《myc基因的生物信息学分析》.docx
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《myc基因的生物信息学分析》
海洋生命学院
《myc基因的生物信息学分析》
2015/7/3
课程:
《生物信息学》
教师:
张建业
时间:
周三56节
教室:
[实验中心111]
学生:
班级:
2012级生物化学与分子生物学
学号:
12050032003
ThegeneofmycinRabbit
基因序列是从网站(http:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/)上,依据以下步骤获得:
1)选择”Gene”和输入”myc”,click“Search”;
2)找到”rabbit”,点击进入下一页面;
3)点击“FASTA”,获取核酸序列;
4)得到myc基因序列;
5)复制全序列,保存到记事本中即可,保存格式如下;
>Oryctolaguscuniculus(rabbit)[NC013671.1]
GGTGCGGGGGAAAGAGGTGTCTTTTTTTTTTTTTAATTATTATTTCTTTTCTCTTGGGTCCCCCTCTTCC
TGGCCCCTTTGGGCAGGGAGTGGAGAGGGAGGCGGTGGAGCGCGCTGAAAGGGGAGTGGTCGGGGCTTGGCGGTGCGCGCTGCGCGGCGCTCCGGGTTTCGGGCTCCAGCGAGACCCTAACTCAAGGCTGCCCCCCCTTTGTGTGCCCCGCAGCAGGCTACGCGACGATGCCCCTCAACGTCAGCTTCGCCACCAACAGGAACTATGACCTGGACTACGACTCGGTGCAGCCCTATTTCTACTGCGATGAGGAGGAGAACTTCTACCAGCAGCAGCAGCA
GAGCGAGCTGCAGCCGCCGGCGCCCAGCGAGGATATCTGGAAGAAATTCGAGCTGCTGCCCACCCCGCCC
CTGTCCCCGAGCCGCCGCTCCGGCCTCTGCTCGCCCTCCTACGTTGCCGTCGCGTCCTTCTCCCCCAGGG
GAGACGACGGCGGCGGCGGCGGCAGCTTCTCCACGGCTGACCAGCTGGAGATGGTCACCGAGCTGCTGGGCGGTGACATGGTGAACCAGAGCTTCATCTGCGACCCGGACGACGAGACCTTCATCAAGAACATCATCATC
CAGGACTGCATGTGGAGCGGCTTCTCGGCCGCCGCCAAGCTCGTCTCGGAGAAGCTGGCCTCCTACCAGG
CTGCGCGCAAGGACAGCGGCAGCCCGAGCCCCGCCCGCGGCCACGGCGGCTGCTCCACCTCCAGCCTGTA
CCTGCAGGACCTGAGCGCCGCCGCCTCCGAATGCATCGACCCCTCGGTGGTCTTCCCCTACCCACTGCAC
GACAGCAGCTCGCCCAAGCCCTGCGCCTCGCCCGACTCCAGCGCCTTCTCCCCGTCCTCGGACTCTCTGC
TCTCCTCCAACGAGTCCTCTCCGCGGGCCAGCCCTGAGCCCCTGGTGCTCCATGAAGAGACACCGCCCAC
CACCAGCAGCGACTCTGGTAAGCCTGAGGCCACTCCAGGCCGATCCAGGAGGGGGCGGGGTGGATGGACGCCTGTCTGTTCTCACTGGCTGCTGATCAGTGGGGCACTTGAGCCCATTCTGCGTGCGTCTGTGCCGGTAT
TTGGAAGGAGAAATGGCGGAGCTGGGACGGTGGGGCGCTCATCAACCCCGGAACCCTGGACTTTTTTAGA
GTACCCTTGGCGCTTAGACCGTCCCAGTTTGCCATCCCCCCCCTTCTCTCCCACCCCTCAGGAATTTCAT
TTGGGTTTTTAAATCTCCTGGCTTATCCATCCACTCCCTCTTACCTCTTAAGCATTTTAATTGCCTGGGG
