乳腺癌细胞培养Word文档格式.docx

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血清10%FBS

细胞传代方法1:

2~1:

4传代；

每周2~3次

细胞传代情况C5

细胞冻存条件MDA-MB-231人乳腺癌细胞基础培养基+5%DMSO+20%FBS

支原体检测阴性

说明

培养基：

DMEM90%,FetalBovineSerum10%

培养条件：

37℃5%CO2

消化条件：

0.25%（w/v）Trypsin-0.53mMEDTA溶液,消化5-10min

传代的比例：

1：

2~1：

4

换液时间：

2~3天换液一次

冻存液比例：

85%培养基,10%FBS,5%（v/v）DMSO

冻存密度：

1-2×

106/管,液氮保管

MDA-MB-231人乳腺癌细胞复苏方法：

取出冻存管后,投入37 

℃水浴中,震荡解冻2 

min,酒精消毒管壁外侧后,将其转入超净台中,将管内细胞转移至离心管中,加入5 

ml 

37 

℃预热的培养基,并清洗冻存管一次,将离心管离心（1000 

rpm,5 

min）,弃去上清液,再加入2 

ml培养基,转入培养瓶中培养.

产物名称：

人正常乳腺细胞 

Hs578Bst规格：

70%密度的25cm2培养瓶的细胞一瓶特点：

细胞代数为4-5代左右包装：

内层无菌自封袋；

专用防压泡沫盒；

外层防压保温气泡袋；

说明书细胞来源：

ATCC、sciencell、ICLC

货期：

1-2周运输方式：

快递运输售后：

收到细胞后7天,如发现细胞有质量问题（如污染,死亡,快递运输等原因）时,应出具书面质量问题陈说并及时传真或E-mail致销售人员,我们将尽快为您解决.

细胞培养罕见问题分析细胞培养

1、冷冻管应如何解冻？

取出冷冻管后,须立即放入37℃水槽中快速解冻,轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化,并注意水面不成超越冷冻管盖沿,否则易发生污染情形.另冷冻管由液氮桶中取出解冻时,必需注意平安,预防冷冻管之爆裂.

2、细胞冷冻管解冻培养时,是否应马上去除DMSO？

除少数特别注明对DMSO敏感之细胞外,绝年夜部份细胞株（包括悬浮性细胞）,在解冻之后,应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中,待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO即可,如此可防止年夜部份解冻后细胞无法生长或贴附之问题.

3、可否使用与原先培养条件分歧之培养基？

不能.每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基,若骤然使用和原先提供之培养条件分歧之培养基,细胞年夜都无法立即适应,造成细胞无法存活.

4、可否使用与原先培养条件分歧之血清种类？

不能.血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源,所以血清的种类和品质对细胞的生长会发生极年夜的影响.来自分歧物种的血清,在一些物质或分子的量或内容物上都有所分歧,血清使用毛病常会造成细胞无法存活.

5、何谓FBS,FCS,CS,HS?

FBS（fetalbovineserum）和FCS（fetalcalfserum）是相同的意思,两者都是指胎牛血清,FCS乃毛病的使用字眼,请不要再使用.CS（calfserum）则是指小牛血清.HS（horseserum）则是指马血清.

6、培养细胞时应使用5%或10%CO2？

或根本没有影响？

一般培养基中年夜都使用HCO3-/CO32-/H+作为pH的缓冲系统,而培养基中NaHCO3的含量将决定细胞培养时应使用的CO2浓度.当培养基中NaHCO3含量为每公升3.7g时,细胞培养时应使用10%CO2；

当培养基中NaHCO3为每公升1.5g时,则应使用5%CO2培养细胞.

7、何时须更换培养基？

视细胞生长密度而定,或遵照细胞株基本数据上之更换时间,按时更换培养基即可.

8、培养基中是否须添加抗生素？

除于特殊筛选系统中外,一般正常培养状态下,培养基中不应添加任何抗生素.

9、附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA浓度？

应如何处置？

一般使用之trypsin-EDTA浓度为0.05%trypsin-0.53mMEDTA.4Na.次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中,保管于–20℃,防止反复冷冻解冻造成trypsin之活性降低,并可减少污染之机会.

10、悬浮性细胞应如何继代处置？

一般仅需继续加入新鲜培养基于原培养角瓶中,稀释细胞浓度即可,若培养液太多时,可将培养角瓶口端稍微抬高,直到无法容纳为止.分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶,加入新鲜培养基稀释至适当浓度,重复前述步伐即可.

11、欲将一般植物细胞离心下来,其离心速率应为几多转速？

欲回收植物细胞,其离心速率一般为300xg（约1,000rpm）,5-10分钟,过高之转速,将造成细胞死亡.

12、细胞之接种密度为何？

依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可.细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因.

13、细胞冷冻培养基之成分为何？

植物细胞冷冻保管时最常使用的冷冻培养基是含5-10%DMSO（dimethylsulfoxide）和90-95%原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之.注意：

由于DMSO稀释时会放出年夜量热能,故不成将DMSO直接加入细胞液中,必需使用前先行配制完成.

14、DMSO之品级和无菌过滤之方式为何？

冷冻保管使用之DMSO品级,必需为Tissueculturegrade之DMSO（如SigmaD2650）,其自己即为无菌状况,次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中,保管于4°

C,防止反复冷冻解冻造成DMSO之裂解而释出有害物质,并可减少污染之机会.若要过滤DMSO,则须使用耐DMSO之Nylon材质滤膜.

