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D硫酸铝
E氢氧化物
B中
问题2Harris苏木精液配制的优点是
A配制麻烦
B容易形成沉淀
C染色力强
D染色力弱
E染色方法复杂
C难
A4型
7.HE染色方法虽然是最常用、最简单的染色方法,但它的染色过程却是复杂的,每一染色步骤都关系到切片质量,其中包括固定液的选择、脱水、染色、分化、还原等步骤。
问题1病理组织切片最常用的固定液是
A乙醚乙醇固定液
B95%乙醇
CLugol液
D10%福尔马林
ECarnoy固定液
D易
问题2配制伊红染液时加入少量冰醋酸是作为
A氧化剂
B发色剂
C分化剂
D促染剂
E媒染剂
D中
问题3.HE染色分化、还原后应用乙醇的目的是:
A苏木精染料的清洁
B清洗二甲苯
C使水分进入细胞
D清洗伊红染料
E去除组织切片中水分,为二甲苯透明做准备
E易
问题4.HE染色核最佳的着色是:
A红色
B黄色
C黑色
D粉红色
E紫蓝色
8.HE染液中的助色团的作用是:
A使染料分子染色度加深
B使染料分子与被染物之间产生亲和力
C使染料分子极性增强,易离子化
D使染料分子电离为负离子,易与细胞结合着色
E多为极性基团
ABCE难
9.HE染色细胞核染色原理是
A细胞核内的染色质主要是DNA
BDNA两条链上的磷酸基向解,带正电荷
CDNA呈酸性
D苏木精为碱性染料
EDNA很容易与苏木精以离子键或氢键结合而被染色
ACDE难
10.HE染色盐酸酒精分化作用是:
A促进细胞核着色
B促进细胞还原蓝染
C为细胞核还原蓝染做准备
D去除核、胞浆、多余染料及过染
E去除细胞核过多水分
CD中
四、多项问题型
11.HE染色方法是目前病理诊断及研究工作最常用的方法之一,其苏木素的配制方法不断的改良,涌现了许多不同的配制方法。
问题1目前最常用的苏木素液配制方法是:
A吉姆萨
B哈瑞氏
C埃利希
D迈耶
E巴氏
F瑞氏
GWeigert铁苏木素
BCDG中
提示:
苏木素分子中并不具发色团和助色团,必须经过氧化后成为苏木红才具有染色功能。
问题2苏木红具有下列哪些发色团和助色团?
A.–N=N–(偶氮基)
B.–N=O(亚硝基)
C.>C=O(酮基)
D.>C=C<(烯烃)
E.–NH2(氨基)
F.–SO3H(磺酸基)
G.–OH(羟基)
H.–COOH(羧基)
ABCDEFGH难
要使苏木红对细胞具有强的亲和力必须加入媒染剂:
问题3媒染剂促进染色能力是:
A本身与组织或染料发生结合
B能把组织、染料联系起来
C促进细胞核着色
D促进染色能力
E与组织发生结合,不与染料结合
F与染料发生结合,不与组织结合
ABC难
12.伊红染液是HE染色方法必不可少的胞浆染液,伊红Y是煤焦油染料,Y意指带黄,是最常用的染料。
问题1.伊红Y的染色原理是:
A含有一个醌型苯环的发光基
B两个形成钠盐的酸性助色基
C溶于水就能离解成带负电的色酸,即染料的有色部分
D带正电的钠离子部分,即染料的无色部分
E伊红Y是煤焦油染料
F氨基酸中氨基功能团和酸性染料结合
ABCDF难
伊红染液配制方法比较简单,最常用的配制方法
问题20.5%水溶性伊红液的配制方法
A伊红Y0.5g
B蒸馏水100ml
C先用20ml蒸馏水溶解伊红
D研磨伊红粉后加20ml蒸馏水溶解伊红
E全部溶解后加入全部80ml蒸馏水
F滴加一滴冰醋酸
G染色时间1-5分钟
ABCDEFG易
如需染色快,着色佳需用醇溶性配制伊红
问题3醇溶性伊红配制方法
A伊红B0.5g
B80%乙醇100ml
C伊红于乙醇内搅拌
D染色时间为1-3分钟
E研磨伊红
F滤过后使用
ABCDEF易
13.石蜡切片经脱蜡入水洗涤后进入Harris苏木素染液中染色,应该根据苏木素液的陈旧与新鲜度来设置染色。
问题1新配制的苏木素液不同组织的染色时间
A动物组织染色时间5分钟
B新生儿组织染色时间5分钟
C陈旧组织染色时间10分钟
D科研、教学切片染色时间20分钟
E坏死组织染色30分钟
F坏死组织染色60分钟
ABCD中
苏木素液染色后需经盐酸酒精分化
问题1盐酸酒精分化的意义是什么?