GGTGGGGGTGGGGGGGGCGTGTGAATGAGGATAAGAAAGGATTGATCTCCAGGAGTGAATGAATTGCCTGCCTCCCTTCCTTAACTTCTGAGAAGTGGCTGAAATTGAGTGGACTCAAGGCAGCTACAAGAATGAGGGGA
GGGAGGCCAGCCTGCTGCCTGAGGGCTGCAGCTAGTGAAAGTGCCTATTCTGAACACTTAGAAGCAAAGC
CTTGCCAAAACTAGACTTTTTTGCTCTTTCGCCCATCCCCCAGGACTTGTTGGCAAAGTTGTAAGATTTT
TTTTTGCACTTCCAGTAAAATAGGGAGTTGCTAATATAGCACCTGAAGGTTCTTGGTAAAGTCCCTTAAA
AATAGGAGGTGCTTGGGAACATGCTTGACTCTGGGTGTGTCCAAAGCCTCATTAAGTCTTAGGTAAGAAT
TGGCATCAATGTGATGTCCTGGCAAATTATAATTTTCTTGTCTGCACCACCACCCCAGCTGTCAATCTCC
TCCCATTTAAATCTCACTTTGTAGGGGAGAAGAAACAGTGAGGCGTGTGCTTCTTTGGGGGTGCCGTTGT
AACGTCCCAGTGCCTCCTGTTTGCATAGCATTCATTAAGCAAACAACGCAGTCATTGATTGTTGGGAAGC
ATTGCTAACCGGGTGATTTCTGTTTCTTTTCTTAAAGAGGAAGAACAAGAGGATGAGGAAGAAATCGATG
TCGTTTCTGTGGAAAAGAGGCAGCCCTCCACCAAAAGGTCAGGGTCACCATCTGCAGGGGGCCACAGCAA
ACCTCCACACAGCCCGCTGGTCCTCAAGAGGTGCCACGTCTCCACCCATCAGCACAATTACGCCGCGCCC
CCATCCACCAGGAAGGACTACCCAGCTGCCAAGCGGGCCAAGTTGGACAGTGGCCGAGTCCTGAAGCAGA
TCAGCAACAATCGCAGATGTGCCAGCCCCAGGTCCTCAGACACCGAGGAGAACGACAAGAGGCGGACACA
CAACGTCTTGGAACGCCAGAGGAGAAATGAGCTGAAAAGGAGCTTTTTTGCCCTGCGTGACCAGATCCCA
GAGTTGGAAAACAATGAAAAGGCCCCCAAGGTAGTTATCCTTAAAAAAGCCACGGCGTACATCCTGGCCG
TCCAAGCAGAGGAGCAAAAGCTCATTTCAGAGAAGGACTTGTTGCGGAAACGGCGAGAACAGTTGAAACACAAACTTGAACAGCTACGGAACTCTTGTGCATAAGTTGACCTATTGGAGGGAGGAACTGGACTGGCTCAT
GAATTCTCATTTGTTACTAAGGGAAATTAAGGAAACAGGTTCCTTCTGACAGAACTGCAGCAATCCATTA
CGTATGAACTTATTTCACATGCATGGTCAAGTGCAACCTCACAACCTTGGCTGGGTCTTGGGACTGTAAG
GTTTAGCCATAAAGTAAACTGCCTCAAATGGGACTTTGGGCATAAAATAACTTTTTTTATGCTTGCCATC
TTTTTTTTGTTTGTTTCTTTTAACAGATTTGTATTTAAGAATTGTTTTTAAAAAATTCTAAAGTTTACCC
AACTTTCCTGTGTAAATATGGCCATTAAATGTAAATAACTTTAATAAAACGTTTATAGCAGTTATACAAG
ATTTCAAGCCATGTATTATAAACCATAATTTTTTATTTAAGTACATTTTCCTTTTTAAAGTTGATTTTTT
TCTATTGTTTTTAGAAAAAATAAAATACCTGGCAAATATATCATTGA
6)寻找到CDS序列;
>lcl|AF519451.1_cds_AAN03876.1_1[protein=c-mycproto-oncogene][partial=5',3'][protein_id=AAN03876.1][location=<1..>463]
