突变型人APP基因与增强型绿色荧光蛋白基因融合载体的构建Word文档格式.docx
- 文档编号:21281619
- 上传时间:2023-01-29
- 格式:DOCX
- 页数:5
- 大小:19.24KB
突变型人APP基因与增强型绿色荧光蛋白基因融合载体的构建Word文档格式.docx
《突变型人APP基因与增强型绿色荧光蛋白基因融合载体的构建Word文档格式.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《突变型人APP基因与增强型绿色荧光蛋白基因融合载体的构建Word文档格式.docx(5页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
结果经过酶切鉴定、PCR和DNA测序等方法,证实构建的pIRES2EGFP/APP695突变型质粒载体序列正确。
结论成功构建APP695EGFP融合基因载体,为研究AD发病的分子机制和治疗时的药物筛选奠定基础。
【关键词】瑞典突变APP695;
增强型绿色荧光蛋白;
APP695EGFP融合基因;
载体
【Abstract】ObjectiveToconstructandexpressarecombinantvectorbearingfusiongeneofhumanamyloidprecursorprotein(APP)695mutantgeneandenhancedfluorescenceprotein(EGFP)fusiongene.MethodsTheprimersweredesignedaccordingtothesequencesofAPP695genefoundfromNCBI.ThenthemutantAPP695wasamplifedbyPCRwithpCB6carryingwildhumanAPP695andactingasatemplate,thegeneofmutantAPP695wasligatedtopIRES2EGFP.TherecombinantplasmidofpIRES2EGFP/APP695mutantwasverfiedbycheckingsequences.ResultsTheexactsequencesofpIRES2EGFP/APP695mutantvectorwereconfirmedbydigestionofrestrictionendonucleases,PCRandsequencing.ConclusionsThepIRES2EGFPAPP695mutantfusiongenerecombinationhasbeenconstructedsuccessfully,whichlaysthefoundationforfurtherresearchofADpathogenesisandscreeningnewdrugtargetsonADtherapy.
【Keywords】SwedishmutantAPP695;
EGFP;
FusiongeneofhumanAPP695/EGFP;
Vector
淀粉样前体蛋白(amyloidprecursorprotein,APP)基因是Alzheimer病(AD)已发现的诸多相关基因之一。
APP基因某些位点的突变可以引发某些家族的早发性AD,故APP的突变在AD发病中的作用引起了广泛关注。
本研究应用增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescenceprotein,EGFP)作为报告基因,将APP695突变基因与其融合,构建突变型APP695EGFP融合基因载体,为进一步研究APP695突变在AD发病中的作用,以及筛选对AD有治疗作用的药物奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
携带野生型人类APP695的pCB6质粒,由美国加利福尼亚大学细胞分子医学院许华熙博士惠赠。
携带EGFP的pIRES2质粒载体,由潍坊医学院免疫学教研室保存,DH5α感受态细胞为潍坊医学院免疫学实验室冻存。
NheⅠ、HindⅢ、SmaⅠ、XbaⅠ等限制性内切酶,T4DNA连接酶与TaqDNA聚合酶,引物等均购自上海生工生物工程技术服务公司。
1.2方法
1.2.1pIRES2EGFPAPP695融合基因重组质粒的构建
将携带EGFP的pIRES2质粒载体用NheⅠ、HindⅢ酶切后,采用PCR扩增突变型APP基因,用Premier5软件设计PCR引物,以pCB6APP695野生型质粒载体DNA作为模板,PCR扩增突变APP基因。
引物序列为:
TA1APPU:
5′attgctagcatgctgcccggtttggcactg3′,TA2APPMU:
5′tctgaagtgaatctggatgcagaat3′,TA3APPMD:
5′attctgcatccagattcacttcaga3′,TA4APPD:
5′gttaagcttctagttctgcatctgctcaaag3′。
模式:
引物TA2、3为一对反向互补的cDNA序列,但在其中引入两个LN,ML的突变,TA1、4包括了整个APP序列,并且含有NheⅠ、HindⅢ酶切位点(图1)。
先将两个小片段进行PCR扩增得到回收片段,片段大小分别为1785bp、303bp,将获得的两个小片段做PCR连接得到APP695突变全片段,进行PCR条件:
94℃3min,循环程序:
94℃变性45s,52℃复性45s,72℃延伸2min30s。
PCR结束后,扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,紫外光下观察结果并照相。
1.2.2PCR产物APP695突变基因全长连至pIRES2EGFP载体
流程图见图2。
经检测胶证实2088bp的PCR目的基因产物APP695,用低熔点琼脂糖电泳回收纯化后连接到pIRES2EGFP载体,进行质粒转化。
1.2.3质粒DNA抽提
根据碧云天质粒抽提试剂盒操作。
1.2.4质粒的酶切检测
提取的质粒DNA,分别用NheⅠ、HindⅢ行双酶切后,琼脂糖凝胶电泳验证。
1.2.5测序反应及测序分析
委托上海生工生物工程技术服务公司进行测序分析。
2结果
2.1目的片段的扩增
以pCB6APP695野生型质粒为模板,扩增出约1780bp左右的基因长片段和约300bp左右小片段,将大小片段连接后得到约2088bp的基因片段,与人的APP695突变型基因大小一致(图3)。
2.2pIRES2EGFPAPP695突变型质粒构建成功后酶切结果
将构建好的质粒载体,分别用NheⅠ、HindⅢ行双酶切,得到基因片段(约2088bp)和载体(5.3kb)(图4)。
2.3测序分析结果
阳性克隆经测序,所获基因序列与已发表的人APP695突变型基因序列相比基本一致(图5)。
3讨论
APP基因是AD基因分型中的AD1(家族性、常染色体显性)类型基因〔1〕,此基因定位于人染色体21q21.2,由19个外显子组成,按其转录产物的剪接方式不同可以生成若干种APP的亚型,其中最主要的三种为APP695、APP751、APP770〔2〕。
APP695蛋白为I型膜整合蛋白,主要在脑组织神经元中表达〔3〕,其比APP751、APP770缺少一段Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂结构域,生理功能至今不明〔3~5〕。
β淀粉样蛋白(βamyloidprotein,Aβ)是构成AD主要病理学特征之一,是老年斑(senileplaque,SP)的主要成分,是SP形成的始动因子,结构为β片层,又称为Aβ、βA、βA4〔1〕,来源于APP蛋白。
脑脊液(cerebrospinalfluid,CSF)中Aβ42作为生物学标志物,用于AD的早期诊断和评估疾病状态〔4〕。
APP基因产生突变后,导致Aβ聚集,从而使SP形成、突触减少、神经功能失调、神经元死亡,促进AD病情进展〔6〕。
研究证明,APP代谢途径有两种:
一种是被α分泌酶切断后产生可溶性APP(αAPPs),被释放到细胞外,能减少Aβ的生成〔7,8〕;
另一种是被β、γ分泌酶切断后生成Aβ,分泌到细胞外〔9〕,聚集纤维化后,形成淀粉样物质,沉积在脑内,从而导致AD的发生。
有研究者试图从这两个途径找到根治AD的药物,以α、β、γ分泌酶作为治疗AD的可能靶点,目前试验支持α分泌酶治疗AD的有效性,但具体机制尚不明确〔10〕,而β、γ分泌酶抑制剂的研究过程中,γ分泌酶抑制剂为非选择性抑制剂,会产生Notch抑制的副作用,因此正在研制特异性的γ分泌酶调节剂和功能单一的β分泌酶抑制剂〔4,11〕。
目前已知APP突变型基因比野生型基因更能够增加Aβ的生成。
瑞典家系的突变(Swedish突变)是APP的670/671位点密码子双重突变,即两个碱基对发生改变(Lys→Asn,Met→Leu),使赖氨酸被天冬氨酸置换,蛋氨酸被亮氨酸替代,从而导致APP的代谢过程发生改变,造成Aβ过度沉积〔12,13〕。
pIRES2EGFP载体含有pCMV启动子、EGFP的基因编码区以及两者之间的多克隆位点,既能在真核生物中表达,也能在原核生物中表达,同时EGFP比GFP产生的荧光强4~35倍〔14,15〕,而且能对目的基因表达情况示踪,所以本研究将APP695突变型基因连接到这个载体上,能更方便对APP695突变基因进行研究。
本实验经过酶切、PCR、测序鉴定,构建融合基因载体(pIRES2EGFP/APP695)成功,含有APP695突变基因的全长序列,无移码及突变。
本研究将为以后深入研究AD分子机制和药物筛选奠定试验和物质基础。
【参考文献】
1赵海峰,肖荣.Alzheimer氏病基因突变及病理改变的研究进展〔J〕.中国公共卫生,2002;
18(7):
8802.