A使细胞核颜色达到适宜程度
B脱去胞质及核内多余染液
C核由深蓝色变成粉红色
D核由浅蓝色变成蓝色
E核由红色变成蓝色
F核由红色变成蓝色
如何控制分化过程
问题3分化过度和分化不足可出现的现象:
A分化过度,核呈褪色状,颜色灰淡
B分化过度,核轮廓模糊不清
C分化不足时胞核过深
D分化不足时,核、浆的境界不清
E分化不足时,不能辨认核膜及染色质的结构
F分化不足时,细胞质背景仍有浅蓝色
ABCDEF难
石蜡组织切片的HE染色
1.取材组织块,经固定后,常规石蜡包埋,4μm切片。
2.切片常规用二甲苯脱蜡,经各级乙醇至水洗:
二甲苯(I)5min→二甲苯(Ⅱ)5min→100%乙醇2min→95%的乙醇1min→80%乙醇1min→75%乙醇1min→蒸馏水洗2min。
3.苏木素染色5min,自来水冲洗。
4.盐酸乙醇分化30s(提插数下)。
5.自来水浸泡15min或温水(约50℃)5min。
6.置伊红液2min。
7.常规脱水,透明,封片:
95%乙醇(I)min→95%乙醇(Ⅱ)1min→100%乙醇(I)1min→100%乙醇(Ⅱ)1min→二甲苯石碳酸(3:
1)1min→二甲苯(I)1min→二甲苯(Ⅱ)1min→中性树脂封固。
苏木素伊红(HE)染色
•
第一节染色的基本知识
第二节苏木素-伊红染色法
第一节染色的基本知识
染色术语
1染色:
使染色剂和组织细胞结合,产生特定的颜色以利观察。
2酸性染料:
有一个反应性酸成分,能产生H+,使其本身带有负电荷的染料。
3碱性染料:
有一个反应性碱成分,能产生OH-,使其本身带有正电荷的染料。
4中性染料:
酸性染料和碱性染料的复合物,其酸碱成分都是反应性成分。
5直接染色:
染色剂和组织可直接结合着色。
6间接染色:
必须有第三种成分-媒染剂参与,才能使染色剂和组织有效的结合起来。
7进行性染色:
组织成分自浅至深,当达到所需要的强度时,终止染色。
8退行性染色:
先把组织过度浓染,再用某些溶液脱去多余的染色剂而达到适当的染色程度。
9分化:
选择性的除去多余染色剂的过程。
10蓝化:
用碱性溶液(自来水、饱和碳酸锂等)处理已分化的切片,使苏木素的颜色显示最强的方法。
11媒染剂:
对染料、组织细胞都有亲和力,并能把它们联系起来的一种物质。
12促染剂:
能加强染料和组织细胞的结合能力。
13
正色反应:
最后目的物质所呈现的颜色与染色剂的颜色相同。
14
变色反应:
最后目的物质所呈现的颜色与当初颜色不同。
15
发色团:
染色剂分子中,能够显示颜色的基团。
16
助色团:
染色剂分子中,能促使染色剂和组织细胞相结合的基团。
17
色原:
含有发色团的苯环化合物。
18
荧光染料:
在荧光显微镜下,能显示荧光的染料。
19常见染料发色团:
偶氮基-N=N
亚硝基-N=O
硝
基-NO2
羰
基-C=O
烯
基-C=C
20常见染料助色团:
氨
基
-NH2
羧
-COOH
羟
-OH
磺酸基
-SO3H
染色剂
标准
具有鲜艳透明的颜色,且能与组织细胞结合,从结构上说就是必须有色原和助色团,单有色原的化合物对组织细胞无亲合力或易被褪色,具有助色团的染料才有电离的能力,能形成一种盐类染料。
分类
1按来源
A天然染料:
苏木素、胭脂红、地依红番红花、石蕊、靛蓝。
B合成染料:
甲基绿、苯胺蓝、亮绿等,种类最多。
C无机化合物染料:
硝酸银、氯化铜等。
2按用途
A胞核染料:
