
1材料与方法
1.1病原菌的分离
取病死异育银鲫肝脏、血液及腹水,抹片后革兰氏染色镜检;
划线接种于普通营养琼脂培养基平板,取优势生长的4个菌落(编号为:
JY081016-1~4)移接于普通营养琼脂斜面(28℃培养24h)进行纯培养供鉴定。
1.2致病性试验
试验用异育银鲫购自水产品批发市场,暂养1周经检验健康后进行试验。
将供试菌株JY081016-1接种于普通营养肉汤,28℃过夜培养后作为供试菌液(调至106CFU/ml、107CFU/ml、108CFU/ml),分别经腹腔及肌肉注射感染健康异育银鲫,每种浓度接种6尾,每尾接种0.2ml;
同时设立接种同剂量、同批无菌营养肉汤做对照;
均隔离养殖于试验水族箱中,每天观察试验鱼感染后的发病与死亡情况,以引起试验鱼发病死亡并能重新分离回收到原感染菌作为分离菌致病性的判定指标。
1.3病原菌表型特征检验
取纯培养菌涂片,经革兰氏染色后镜检细菌形态;
纯培养菌接种于普通营养肉汤、普通营养琼脂及硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖琼脂(TCBS)培养基,置28℃培养24h,检查生长情况。
理化特性测定主要参照《常见细菌系统鉴定手册》[11]及《人及动物病原细菌学》[12]进行。
1.4病原菌胞外产物检测
分离菌的胞外蛋白酶活性、卵磷脂酶活性、脂酶活性、淀粉酶活性、尿素酶活性采用平板检验方法,明胶酶活性采用试管液化方法。
将处于对数生长期的4株供试菌株分别点种于含有脱脂牛奶(10%)、蛋黄液(10%)、吐温80(1.0%)、淀粉(1%)的平板中,将供试菌穿刺接种于含明胶(8%)的培养基试管,于28℃恒温培养24h后观察。
含脱脂牛奶、蛋黄液及吐温80的平板可以直接观察水解圈;
含淀粉的平板则在观察之前加入显色剂碘液。
透明的水解圈区域显示有酶活。
含明胶的培养基试管于28℃恒温培养24h后,置于4℃冰箱中过夜后观察。
分离菌的溶血活性采用将菌株接种至血液琼脂(含7%家兔脱纤血的营养琼脂)培养基平板的方法,将接种后的血液琼脂培养基平板置28℃恒温培养24h后观察菌株周围是否出现溶血圈。
若出现溶血圈则为阳性,表明该菌能分泌溶血毒素。
1.516SrRNA和gyrB基因序列测定与系统发育学分析
1.5.1PCR模板DNA的制备取纯培养菌分别接种于LB肉汤中28℃培养16h,按小量细菌基因组DNA抽提试剂盒(上海赛百盛基因技术有限公司产)所述方法提取DNA作为PCR模板DNA。
1.5.216SrRNA基因序列的PCR扩增与测序16SrRNA基因PCR扩增的两个引物分别为:
27F(正向引物):
5'
-AGAGTTTGATC(C/A)TGGCTCAG-3'
,1492R(反向引物):
-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'
[13]。
在20μl反应体系中含有:
无菌蒸馏水14.4μl,10×
PCR缓冲液2μl,1.5mmol/LMgCl21.6μl,4×
dNTP混合物0.4μl,引物各0.2μl,2.5U/μl的TaqDNA聚合酶0.2μl,模板DNA1μl。
PCR反应条件为:
95℃预变性3min、接94℃变性1min、55℃复性1min、72℃延伸2min,30个循环后72℃温育6min。
PCR扩增产物由上海生物工程技术公司进行基因序列测定。
1.5.3gyrB基因序列的PCR扩增与测序gyrB基因PCR扩增的两个引物分别为:
UP1(正向引物):
-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3'
,UP2r(反向引物):
-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3'
[14]。
PCR缓冲液2μl,1.5mmol/LMgCl21.6μl,4×
94℃预变性5min,接94℃变性1min、57℃复性1min、72℃延伸2min、30个循环,然后72℃温育7min。
