广州大学生物工程下游技术实验超氧化物歧化酶SODWord格式文档下载.docx
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<
一>
材料:
绿豆种子,市售新鲜绿豆种子浸泡蒸馏水24小时备用。
二>
试剂:
葡聚糖(sephadexG-100或G150),NaCl(AP),磷酸氢二钠(AP),磷酸二氢钠(AP),三羟甲基氨基甲烷(Tris),盐酸(浓盐酸),硫酸铵(AP),PEG6000,考马斯蓝G250,磷酸,乙醇(AP),牛血清蛋白BSA,连苯三酚(焦性没食子酸),甲硫氨酸(methionine),NBT(氮兰四唑NitroblueTetrazdinna),核黄素,EDTA(钠盐),超氧化物歧化酶(sigma公司),
三>
仪器:
离心机
WFZ-UV2000型紫外分光光度计
201×
7(717)强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂
匀浆机、各型号烧杯、试管、量筒、带毛塞试管、漏斗、移液枪、
移液管、玻璃棒等
四>
实验方法和步骤:
1.材料处理和取样
1).25g绿豆,洗涤,蒸馏水浸泡过夜,加入250mlpH70.05mol/Lpb液,匀浆机匀浆,二层纱布过滤,离心(3000rpm)得清液,取少量样为样①,进行SOD活性测量,计算材料中SOD总活性单位及比活性单位(units/mgPr)
2).实验流程:
1.称量25g绿豆+250mlpH70.05mol/Lpb液,匀浆,两层纱布过滤,离心(3000rpm)15Min取清液,取少量样为样①,测量SOD活性、蛋白质含量测量,计算SOD总活性单位及活性单位。
2.所得清液测量总体积,缓慢40%饱和(NH4)2SO4至浓度为19.4g/100ml,4℃冰箱静置分层。
3.离心(3000rpm)取清液,取少量为样②,测量SOD活性、蛋白质含量测量,计算SOD总活性单位及活性单位。
4.步骤3中的清液缓慢加入硫酸铵至75%饱和度(8.7g/100ml)(过程充分搅拌),5℃至分层,离心(3000rpm)取沉淀,取样③,计算SOD总活性单位及活性单位。
5.装入透析袋中,于蒸馏水中5℃透析过夜。
6.透析后溶液用滤纸过滤得清液,重新装入透析袋中用PEG浓缩。
7.
装柱:
1)排气泡加蒸馏水留15%体积水
2)100mLG100一次装完
3)静置10min打开出液口排过量洗脱剂
4)保留离胶面2-3cm接洗脱瓶平衡30min理想流速
△注意①胶面始终保持水层②洗脱瓶:
pH7,0.02MPb
8.层析过程
①样品:
浓缩液离心过滤体积31mL
取样
②上样:
5%上样量2-3mol
③洗脱:
1mL/min,3mL/支,共收100-120mL
*测
(1)A280值
(2)SOD活性(粗略)20支管每支3mL
(3)搜集活性峰并测酶活性
2.植物超氧化物歧化酶(SOD)活性测量
1)连苯三酚法测定SOD活性:
溶液配制:
1,连苯三酚:
630mg------100ml10mmol/LHCl(0.085ml36%的浓HCl,用蒸馏水配成100ml)。
共配500ml.
2,pH8.3050mmol/LTric-HCl:
A)0.1mol/LTris:
12.114g-----1000ml(储备液)
B)0.1mol/LHCL:
浓盐酸稀释得到(8.5ml36%的浓HCl,用蒸馏水配成1000ml)(储备液)
0.05mol/LpH8.3:
500mlA+199mlB-------定容到1000ml..
操作:
25C,3ml50mmol/LpH8.30的Tric-HCL缓冲液,加入10l50mmol/L连苯三酚(具体加入量应每次测量前校正,加入的原则是使下面的A325变化控制在0.07/min左右),迅速摇匀,倒入光径1cm的比色杯(应该用石英杯)中,每30秒测一次A325值,自氧化速率的变化(A)控制在0.07/min左右,加入酶液后再测连苯三酚自氧化速率的变化(A’),酶量的加入控制在使加样后的A’在0.035/min左右。
(以上AA’的变化值不需特别严格,A只要控制在0.1以下0.04以上,A’变化在A的约一半左右即可)
3.考马斯蓝G-250测蛋白的方法:
实验器材:
分光光度计,试管及试管架,比色皿,移液管;
移液枪
实验材料与试剂:
●考马斯亮蓝G-250(0.01%,W/V):
100mg考马斯亮蓝G250溶于50ml95%的乙醇中,加入100ml85%的磷酸,将溶液用水定容到1000ml,过滤得清液于棕色瓶中备用.