苏木素、胭脂红等。
B胞浆染料:
伊红、酸性品红、亮绿等。
C脂质染料:
苏丹三、油红O等。
按发色团
A亚硝基类:
萘酚绿B。
B硝基类:
苦味酸。
C偶氮类:
桔黄G、苏丹类。
D醌亚胺类:
亚甲蓝、中性红。
E山叮类:
哌洛宁、伊红。
F苯甲烷类:
品红、亮绿。
G蒽醌类:
茜素、胭脂虫酸。
染色中的注意事项
1染色器皿一定要清洁。
2注意核对染料的有效期、分子式。
3影响染色效果的是染色剂的新旧、浓度、PH值,环境温度及染色时间。
4染色过程中要随时镜检。
媒染剂和促染剂的区别
1促染剂本身不参加反应,而媒染剂直接参加反应,它与染色剂直接形成沉着在组织间的有色物质-色淀。
2促染剂对染色反应起加强作用。
一般说来,无促染剂参加反应,反应也能进行,只是反应的强度不同;
而媒染剂则在一些染色反应中是必不可少的。
分化剂
1酸性分化剂:
主要为盐酸、醋酸等。
常用0.1%-1%浓度的水溶液或70%的酒精溶液。
反应原理:
组织在酸性溶液中,吸附氢离子而带正电荷,从而使带正电荷的碱性染料脱掉,完成脱色作用。
2氧化分化剂:
主要为苦味酸、高锰酸钾、高铁氰化钾等。
利用“漂白作用”无选择的脱掉切片上的着色,但对一些结合力较强的部位则不能彻底的脱色,而留下了适当的颜色。
3媒染分化剂:
在染色时起媒染作用,而染色后则可用来脱色,即为媒染分化剂。
主要为钾明矾、铁明矾等。
根据媒染剂定义,用质量作用则可完成分化。
当脱色用媒染剂量大于染色中所用剂量时,占有压倒优势的媒染剂就能把已经和组织细胞相结合的染色剂夺取过来,完成脱色。
小
结
染色的原理染色就是染色剂和组织细胞结合的过程。
可从物理学和化学角度来解释。
浸染与染色的区别,何为进行性染色、退行性染色、分化。
直接染色、间接染色、媒染剂、促染剂染色原理。
分化剂的种类,生物染色剂的要求。
何谓发色团及其种类,何谓助色团及其种类。
染色剂化学性质分类及判断酸碱性的标准。
第二节苏木素-伊红染色法
苏木素(Haematoxylin)染料的简介:
是实验室中常用的染色剂,是苏木树中提炼出的黄褐色粉末,易溶于乙醇,也可溶于热水,其本身无染色能力,但经氧化后能氧化为具有染色性的苏木红。
对细胞核、线粒体、髓鞘、肌原纤维等有良好的染色效果。
伊红(Eosin)染料简介
是胞质常用的染色剂,属于山叮类染料,化学名称为四溴荧光素二钠盐,常用伊红B(Y)的0.5%水溶液或酒精溶液,伊红B偏兰色调,伊红Y偏黄色。
染色剂的常用配方
1Harris明矾苏木素液:
甲液:
苏木素1克,纯酒精20毫升,混溶。
乙液:
钾明矾20克,蒸馏水200毫升,加温溶解。
在乙液呈小沸腾状时,将甲液缓缓倒入,继续加热煮沸1分钟;
停火后缓慢的加入氧化汞0.5克,文火加热煮沸1分钟后,迅速放入冷水内冷却,冷却过滤后即可应用。
2Ehrlich苏木素液
苏木素2克,纯酒精100毫升,混溶。
钾明矾15克,蒸馏水100毫升,混溶。
丙液:
甘油100毫升。
丁液:
冰醋酸5ML。
将乙、丙液混合调匀后,再将甲液混入、调匀,加入丁液置于阳光充足处,松掩瓶口1-3个月即成。
30.5%伊红酒精溶液
伊红Y(B)0.5克,80%酒精100毫升,混溶。
4酸化伊红酒精溶液
将伊红Y20克溶于蒸馏水500毫升内,再加浓盐酸10毫升,充分搅拌均匀,过夜。
析出沉淀后用大号滤纸过滤,弃去滤液,用蒸馏水反复洗涤滤纸上的沉淀;
然后将滤纸和沉淀置于370C温箱内充分干燥。