2楼蓉,梅品超,朱宁,等.淀粉样前体蛋白基因的分子遗传学和分子生物学〔J〕.国外医学·
遗传学分册,2001;
24(3):
13842.
3MatsuiT,IngelssonM,FukumotoH,etal.ExpressionofAPPpathwaymRNAsandproteinsinAlzheimer′sdisease〔J〕.BrainRes,2007;
1161:
11623.
4长田有生.认识Alzheimer病必要的基础知识〔J〕.日本医学介绍,2007;
28(11):
51821.
5LingY,MorganK,KalshekerN.Amyloidprecursorprotein(APP)andthebiologyofproteolyticprocessing:
relevancetoAlzheimer′sdisease〔J〕.IntJBiochemsCellBiochemsCellBiol,2003;
35(11):
150535.
6TorreillesF,TouchonJ.PathogenictheoriesandintrathecalanalysisofsporadicformofAlzheimer′sdisease〔J〕.ProgNeurobiol,2002;
66:
191203.
7EtcheberrigarayR,TanM,DewachterI,etal.TherapeuticeffectsofPKCactivatorsinAlzheimer′sdiseasetransgenicmice〔J〕.ProcNatlAcadSciUSA,2004;
101:
111416.
8SmallCI,LylesGA,BreenKC.LipopolysaccharidestimulatesthesecretionoftheamyloidprecursorproteinviaaproteinkinaseCmediatedpathway〔J〕.NeurobiolDis,2005;
19:
4006.
9PengY,LeeDY,JiangL.AregulatesamyloidprecursorproteinprocessingviaproteinkinaseCandmitogenactivatedproteinkinasepathwaysinneuroblastomaSKNSHcellsoverexpressingwildtypehumanamyloidprecursorprotein695〔J〕.Neuroscience,2007;
105
(2):
38695.
10ZhangS,HuangY,ZhuYC,etal.EstrogenstimulatesreleaseofsecretedamyloidprecursorproteinfromprimaryratcorticalneuronsviaproteinkinaseCpathway〔J〕.ActaPharmacologicaSinica,2005;
26
(2):
1716.
11NawrotB.TargetingBACEwithsmallinhibitorynucleicacidsafutureforAlzheimer′sdiseasetherapy〔J〕?
ActaBiochimPol,2004;
51
(2):
43144.
12WangYP,WangZF,ZhangYC,etal.Effectofamyloidpeptidesonserumwithdrawalinducedcelldifferentiationandcellviability〔J〕.CellRes,2004;
14(6):
46772.
13RocchiA,PellegriniS,SicilianoG,etal.CausativeandsusceptibilitygenesforAlzheimer′sdisease:
areview〔J〕.BrainResBull,2003;
61:
124.
14ChenT,LiX,YangY,etal.LocalizationoflensintrinsicmembraneproteinMP19andmutantproteinMP19(To3)usingfluorescentexpressionvectors〔J〕.MolVis,2002;
8(39):
37288.
15ToelenJ,DerooseCM,GijsbersR,etal.Fetalgenetransferwithlentiviralvectors:
longterminvivofollowupevaluationinaratmodel〔J〕.AmJObstetGynecol,2007;
196(4):
3526.
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 突变型 APP 基因 增强 绿色 荧光 蛋白 融合 载体 构建