1.5.416SrRNA和gyrB基因序列系统发育树构建对分离菌的16SrRNA基因和gyrB基因序列通过NCBI的Blast检索系统(http:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/)进行序列同源性分析,并使用ClustalX软件与从GenBank数据库中获得的序列相似性较高的菌株的序列进行多序列匹配排列(MultipleAlignments),采用MEGA3(MolecularEvolutionaryGeneticsAnalysis,MEGA)软件构建系统发生树,采用邻接法(neighborjoiningmethod)建树方法,并通过Bootstrap法(1000次重复)检验。
1.6菌种分类位置确定
根据细菌形态、培养及理化特性测定的结果,主要依据《Bergey'
sManualofDeterminativeBacteriology.9thed》[15]、《Bergey’sManualofSystematicBacteriology》[16]及有关资料,并结合细菌发育学分析的结果,进行分离菌的种属分类位置判定。
1.7溶血素基因的检测
根据Fujii等[17]报道的温和气单胞菌溶血素基因序列设计引物,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,用于溶血素基因序列的扩增。
P1序列为5'
GGATCCATGATGAATAGAATA3'
,P2序列为5'
AAGCTTTTATTGAACCGGAAC3'
。
PCR反应体系、反应参数及模板DNA的制备按前述1.3.2方法进行,PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析。
2结果
2.1病原细菌检验与分离
在被检异育银鲫的肝脏、血液和腹水中,均存在大量革兰氏阴性、散在或成双排列、两端钝圆、无芽孢、大小多在0.5~1.0µ
m×
1.0~2.0µ
m的杆菌(个别菌体稍弯曲)。
自被检异育银鲫的肝脏、血液和腹水中均分离到了大量同种细菌。
培养24h检查其菌落特征为圆形光滑、不透明、隆起、乳白色、有光泽、边缘整齐、直径多在1mm左右,48h的菌落直径多在1.5mm左右,生长良好。
2.2分离菌的致病性
供试菌株(JY081016-1)腹腔及肌肉注射感染异育银鲫后,供试鱼于感染后3~4天陆续死亡并出现明显的体表出血、鳞片疏松、脱落等病变。
对照组异育银鲫在14d观察期内均正常;
取感染死亡鱼进行细菌学检验,结果均检验并分离到大量纯一的同供试菌株(JY081016-1)在形态及菌落特征上相似的菌落。
试验证明分离菌为本次引起异育银鲫大量死亡的病原菌。
2.3形态与生长特性
4株分离菌的形态一致,均为革兰氏染色阴性、杆状、散在或成双排列、无芽孢、大小多在0.4~0.8μm×
1.2~2.0μm的细菌。
4株分离菌在普通营养琼脂上的菌落特征,与从病鱼肾脏和腹水中直接分离的一致,生长良好;
在TCBS培养基上易生长,形成黄色菌落;
在普通营养肉汤培养基(管)中,28℃培养24h检查呈均匀混浊生长,管底有点状菌体沉淀。
2.4生理生化特性
分离菌所测主要理化特性的反应结果见表1。
表1分离菌与4种嗜温有动力气单胞菌理化特性比较表
Table1Physiologicalandbiochemicalcharacteristicsofisolatesand4mesophilicmotileaeromonads
特性Character
分离菌
Isolates
嗜水气单胞菌a
A.hydrophila
温和气单胞菌a
A.sobria
豚鼠气单胞菌a
A.caviae
维氏气单胞菌a
A.veronii
37℃生长Growthat37℃
+
氧化酶Oxidase
接触酶Catalase
O-F试验O-Ftest
F
动力Motility
葡萄糖:
产酸Glucose,acidproduction
产气gasproduction
-
乳糖Lactose
d
麦芽糖Maltose
甘露醇Mannitol
甘露糖Mannose
[+]
蔗糖Sucrose
阿拉伯糖Arabinose
阿拉伯醇Arabitol
木糖Xylose
