用于蛋白质偶联的亲水性聚合物载体专利译文文档格式.docx
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根据GermanOffenlegungsschriftNO.2722751,如果交联单体在单体混合物中所占的比例是5%或更多,丙烯酰胺,甲基丙烯酰胺或甲基-双丙烯酰胺,或亚甲基-双-甲基丙烯酰胺的重量比例超过某一界限值的话,用这种方法得到的聚合物具有空白的珍珠结构,这被认为对于高键联活性是非常重要的。
这种已为人们所知的亲水性珍珠聚合物由包含有环氧基团的单聚体单元(这种环氧基团能够偶联蛋白质),组成,比如缩水甘油基甲丙烯酰胺盐或烯丙基缩水甘油醚。
这些单聚体单元水可溶性蛋白质与它们共价偶联,且维持它们的生物活性,尽管以这种方式得到的聚合物与一些酶可达到高的结合能力,然而与其他酶类的结合能力却仍然不尽如人意。
“结合能力”被人们理解的是珍珠状聚合物达到最大量吸附负载某种特定酶时这种酶的活性大小。
已经证实,靠提前环氧基团在珍珠聚合物表面的含量,或是在键连酶时使用这种酶的高浓度溶液,无法提高或无法从根本上提高某种特定酶的界限。
本专利的目的在于提高这种可在环氧基团上共价偶联蛋白的亲水性珍珠聚合物的键合能力。
从狭义上讲,本发明的目标在于如何在考虑键合某种蛋白时这种珍珠状载体的键合能力优化。
人们现在已发现,用本发明所说的方法可形成一种结合能力提高了的,对某些酶来说甚至是最优化的键合能力的珍珠状载体聚合物。
有机介质
分子量
氧原子含量(重量%)
溶解性系数
delta
DeltasubD
甲醇
32
50
14.3
7.4
乙醇
46
35.0
12.9
7.7
正丙醇
60
26.7
11.9
7.8
异丙醇
11.5
----
正丁醇
74
21.6
11.3
丙酮
58
27.6
9.8
7.6
乙酰丙酮醇
116
10.2
甲基乙基酮
72
22.2
9.3
四氢呋喃
9.5
8.2
二甲基甲酰胺
73
22.0
12.1
8.5
乙烯基醋酸
88
36.4
9.1
乙烯醇
90
35.5
8.3
二乙烯醇
118
27.1
7.9
水,甲酰胺,乙二醇,或二甲基亚砜或它们的混合物可被用作稀释剂的A组分。
令人惊讶的是,尽管水可与环氧基团很容易反应(这些环氧基团对键合能力是非常重要的),但采用这种聚合方法时,即使是用水作A组分,该载体对蛋白质的键合能力仍维持很高。
至于稀释剂的B组分,某些因具有氧原子而具有高极性的有机液体介质被证实的是很适合做(B)。
如果这种有机液体的氧含量在20%以上,并且分子量低于200,所要求的极性就足够了。
这种有机液体如果是脂肪族有机液体,氧原子的羰基或羟基形式存在更好。
另一方面,羰基由于具有与环氧基团高度的反应活性在此方法中又不适应。
在酯键连接中发现的氧原子也可提供理想的极性,比如脂肪族,脂环醚和脂肪醚。
对本发明的方法合适的组分(B)绝大多数的总溶解性系数(delta)在(9-15)之间,特别是11—14.5,Hildebrand单位,或分散溶解性系数(ΔsubD)。
在7—9范围内,最好是在7.4—8.5HilderbrandUnits(Cf.Polymer-HandbookSecondEdition,1975,pagesIV337,etSep.,incorporatedhereinbyreference)
单体混合物与稀释剂组分(A)和(B)。
必须形成均匀相,如果可能的话应选择那些在室温下(20℃),就已经能形成均匀相的介质,这里不可能列出所有可能的组合。
再进一步讲,这种均匀相混合物与所悬浮的有机介质必须不互溶,至少在聚合温度时应该不互溶,这样一种隔离的悬浮单体相形成了。
假如稀释剂组分在有机介质中有一定的溶解度,这些组分中的单聚体相可能被消耗光,从而导致键合能力的变化。