●标准蛋白质溶液:
牛血清蛋白(BSA)用蒸馏水配成0.1mg/ml
●待测样品液:
S1,S2(3颗绿豆—10ml水---研磨---离心2500rpm得清液),S3,S4为原液稀释10倍(S1S2S3S4均为样品体积,S3和S4不一定做,在未知样品蛋白含量时可先设计一个浓度梯度以保证测量值在标准曲线的线性范围内)
操作方法:
1.牛血清蛋白标准曲线的制作:
按下表加入试剂,混匀静置2分钟,以1号管为空白调零点,测下各管的A595值,以吸光值(A595)为纵坐标,每管蛋白质含量为横坐标作出标准曲线.
试管号
1
2
3
4
5
6
S1
S2
S3
S4
标准蛋白/µ
l
100
200
300
400
500
样品体积/µ
50
每管中蛋白含量/(µ
g)
10
20
30
40
水/ul
450
G-250染色液/ml
室温静置2min
A595
2.样品蛋白质含量测定:
取未知浓度的蛋白质(通过适当稀释使其浓度控制在测量有有效范围内),加到试管内,再加入G250染色液3ml混匀,测其595nm下的吸光度,对照标准曲线求出蛋白质含量,计算其浓度.(表示为mgPr/g材料)
4.比活力、得率及纯化倍数计算:
SOD的比活力为=总活力(units)/总蛋白量(mg)
SOD总得率为:
总得率=最后样品活率/样1活率*100%
纯化倍数=比活2/比活1
三、结果与讨论:
SOD活性及蛋白质测定结果:
1.蛋白质含量测定:
表1.牛血清制作蛋白质标准曲线(蛋白质含量/ug)
蛋白质含量/ug
60
70
OD值
0.174
0.269
0.342
0.429
0.548
0.690
0.767
图1.牛血清制作蛋白质标准曲线(蛋白质含量/ug)
二>
硫酸铵分级分离、透析除盐和浓缩过程
表2.连苯三酚自氧化速率(A325)
连苯三酚/ul
△A
样①
0.070
样②
12
0.071
样③
15
0.075
样④
0.073
表3.连苯三酚测样品SOD活性(A325)
酶/ul
△A’
0.031
80
0.036
110
0.039
0.038
表4.考马斯蓝G-250测样品蛋白含量(A595):
样品体积/ul
OD平均值(nm)
0.347
0.681
0.839
0.868
根据蛋白质标准曲线求出蛋白质含量:
样①29.651ug
样②61.160ug
样③76.066ug
样④78.802ug
三>
葡聚糖凝胶层析分离纯化SOD实验结果
表4.葡聚糖G100凝胶层析洗脱曲线(以A280吸收作为蛋白质含量的相对值)
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
吸光值(nm)
0.079
1.145
0.591
0.184
0.082
(6)
(7)
(8)
(9)
(10)
0.055
0.049
0.048
图2.葡聚糖SephadexG100凝胶层析分蛋白质洗脱曲线
经连苯三酚粗测,(3)号管颜色最浅,而根据蛋白质洗脱曲线看出(3)号管位于蛋白质含量峰上,所以选取(3)号管作为目的试管收集SOD,测量其准确SOD活力和蛋白含量,计算SOD比活力。
连苯三酚自氧化速率:
连苯三酚=12ul;
△A=0.075
表6.连苯三酚测样品⑤SOD活性(A325)
样品/ul
①
150
②
10
0.042
③
0.045
④
⑤
0.046
⑥
0.051
⑦
0.041
⑧
⑨
⑩
0.050
考马斯蓝G-250测样品蛋白含量:
样品体积=50ulOD平均值=0.366nm
则根据蛋白质标准曲线求出蛋白质含量=31.443ug
计算得:
1.比活力的计算
加入酶量相当的酶活力单位(unit)=(△A-△A’)/△A*2
样①(0.070-0.031)/0.07*2=1.11
样②(0.071-0.036)/0.071*2=0.99
样③(0.075-0.039)/0.075*2=0.96
样④(0.073-0.038)/0.073*2=0.96
试管(3)(0.075-0.038)/0.075*2=0.99
提取液的总活力(unit)=加入酶量相当的酶活力单位*(反应液总体积/取样液体积)*稀释倍数
样①1.11*(200/0.100)=2220