最后用95%酒精1000毫升把它配成饱和液储存。
使用时,取一分饱和液加95%酒精2-3份混合后应用。
石蜡切片染色法
1自温箱中取出切片后,立即放入二甲苯1、2中各5分钟。
2入纯酒精1、2中各5分钟。
3入95%酒精和80%酒精中各5分钟。
4入自来水洗涤。
(至此称为下行“入水”)
5入苏木素染液5-10分钟。
6自来水洗。
70.5-1%盐酸酒精分化数秒钟。
8充分水洗蓝化30分钟。
9
0.5-1%伊红1-2分钟。
1080%、95%、纯酒精1、2各5分钟。
11二甲苯1、2中各5-10分钟。
12中性树胶封固。
注意事项
1染苏木素前,如果其表面有一层晶亮物质(过氧化物),应除掉以避免污染切片。
2根据苏木素的新旧程度决定染色时间。
3盐酸酒精分化无特定的时间限制,主要依靠工作经验,分化时间过长会影响伊红着色。
4自来水洗蓝化时间的延长,可减少以后切片的褪色程度。
5封片时,要防止切片中出现气泡,所滴封固剂要适量。
6染色结果的判定应以胞核呈蓝紫色,胞浆、胶原、肌纤维、嗜酸颗粒呈桃红色,弹性纤维呈明亮的桃红色为准。
HE是苏木精(hematoxylin)和伊红(eosin)的首个字母缩写。
苏木精是碱性染料,使细胞核染色质和胞质内的核糖体呈紫蓝色。
伊红是酸性染料,使细胞质和细胞外基质中带较强碱基的蛋白质成分着红色。
在病理学实验课中,要观察大体标本和镜下标本,为了能更好的掌握实验课中所学的知识和内容,尤其是镜下标本,熟悉病理组织的制片技术是非常重要的,这对能否看好切片有很大帮助,它是教学、医疗、科研中必不可少的重要组成部分。
组织切片种类很多.大致分为两种:
一是组织切片法,如石蜡、冰冻、火棉胶切片等。
另一种是组织非切片法,如涂片、印片法等。
其中石蜡切片是日常病理检验工作中最常用的制片方法,其次是冰冻切片。
为了对制片过程有一总的概念,下面就以石蜡切片为例,分述整个制片过程。
组织的取材与固定
取材
取材是根据实验的目的和要求以及病变的程度而合理取得的组织材料。
取材的正确与否直接影响到病理诊断的结果。
取材有活体组织取材法、尸检组织取材法。
前者主自用于临床手术中。
组织取材应注意以下几点:
l)及早取材,愈新鲜愈好
2)取材刀要锋利,宜一刀切平
3)活体小块组织要包好,以免丢失
4)为区别脏器的不同部位可将组织分别切成不同形状(三角形,方形、梯形等)
5)取材时,需取主要病灶以及病灶与正常组织交界处、边缘周围的组织;
并注意病变的部位、形状、大小、颜色、有无包膜等
6)取材后要标记检验号,以防混乱造成差错;
取材后剩余组织应保留,以便复检、特染、教学和科研之用
固定
固定是将需保留制成标本的脏器或病变组织,浸入固定液内,使组织的形态结构与生前相仿,组织细胞的物质成分变为不溶性,从而得到保存。
同时使组织硬化,利于切片;
使组织产生不同的折光率便于观察;
某些固定液有助染作用,利于切片染色。
常用的固定剂:
1.
福尔马林(Formalin)即甲醛(蚁醛)液的商品名,是甲醛气体溶于水的饱和溶液。
浓度为36~40%、常配成10%的浓度为甲醛固定液。
其优点是:
渗透力强,固定均匀,可与其它试剂混合使用,核染色优良,是常规固定剂。
但易挥发,对粘膜和皮肤均有刺激。
2.
乙醇(酒精)即有固定作用也有脱水作用。
但易使组织收缩显著,硬化严重。
通常不做固定剂使用。
仅用于糖元、尿酸、铁质的组织化学证明。
3.