无论如何为了达到特别的键合能力,这里建议有机介质在聚合前用稀释剂组分(A)或(B)(能在有机介质中可溶的)预先饱和,或调节至相应的平衡浓度。
通过这种方法有机介质的极性增强。
稀释剂组分往有机介质中加入的量必须维持在某一限之下,在这个极限值,单聚体相会溶解在有机相之中。
通过选择足够非极性的有机介质,可避免这种方法的上述极限值。
这里要推荐的是脂肪族烃和氯代烃,或它们的混合物。
如果组分(A)和(B)完全互溶的话是非常有好处的,因此如果可能的话,使它们在室温下就已经完全互溶。
组分(B)的有机液体最好是在室温下就与水完全互溶的一族,如甲醇,乙醇,丙醇,丙酮,二甲基甲酰胺,或四氢呋喃。
从技术角度上而言,一个特别有优势的组合是甲醇和水的混合物。
组分(A)和(B)互相混合的比例可在很宽的范围内进行选择,重量百分比可在99:
1~1:
99之间,其中最好为90:
10~10:
90之间。
由组分(A)和(B)组成的稀释剂的数量,在单体相中可在20%~90%(重量比),最好在50%~90%之间。
为了确定这个部分的量和组分(A)与(B)的比例大小,在小试批量生产中一系列不同的珍珠聚合物被相应的制备出来,每种情况下对某种特定蛋白质的键合能力测定出来。
这样发现了一个规律,即随着(A)和(B)的比例的变化,键合能力上升直至达到一个最大值,那以后(thereafter)出现下降(如下所示),用于反相聚合的单体包括
30份(重量)的甲基丙烯酰胺
30份(重量)的N,N’-亚甲基双-甲基丙烯酰胺
20份(重量)的缩水甘油基醚甲基丙烯酰胺
20份(重量)的烯丙基缩水甘油醚
73份(重量)的甲醇与丙烯酰胺的混合物
所得产物用来在最优条件下偶联青霉素-酰基转移酶(PCA)
稀释剂
最大量酶
A
B
activity
甲酰胺
甲醇
(U/g)
10
90
71
30
70
101
50
124
125
100
0
95
对于其它酶来说,这个系统的活性最大值时(A)和(B)的比例可能有所不同。
为了确保珍珠聚合物的亲水性,在这种制备中使用的单聚体混合物必须绝大多数为亲水性的单聚体。
甲酰胺,甲基丙烯酰胺和它们的亚甲基-双-酰胺属于这一类单体,以及这一类的不饱和的自由基可聚合单体,形成时在室温下10%以上形成这种单体,这种情况下最好不要含有离子基团,或加入酸或碱时可离子化的基团。
这一类适合的亲水性共聚单体的例子有:
不饱和可聚合的碳酸的羟烷基酯,比如羟乙基丙烯酸盐,羟乙基甲基丙烯酰盐,2-羟丙基-丙烯酸盐或2-羟丙基-甲基丙烯酸盐,和N-乙烯基吡咯烷酮(pyrrolidone)。
丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺和它们的亚甲基-双-酰胺在其中出现的数量至少占30%,最好在50%以上,延伸亲水性共聚体在可聚合单体中出现的数量可机动调节,最高值为65%。
单体中有环氧基团的在单体混合物中出现的数量在5~60%之间。
这些单体可为缩水甘油基丙烯酰胺,缩水甘油基甲基丙烯酰胺,烯丙基缩水甘油醚。
如果需要的话,也可同时使用。
当珍珠聚合物与蛋白质充分反应后,或与水介质充分接触后,环氧基团逐步完全转化成羟基,这种处理方法使得聚合物的亲水性进一步增加。
延伸共聚体的亲水性稍差一些,它会使饱和水溶液中室温下聚合物亲水性下降10%,如果使用的话,其在单体相中重量百分含量小于25%。
用本发明制备的珍珠状聚合物是高度交联的。
用作交联剂的有效共聚单体,分子中有两个或更多的未饱和乙烯基可供聚合,这种交联剂在单体混合物中至少占5%的组成。
一般而言,亚甲基-双-丙烯酰胺或亚甲基-双-甲基丙烯酰胺可用作交联剂。
在这种情况下,可聚合单体中,这种交联单体的数量超过90%(重量比)。
然而如果其他交联单体用来代替它,或对其进行添加补充的话,这种单体的数量限制,其最多只能占45%。
悬浮的单体相包含聚合引发剂,优化延伸剂作为延伸成分,这些都是目前聚合工艺上已知的东西。
从本质上而言反相珍珠聚合的方法是已知的。