半乳糖Galactose
山梨醇Sorbitol
山梨糖Sorbose
·
卫茅醇Dulcitol
赤鲜醇Erythritol
苦杏仁苷Amygdatin
鼠李糖L-Rhamnose
糊精Oextrin
肌醇Inositol
侧金盏花醇Adonitol
水杨苷Salicin
胆汁七叶苷Esculin
β-半乳糖苷酶ONPG
丙二酸盐利用Malonate
枸橼酸盐利用Citrate
醋酸盐利用Acetate
酒石酸盐利用Tartrate
黏液酸盐利用Mucate
苯丙氨酸脱氨酶
Phenylalaninedeaminase
蕈糖Trehalose
棉子糖Raffinose
果糖Fructose
蜜二糖Melibiose
纤维二糖Cellobiose
+/-
甲基红MRtest
V-P试验V-Ptest
葡萄糖铵Glucosamine
尿素酶Urease
H2S产生H2Sproduction
乙酰胺酶Acetamidase
硝酸盐还原Nitratereduction
α-甲基-D-葡糖苷
α-methyl-D-glucoside
吲哚Indole
NaCl中生长GrowthatNaCl0%
1%
3%
6%
O/129敏感性sensitivity:
10μg
150μg
注:
“+”示阳性,“-”示阴性,“F”示发酵型,“d”示11%~89%的菌株为阳性“·
”示在原文中无记载。
上角标a指表中数据取自《Bergey'
sManualofDeterminativeBacteriology.9thed》(1994)。
Notes:
“+”,positive;
“-”,negative;
“F”,fermentative;
“d”,11%~89%positive,“·
”,notdescribedinprimaryarticle.“a”,thedatacomefrom《Bergey'
sManualofDeterminativeBacteriology.9thed》.
2.516SrRNA和gyrB基因序列与系统发育学
分离菌(JY081016-1)所扩增的16SrRNA基因序列长度为1448bp(GenBank登录号:
GQ232759);
所扩增的gyrB基因序列长度为1177bp(GenBank登录号:
GQ232760)。
将两种基因序列在NCBI上通过Blast进行同源性检索,结果分离菌的16SrRNA基因序列与气单胞菌属细菌的16SrRNA基因序列自然聚类,在检索出的序列中,主要包括维氏气单胞菌(A.veronii)、维氏气单胞菌温和生物型(A.veroniibv.sobria)、嗜水气单胞菌(A.hydrophila)、Aeromonasculicicola、维氏气单胞菌维氏生物型(A.veroniibv.veronii)、简氏气单胞菌(A.jandaei)、豚鼠气单胞菌(A.caviae)等,JY081016-1株与这些气单胞菌的相似性均在99%,选取了检索出的部分气单胞菌和1株鳗利斯顿氏菌(登录号AY662304)作为外围菌进行系统发育学分析,其系统发育树如图1所示。
分离菌(JY081016-1)的gyrB基因序列与气单胞菌属细菌的gyrB基因序列自然聚类,在检索出的序列中,主要包括维氏气单胞菌和维氏气单胞菌温和生物型(相似性均在97%~98%)、嗜水气单胞菌(相似性在92%~96%)、简氏气单胞菌(相似性在93%)及中间气单胞菌(相似性在93%),以鳗利斯顿氏菌(登录号AM235736)作为外围菌进行系统发育学分析,其系统发育树如图2所示。
图1LY081016-1株16SrRNA基因序列系统发育树(图中EF631963至AY662304为菌株在NCBI的登录号,数字为自举值)
Fig.1PhylogenetictreebasedonLY081016-116SrRNAgenesequences(EF631963~AY662304weredatabaseaccessionnumbersi
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- 异育银鲫 病原 温和 气单胞菌 表型 分子 鉴定 溶血 基因 检测