样②0.99*(170/0.080)=2103.75
样③0.96*(150/0.110)=1309.1
样④0.96*(50/0.040)=1200
试管(3)0.99*(20/0.100)=198
总蛋白量(mg)=(反应液总体积/取样液体积)*取样液蛋白含量
样①(200/0.030)*0.029651=197.67
样②(170/0.050)*0.061160=207.94
样③(150/0.060)*0.076066=190.165
样④(50/0.050)*0.078802=78.802
试管(3)(20/0.050)*0.031443=12.58
样①2220/197.67=11.23
样②2103.75/207.94=10.12
样③1309.1/190.165=6.88
样④1200/78.802=15.23
试管(3)198/12.58=15.73
2.得率的计算
得率=本次总活力/上次总活力*100%
(1)2103.75/2220*100%=94.76%
(2)1309.1/2103.75*100%=62.23%
(3)1200/1309.1*100%=91.67%
(4)198/1200*100%=16.5%
SOD总得率=最后样品活力/样1活力*100%
=198/2220*100%
=8.92%
3.纯化倍数的计算
(1)10.12/11.23=0.90
(2)6.88/10.12=0.67
(3)15.23/6.88=2.21
(4)15.73/15.23=1.03
图3.各纯化步骤中SOD总酶活变化趋势
图4.各纯化步骤中SOD总蛋白含量变化趋势
图5.各纯化步骤中SOD比活变化趋势
1.可以看出,在25g绿豆中随着不断的分离提纯,总活力不断减小,比活力先下降后上升,最后总纯化倍数为1.03,活性得率为8.92%,达到预期效果。
2.为什么要从植物中提取SOD?
初步验证阶段。
国外SOD主要应用于医疗、保健方面,有以动物血液及内脏为原料制取SOD的报导,但存在着成本高、含有致热因子等缺陷,因此,适用范围极为有限。
尤其是近年来受“疯牛病”的影响,许多国家和地区抵制以动物血液及内脏为原料制取的超氧化物歧化酶,使得超氧化物歧化酶在国际市场上极为紧缺。
从植物,特别是人们日常经常食用的蔬菜、瓜果、野生植物及粮食中提取SOD,使用安全性非常高,避免了可能发生的交叉感染。
利用全新的生物技术从植物中提取SOD,具有明显的社会和经济效益,市场前景广阔。
从植物中提取SOD的主要工艺流程为:
植物→打浆→超滤分离→有机溶剂去杂→柱层析精制→超滤浓缩→冷冻干燥→产品
3.用Tric-HCl而不用磷酸缓冲液的原因
因为反应物连苯三酚在酸性条件下稳定,在碱性条件下能自氧化。
而SOD活力的测定是依靠SOD抑制连苯三酚的自氧化实现的。
磷酸缓冲液pH大约为7点多,无法提供连苯三酚自氧化需要的碱性环境。
4.邻苯三酚加入量对测量的影响
邻苯三酚的浓度是决定其自氧化速率高低的一个主要因素,浓度越高,自氧化速度越快,相同单位的SOD对邻苯三酚自氧化的抑制程度就越小,从而使得测量结果越低。
所以为使结果具有可重复性,必须严格控制测定液中邻苯三酚的终浓度保持相同。
五、参考文献:
[1]Beauchamp,J.andI.Fridovich(1971)Superoxidedismutase;
improvedassaysandanassayapplicabletoacrylamidegels.AnalyticalBiochemistry,44,276-287.
[2]柯德森主编.生物工程下游技术手册.科学出版社出版.2010
[3]刘国诠主编.生物工程下游技术.北京:
化学化工出版社.2004
[4]袁勤生.超氧化物歧化酶的分析测定(J).中国医药工业杂志,1989
[5]黄政弘,陈惠婷,瑞泽.三种SOD活性测法之比较.大叶学报.1999
[6]翟颐华,等,韭菜细胞溶质超氧化物歧化酶的纯化和性质〔J〕.武汉植物学研究,1998,16(l):
18—22.
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- 广州大学 生物工程 下游 技术 实验 超氧化物歧化酶 SOD