单体相通过搅拌悬浮在有机介质中,那里面最好含有可溶性分散介质,以形成10μm到1000μm直径的液滴。
粒子尺寸的大小通过选择分散剂的种类和数量,搅拌的速率而调节到理想的值。
聚合在单体液滴内发生,将液滴转化成固体珍珠聚合物,这些聚合物在聚合结束后可从有机介质中分离出来。
德国专利NO.2009218,和GermanAuslegeschriftNO.2237316,GermanOffenlegungsschriftNO.2722751中描述了这种方法的好处体现。
在许多情况下,珍珠状聚合物会有团聚形成大团聚体的趋势,从处理的观点而言这可通常不是人们想要的结果。
这种不利之处可用将聚合物溶解在单体相中增加其粘性而避免这种趋势。
为了不转移最终产品的亲水性,这种聚合物添加剂也应该是亲水的,而且由与珍珠聚合物相同的同一种单体组成,并且不能是交联单聚体。
例如,如果一种水-甲醇混合物被用作稀释剂,聚甲基丙烯酰胺就适合用作聚合物的添加剂。
这种类型的聚合物添加剂的有效数量在0.1~20%(以单体重量进行计算)之间。
延伸聚合物添加剂能被用作低级烯丙基丙烯酰胺的共聚物,如butylacrylate(丁基丙烯酰胺),与丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺或缩水甘油醚甲基丙烯酰胺,可以使用的延伸聚合物添加剂之一是低级烯丙基丙烯酰胺(比如丁基丙烯酰胺)与丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺或缩水甘油醚甲基丙烯酰胺的共聚物。
珍珠聚合结合后,这种聚合物珍珠可以从有机介质过滤出来。
如果水或其它化合物有活性氢原子,比如说酒精或乙二醇,这些被用作稀释剂,这些东西必须出去,不然的话这些分子会与发生贮藏时十分害怕出现的与环氧基团的反应。
挥发性溶剂,如水和乙醇用干燥法很易除去。
难挥发物质,比如乙二醛,甲酰胺,或二甲基亚砜用挥发性有机溶剂丙酮很易冲洗出来。
然后,蒸去溶剂的残留物。
干燥以后,聚合物珍珠变成坚强而干燥的东西,在没有湿气的存在下可贮存足够长的时间。
连接好蛋白质后,珍珠聚合物与最高可能浓度的蛋白质溶液相混,从某个角度而言,只考虑水溶液。
这种用法最重要的用途是酶的固定,比如青霉素-酰基转移酶,胰蛋白酶,或乳糖酶。
下列例子,是按照描述方法给出的,列出了根据本发明使用不同的稀释剂组合键合能力的增加。
(Example1=methanol/water),与仅使用单一稀释剂得到的产品的键合能力(Example2=甲酰胺)。
最高键合能力能通过改变稀释剂中组分A与B的混合比例得到(Cf.Example9intheseriesofExample7-10andthetablesuprainthespecification)。
通过比较例子3-5和例子1,聚合物组成的变化能改变最大键合能力位置相对于(A)与(B)的混合比例。
从比较中我们可以看出使用30%或30%以上的,特别是50%或50%以上的高含量交联单聚体(以单聚体混合物的重量计),其中
MA----methacrylamide甲基丙烯酰胺
MBMA-----methylenebis-methacrylamide亚甲基双甲基丙烯酰胺
GM-----Glycidylmethacrylate缩水甘油醚甲基丙烯酸酯
AGE---allylglycidylether烯丙基缩水甘油醚
*表示在单体相中加入了聚甲基丙烯酰胺
离子序数
MA
MBMA
GM
AGE
水
青霉素-酰基转移酶或胰蛋白酶活性
1
---
80
10
20
122
2
100
3
30
40
4
65[6.5]
5
7
6
70
125
8
71
9
95
11*
[10.2]
比较例子6和7可以看出,稀释剂组分用另一种液体替换,而聚合体组成维持恒定,在活性上能够带来可观的差异,因此对于(A)与(B)混合比例的不同,其活性最大值是独立决定的。
