API含量测定验证方案1Word文档格式.docx
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姓名
部门
1、概述………………………………………………………………………………………………5
2、试验所需仪器……………………………………………………………………………………5
3、试剂和样品………………………………………………………………………………………5
4、色谱条件…………………………………………………………………………………………5
5、溶液配制…………………………………………………………………………………………5
6、专属性试验………………………………………………………………………………………6
7、溶液稳定性试验…………………………………………………………………………………6
8、线性试验…………………………………………………………………………………………7
9、回收试验…………………………………………………………………………………………7
10、精密度试验……………………………………………………………………………………8
11、检出限和定量限………………………………………………………………………………9
12、含量测定方法评价……………………………………………………………………………10
1、概述
通过对API含量测定方法的验证,得到可信赖的和准确的数据,用于药品的含量测定,从而验证该方法的可行性。
2、试验所需仪器
分析天平(灵敏度为0.01mg)型号编号有效期
液相色谱仪型号编号有效期
3、试剂和样品
乙腈HPLC级
API标准品USP标准品
API有关物质AUSP标准品
有关物质BUSP标准品
有关物质CUSP标准品
4、色谱条件
色谱柱:
4.6mm×
10cmC8柱,其填料粒径为3.5微米
检测波长:
254nm
流速:
1.0ml/min
进样量:
20μl
柱温:
40℃
流动相:
A溶液和B溶液不同比例的混合溶液。
(见下表)
其中,稀释液——水:
乙腈(60:
40)
A溶液——水:
乙腈(70:
30)
B溶液——水:
乙腈(50:
50)
时间(分钟)
A溶液
B溶液
洗脱方式
0-6.5
100→50
0→50
线性梯度
6.5-10
50→0
50→100
10-20
100
衡梯度
20-20.1
0→100
100→0
20.1-28
5、溶液配制
系统适应性溶液:
取API标准品和API相关物质A和相关物质B标准品,精密称定,用稀释液配制成0.05mg/ml的溶液。
标准溶液:
取适量API标准品,用乙腈溶解,超声处理,得到1.0mg/ml的溶液。
取4ml该溶液置于10ml容量瓶中,用水稀释至刻度。
用稀释液进一步稀释,即得浓度为0.04mg/ml的溶液。
供试溶液:
取本品约20mg,置于50ml容量瓶中,精密称定,用20ml乙腈溶解(可以超声处理),然后用水稀释至刻度。
吸取1ml此种溶液置于10ml容量瓶中,用稀释液稀释至刻度,混匀即得。
6、专属性试验
取系统适应性溶液注入色谱系统,记谱色谱图,API相关物质B(离API峰最近的杂质峰)与API峰的分离度应不小于1.5,各杂质峰分离良好,同时取稀释液作空白溶液,注入色谱系统,记谱色谱图,在API出峰处无干扰峰出现。
同时与API降解试验结果对比,各降解产物峰在API峰处无干扰,不影响API测定。
7、溶液稳定性试验
吸取1ml此种溶液置于10ml容量瓶中,用稀释液稀释至刻度,混匀即得制成供试品溶液。
取供试品溶液分别于0小时,2小时,4小时,6小时,8小时注入色谱系统,记谱色谱图,记录API峰面积,8小时内API峰面积的相对标准偏差(RSD%)不大于2.0%。
时间(h)
2
4
6
8
RSD(%)
API峰面积
8、线性试验
200%标准贮备溶液:
取API标准品20mg,精密称定,置50ml容量瓶中,用20ml乙腈溶解(可以超声处理),然后用水稀释至刻度。
精密吸取10ml此种溶液置于50ml容量瓶中,用稀释液稀释至刻度,混匀即得浓度为0.08mg/ml的200%的标准贮备溶液。
160%标准溶液:
精密移取8.0ml的200%标准储备溶液置10ml容量瓶中,加稀释液稀释至刻度,混匀即得。
120%标准溶液:
精密移取6.0ml的200%标准储备溶液置10ml容量瓶中,加稀释液稀释至刻度,混匀即得。
100%标准溶液:
精密移取5.0ml的200%标准储备溶液置10ml容量瓶中,加稀释液稀释至刻度,混匀即得。
80%标准溶液:
精密移取4.0ml的200%标准储备溶液置10ml容量瓶中,加稀释液稀释至刻度,混匀即得。
40%标准溶液:
精密移取2.0ml的200%标准储备溶液置10ml容量瓶中,加稀释液稀释至刻度,混匀即得。
20%标准溶液:
精密移取1.0ml的200%标准储备溶液置10ml容量瓶中,加稀释液稀释至刻度,混匀即得。
分别取上述线性供试品溶液注入液相色谱仪,记录API峰面积,以API的峰面积对其浓度进行一元线性回归,其相关系数(R)不小于0.999。
线性溶液
20%
40%
80%
100%
120%
160%
200%
浓度(mg/ml)
0.008
0.016
0.032
0.04
0.048
0.064
0.08
峰面积
线性方程
Y=ax+b
相关系数
r2=
r=
9、回收试验(标准加入法)
标准溶液:
按方法要求制备
供试品溶液:
120%加标供试品溶液:
以线性试验中120%的标准溶液替代稀释液配制供试品溶液,平行制备三份。
100%加标供试品溶液:
以线性试验中100%的标准溶液替代稀释液配制供试品溶液,平行制备三份。
80%加标供试品溶液:
以线性试验中80%的标准溶液替代稀释液配制供试品溶液,平行制备三份。
测试法:
分别吸取上述配制好的溶液,按前述色谱条件进样,记录API峰面积,按下式计算回收率,要求回收率在98%~102%范围内,9个回收率的RSD%应不大于2.0%。
供试品
样品号
1
平均值
100%标准溶液
3
5
80%加标供试品
回收率%
100%加标供试品
120%加标供试品
回收率的RSD%
10、精密度试验(系统精密度,重复性和方法中间精密度试验)
方法重复性-1:
第一天(不同人或不同仪器),按5中供试品配制方法,平行配制六份样品,按含量测试法进行测定,六份样品检测结果的相对标准偏差(RSD)不大于2.0%。
方法重复性-2:
第二天(不同人或不同仪器),按5中供试品配制方法,平行配制六份样品,按含量测试法进行测定,六份样品检测结果的相对标准偏差(RSD)不大于2.0%。
每次新鲜配制标准溶液和供试品溶液。
方法中间精密度:
两次方法重复性的12个结果的RSD%应不大于3.0%。
系统精密度:
两次方法重复性试验的标准溶液的6次重复进样峰面积的RSD%应不大于2.0%。
标准溶液重复进样结果
样品份数n
RSD%
系统精密度-1
系统精密度-2
含量%
方法重复性-1
方法重复性-2
中间精密度
11、检出限和定量限
对线性溶液中20%的标准溶液的S/N进行评价,定量限S/N应不小于10,检出限S/N应不小于3。
式中:
CDL——检出限(g/ml)
CQL——定量限(g/ml)
C——样品浓度(g/ml)
S/N——信噪比
信噪比
定量限保证浓度
检出限保证
12、含量测定方法评价
附:
我们的相关提问:
1、上面5中标准溶液的配制是直接从USP31中翻译过来的,但我们觉得那种说法很繁琐,并且标准溶液和样品溶液配制方法不一致,我们觉得直接按它的供试品溶液配制方法配制标准品挺好的,后面验证时我们也是就按供试品溶液配制法配的标准溶液。
不知是否妥当,请你们参考一下。
有关物质验证时也涉及到这个问题。
2、含量方法中间精密度12个数据的RSD%多少合适,相关物质呢?
我们以前做国内只做过6个数据的评价。
3、原料药的回收试验怎么做啊,请指点一下。
上面我们是按你们给我们残留溶剂的方案套用过来的。
我们以前做国内一般都不做原料药的回收试验,而是直接从精密度等其他验证项目中推论而得。
我们只做过制剂的向空白辅料里加原料的回收试验。
4、我们的含量和相关物质都是按USP31方法做的,是不是实际上只需做精密度,溶液稳定性,专属性,降解试验就可以了?
5、我们看了一下Q2A,含量测定时是不是不需做检出限和定量限?
6、在上面的含量方案里我们把所有验证内容都理出来了,还是请你们一一给我们审阅一下,把你们的建议给我们提出来。
非常的感谢!
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- API 含量 测定 验证 方案