其它固定剂还有升汞、重铬酸钾、锇酸等。
锇酸对蛋白质固定较好,是电镜标本固定剂之一。
常用的主要固定液配制:
1.10%甲醛生理盐水固定液(等渗甲醛固定液)
甲醛液100ml,氯化钠3.5g,蒸馏水900ml。
(如将氯化钠换成氯化钙(1g)即成10%甲醛钙液,是组织化学和脂类常用固定液之一。
)
2.Zenker氏液(简称ZA)
重铬酸钾2.5g,升汞5~7g,硫酸钠(可省略)1g,蒸馏水100ml,冰蜡酸(临用时加)5ml。
(升汞沉淀蛋白,重铬酸钾凝固脂类,冰醋酸利于染色。
3.Bouin氏液与PFF液
苦味酸饱和水溶液(1.22%)75ml,甲醛液25ml,冰醋酸5ml。
(临用时现配,用于结缔组织染色。
如将此液中冰醋酸改为90~~95%甲醛5ml后即为PFF液,此液除固定作用外还可脱钙。
苦味酸的黄色可用碳酸锂酒精液多次更换除尽。
固定后的组织(除酒精固定外)必须彻底水洗。
一般12~24小时。
脱水透明脱钙
脱水
脱水是应用脱水剂将组织内的水分置换出来,以使石蜡均匀地渗透到组织中,同时组织又不出现收缩变形等人工改变。
常用的脱水剂:
酒精:
脱水力较强,一般从低浓度开始,逐渐递增其浓度,直至无水酒精。
浓度高时易使组织过度硬化。
正丁醇:
既脱水又透明,优点是组织不过度收缩、脆硬。
不经二甲苯透明可直浸蜡。
也有用酒精和正丁醇混合使用,优势互补,效果较好。
透明
透明是组织经脱水后,用能与脱水剂及石蜡混合的试剂,将脱水剂置换出来,使石蜡均匀渗透进去,有的透明剂可使组织呈透明状态,故称透明。
二甲苯既溶于酒精又溶解石蜡,为广泛应用的透明剂。
透明时间需0.5小时~1小时。
二甲苯还能溶解脂肪,因此我们看到切片中的脂肪细胞胞浆是空泡状,是二甲苯脱脂所致。
脱钙
脱钙:
骨和已钙化的病变组织,必须脱去钙盐才能切片。
常用5%硝酸溶液,一般需1~3天。
脱钙液需及时更换,直至用针刺组织无阻力时止,视脱钙完全。
脱钙后用自来水冲洗12~24小时。
浸蜡包埋
浸蜡
浸蜡是组织经透明后,置入熔化的石蜡中浸渗,一般为2小时。
浸蜡的目的是将石蜡均匀浸渗至组织中,使组织的硬度与石蜡的硬度相似,利于切片。
浸蜡后的组织用包埋框将其包埋。
包埋
包埋用蜡的熔点要与最后一次侵蜡的石蜡熔点相一致,这样有利于切片。
切片
切片
切片是将组织标本制成很薄的片子,以便染色后,在光学显微镜下能观察细胞的形态结构和病变情况,是制片中的重要一环。
切片方法是:
将切片用具备好,固定好包埋蜡块,即可切片。
切片厚度一般为5um左右,将切出的片子放在水浴锅中展开,经展片、附贴、烤片后即可进入染色。
冰冻切片是直接将新鲜组织冷冻后切片。
染色
染色
染色是组织标本制成切片后,为了观察和鉴别其形态结构或物质成分有无异常,用适当的染料进行染色.组织不同着色不同,深浅不一。
染色的种类方法很多,通常分为两类:
即普通、特殊染色。
普通(常规)染色即苏木素(Hematoxylin)一伊红(Eosin)染色法,简称HE。
染色原理:
染色原理和机制尚无定论,处于学说阶段。
可能既是化学反应,又有物理作用参加。
从化学反应看,组织细胞内含有酸性物质和碱性物质,细胞的酸性物质与碱性染料的阳离子结合,而细胞核的碱性物质与酸性染料的阴离子结合,使其中酸性细胞核被碱性的苏木素染成蓝色,而碱性的胞浆被酸性染料伊红染成红色。
其结果胞核呈兰色,胞浆呈红色。
从物理现象看,主要有吸附、吸收之说。
几种常用染料及染液:
苏木精(苏木素)本身无染色能力,必须在媒染剂的作用下经氧化为苏木红才具有染色作用,用于细胞核染色。
碱性品红常用其配制成雪夫氏试剂染糖类、粘液、弹力纤维及抗酸杆菌等。
甲苯胺兰用于染粘多糖类、肥大细胞和神经细胞的尼氏小体。
4.
伊红Y用于细胞浆染色。
还可显示细胞的嗜酸性颗粒,故将这种细胞颗粒称嗜伊红颗粒。
5.
苏丹Ⅲ用于脂肪染色,可将脂肪染成橘红色。
常用染液的配制:
1.埃利希(EhrliCh)氏苏木素染液配制:
苏木素2g
无水酒精100ml
甘油100ml
冰醋酸10ml
钾明矾2~3g
蒸馏水100ml
任自然氧化成熟后使用。
2.0.5%水溶性
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