举例说明
例子1
1740克正己烷,1100克全氯乙烯,9克聚合乳化剂(一种共聚物,含95份正丁基甲基丙烯酸酯,5份2-三甲基氨-乙烯基-甲基丙烯酰氯),和5克干冰被引入一个6升大的带搅拌容器中,水分离器,回流冷凝器,和氮气进口管和温度计装配在容器中,和氮气进口管和温度计装配在容器中。
在搅拌时引入氮气,一种含有下列物质的混合物
640克甲醇
160克水
240克亚甲基双甲基丙烯酰胺
30克烯丙基缩水甘油醚
30克缩水甘油醚甲基丙烯酸盐(酯)
6克4,4’-偶氮双-(4-氰基戊酸)
在50℃时加入,在有机相中分布,然后加热至65℃~70℃。
大约6小时后,甲醇/水几乎全部循环出反应系统,剩下的东西继续反应4小时完成聚合反应,然后冷却至室温。
珍珠形成,过滤后,真空下在40℃干燥12小时。
经负载青霉素-酰基转移酶的活性是122U/g。
偶联青霉素-酰基转移酶的过程为
500g珍珠在23℃与1.6ml青霉素-酰基转移酶溶液(其中含有1.05ml酶的0.1M磷酸钾缓冲液,该缓冲液中含醋酸钾1M,pH为7.5),一起温育72小时,然后,这些珍珠可采用过滤分离,用1M氯化钠溶液冲洗3次,用pH=7.5的磷酸盐缓冲溶液冲洗2次。
所得到的酶制剂珍珠与溶在0.05MpH=7.5的磷酸盐溶液中的20ml2%的青霉素G溶液在37℃下温育,所释放出来的苯乙酸用0.5MNaOH滴定。
酶的活性以每克雾湿珍珠进行计算,有1U/g活性相当于每分钟每克湿珍珠消耗1μmolNaOH。
例子2(对照例子)
装置与反应程序与例子1中的完全相同,除了没有溶剂循环出这个系统以外。
在反应的最后,处于生成珍珠上方的相被倾倒掉,珍珠用2000ml丙酮清洗3遍,分离过滤。
珍珠然后用丙酮再洗3次,真空下干燥12个小时。
与青霉素-酰基转移酶偶联后,活性为73U/g。
例子3
装置,悬浮相,和反应程序与例子1相类似。
单体相组成如下:
在努力试图偶联青霉素-酰基转移酶上珍珠聚合物后,没测出有任何酶活性。
例子4
例子3使用160克甲醇和640克脱盐水添进单体相,得到的珍珠部分已发生聚集。
偶联青霉素-酰基转移酶后,测得的酶活性为65U/g。
例子5
例子3中在单体相中加入80克甲醇和720克水进行重复。
偶联青霉素-酰基转移酶后,测得的酶活性为7U/g。
例子6
装置,悬浮相,和反应程序与例子1相同。
单体相的组成如下:
240克甲醇
560克水
150克亚甲基-双-甲基丙烯酰胺
30克甲基丙烯酰胺
60克烯丙基缩水甘油醚
60克缩水甘油醚甲基丙烯酸酯
6克4,4’-偶氮双-(4-氰基戊酸)
偶联上青霉素-酰基转移酶后,得到的酶活性为30U/g。
例子7
装置,悬浮相和反应程序与例子2的相同。
553克甲酰胺
237克甲醇
150克亚甲基-双-甲基丙烯酰胺
60克烯丙基缩水甘油醚
60克缩水甘油醚甲基丙烯酸酯
6克苯甲酰过氧化物
6克二甲基苯胺(CH3)2C6H3NH2(当单体相在有机相中分散均匀后加入)
偶联上青霉素-酰基转移酶后,得到的酶活性为125U/g。
例子8
在单体相中加入79克甲酰胺和711克甲醇重复例7。
偶联上青霉素-酰基转移酶后,得到的酶活性为71U/g。
例子9
在单体相中加入711克甲酰胺和79克甲醇重复例7。
偶联上青霉素-酰基转移酶后,得到的酶活性为125U/g。
例子10(对照例子)
在单体相中加入791克甲酰胺重复例7。
偶联上青霉素-酰基转移酶后,得到的酶活性为95U/g。
例子11
装置,悬浮相和反应条件与例子1的类似
30克聚甲基丙烯酰胺
160克甲醇
640克水
81克甲基丙烯酰胺
81克N,N’-亚甲基双甲基丙烯酰胺
54克烯丙基缩水甘油醚
54克缩水甘油醚甲基丙烯酸盐(酯)
与例4相比,得到的珍珠为圆的均一珍珠。
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