15、冷冻保管细胞之方法？

冷冻保管方法一:

冷冻管置于4℃30~60分钟→（-20℃30分钟*）→-80℃16~18小时（或隔夜）→液氮槽vaporphase长期贮存.冷冻保管方法二:

冷冻管置于已设定法式之可法式降温机中每分钟降1-3℃至–80℃以下,再放入液氮槽vaporphase长期贮存.*-20℃不成超越1小时,以防止冰晶过年夜,造成细胞年夜量死亡,亦可跳过此步伐直接放入-80℃冰箱中,惟存活率稍微降低一些.

15、细胞欲冷冻保管时,细胞冷冻管内应有几多细胞浓度？

冷冻管内细胞数目一般为1x106cells/mlvial,融合瘤细胞则以5x106cells/mlvial为宜.

16、应如何防止细胞污染？

细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌.主要的污染原因为无菌把持技术不妥、把持室环境欠安、污染之血清和污染之细胞等.严格之无菌把持技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之方法.

17、如果细胞发生微生物污染时,应如何处置？

加入相应抗生素.直接灭菌后抛弃之.

18、支原体（mycoplasma）污染的细胞,是否能以肉眼观察出异状？

不能.除极有经验之专家外,年夜大都遭受支原体污染的细胞株,无法以其外观分辨之.

19、支原体污染会对细胞培养有何影响？

支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数,代谢及研究之任一数据.故进行实验前,必需确认细胞为mycoplasma-free,实验结果之数据方有意义.

20、CO2培养箱之水盘如何坚持清洁？

按期（至少每两周一次）以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之.

21、为何培养基保管于4℃冰箱中,颜色会偏暗红色,且pH值会越来越偏碱性？

培养基保管于4℃冰箱中,培养基内之CO2会逐渐溢出,造成培养基越来越偏碱性.而培养基中之酸碱指示剂（通常为phenolred）的颜色也会随碱性增加而更偏暗红.培养基偏碱之结果,将造成细胞生长停滞或死亡.若培养基偏碱时,可以通入无菌过滤之CO2,以调整pH值.

22、各种细胞培养用的dish,flask是否均相同？

分歧厂牌的dish或flask,其所coating的polymer分歧,制造法式亦分歧,虽对年夜部份细胞没有太年夜之影响,惟少数细胞则可能因使用厂牌分歧之dish或flask而有显著之生长不同.

23、购买之细胞冷冻管经解冻后,为何会发生细胞数目太少之情形？

购买之细胞死亡或细胞存活率欠安可能原因？

研究人员在细胞培养时呈现存活率欠安,罕见原因可归纳为：

培养基使用毛病或培养基品质欠安.血清使用毛病或血清的品质欠安.解冻过程毛病.冷冻细胞解冻后,加以洗涤细胞和离心.悬浮细胞误认为死细胞.培养温度使用毛病.细胞置于–80℃太久.

24、收到之冷冻管瓶身破裂,瓶盖有裂纹,或瓶盖脱落之原因？

冷冻管瓶盖裂纹,或瓶身破裂,可能是因为把持者夹取冷冻管时用力不妥,造成冷冻管裂损,建议使用止血钳小心夹取.另冷冻管瓶盖松动或松脱,乃因热胀冷缩之物理现象,冷冻管有可能因此而造成细胞污染,故冷冻管于放入和取出液氮桶时,均应立刻将冷冻管再一次扭紧.

25、如何选用特殊细胞系培养基？

培养某一类型细胞没有固定的培养条件.在MEM中培养的细胞,很可能在DMEM或M199中同样很容易生长.总之,首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始,各种目的无血清培养首选AIMV（12005）培养基（SFM）.

26、L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？

它在溶液中不稳定吗？

L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的.脱失落氨基后,L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、介入卵白质的合成和核酸代谢.L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解,可是确切的降解率一直没有最终定论.L-谷氨酰胺的降解招致氨的形成,而氨对一些细胞具有毒性.

27、GlutaMAX-I是什么？

培养细胞如何利用GlutaMAX-I？

这个二肽有多稳定？

GlutaMAX-I二肽是一个L-谷氨酰胺的衍生物,其不稳定的alpha-氨基用L-丙氨酸来呵护.一种肽酶逐渐裂解二肽,释放L-谷氨酰胺供利用.GlutaMAX-I二肽非常稳定,即使在121磅灭菌20分钟,GlutaMAX-I二肽溶液有最小的降解,如果在相同条件下,L-谷氨酰胺几乎完全降解.

28、什么培养基中可以省去加酚红？

酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂：

中性时为红色,酸性时为黄色,碱性时为紫色.研究标明,酚红可以模拟固醇类激素的作用,（特别是雌激素）.为防止固醇类反应,培养细胞,尤其是哺乳类细胞时,用不加酚红的培养基.由于酚红干扰检测,一些研究人员在做流式细胞检测时,不使用加有酚红的培养基.

29、培养基中丙酮酸钠的作用是什么？

丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源,尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源,可是,如果没有葡萄糖的话,细胞也可以代谢丙酮酸钠.

30、二价离子抑制胰卵白酶活性吗？

使用胰卵白酶时加入EDTA的目的是什么？

二价离子简直抑制胰卵白酶活性.EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子,以便坚持抑制胰卵白酶的活性.建议胰卵白酶处置细胞前,用EDTA清洗细胞,以消除来自培养基中所有的二价离子.

31、书上说,Hank‘s平衡盐溶液（HBS）要在空气中使用,不需要CO2培养箱.原因是什么？

Hank’s平衡盐溶液（HBS）和Earle‘s平衡盐溶液（EBS）有什么实质的功能分歧？

HBS和EBS的主要分歧在于碳酸氢钠的水平,在Eagles（）中比在Hanks（）中高.碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡,以维持溶液的PH值.Eagles液在空气水平的CO2中,溶液会变碱,Hanks液在CO2培养箱中会变酸.如果希望在CO2培养箱中保管组织,需要用Eagles液,.如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中贮存的组织,用Hanks液就可以了.