GGGTCACCATCTGCAGGGGGCCACAGCAAACCTCCACACAGCCCGCTGGTCCTCAAGAGGTGCCACGTCT
CCACCCATCAGCACAATTACGCCGCGCCCCCATCCACCAGGAAGGACTACCCAGCTGCCAAGCGGGCCAA
GTTGGACAGTGGCCGAGTCCTGAAGCAGATCAGCAACAATCGCAGATGTGCCAGCCCCAGGTCCTCAGAC
ACCGAGGAGAACGACAAGAGGCGGACACACAACGTCTTGGAACGCCAGAGGAGAAATGAGCTGAAAAGGAGCTTTTTTGCCCTGCGTGACCAGATCCCAGAGTTGGAAAACAATGAAAAGGCCCCCAAGGTAGTTATCCTTAAAAAAGCCACGGCGTACATCCTGGCCGTCCAAGCAGAGGAGCAAAAGCTCATTTCAGAGAAGGACTTGTTGCGGAAACGGCGAGAACAGTTGAAACACAAACTTGAACAGC
7)将上述CDS序列的myc.txt格式直接改成myc.pro,然后用软件EditSeq打开,再将CDS序列转化为氨基酸序列;
>lcl|AF519451.1_cds_AAN03876.1_1[protein=c-mycproto-oncogene][partial=5',3'][protein_id=AAN03876.1][location=<1..>463]
GSPSAGGHSKPPHSPLVLKRCHVSTHQHNYAAPPSTRKDYPAAKRAKLDSGRVLKQISNNRRCASPRSSDTEENDKRRTHNVLERQRRNELKRSFFALRDQIPELENNEKAPKVVILKKATAYILAVQAEEQKLISEKDLLRKRREQLKHKLEQ
1myc基因功能
1)myc基因既是一种可易位基因,又是一种受多种物质调节的基因,具有促进细胞分裂并获永生化功能。
myc被认为是一种序列特异性转录因子而调节细胞的生长、分化及细胞程序化死亡。
Myc蛋白过度表达可以使细胞永生化,降低它们对生长因子需求,促进细胞循环进展,Myc蛋白或许也促进染色体组不稳定因而导致恶性肿瘤。
Myc蛋白亦可作为一种独立的重要的细胞周期调节因子而参与恶性肿瘤的发生发展。
2)myc基因能够调节与细胞周期变化、细胞的生长代谢、基因的不稳定性、刺激血
管生成、细胞恶性转化、分化及凋亡的相关基因,如BCL-2。
myc基因的异常表达可阻止细胞分化,引起细胞转化,活化的MYC可以作为原癌基因参与肿瘤的形成及发展。
在DLBCL中,MYC常与多与其他基因损伤及细胞遗传学异常相伴,如BCL-2重排。
3)myc基因在肿瘤中被激活的方式有多种:
①外源序列的插入激活。
ALV病毒整合到B淋巴细胞myc基因位点附近,随之插入病毒长末端重复序列(包含病毒启动子和增强子)使myc基因处在病毒启动子下而被活化。
②染色体重排。
这是myc基因激活的主要机制之一,在许多Burkitt”s淋巴瘤中发现有染色体特异性重排,其中有3处染色体移位,移位后的位点为编码免疫球蛋白基因所在,其表达相当活跃,故myc基因的转录因此增强。
③基因扩增。
癌基因可通过一定的机制在原来的染色体上复制出许多拷贝,为转录提供超量的模板,随着转录水平的增加,癌基因产物剧增,从而增加了转化蛋白的剂量,促使细胞恶性转化。
myc基因扩增在肿瘤中是一种常见现象,可见于多种恶性肿瘤如鼻咽癌、乳腺癌、宫颈癌等。
④点突变,较为少见。
⑤DNA低甲基化:
DNA甲基化是基因转录的重要调控方法,它的状态维持与基因转录活性密切相关。
DNA转录活跃的区域通常甲基化程度较低,肿瘤组织DNA具有普遍的低甲基化特点,这种现象在癌前病变就出现,并随着肿瘤进展,低甲基化程度呈进行性下降。
2Primer
2.1引物设计原则
(1)引物长度:
18~30bp;GC含量:
一般在40%~60%之间;
(2)退火温度:
一般情况下,一对引物的退火温度大致相等,可以设置一样温度;
(3)避免扩增模板的二级结构域:
有关软件可以预测目的片段的稳定二级结构域,有助于选择模板。
实验表明,若待扩区域的自由能(△G)小于58.6lkJ/mol,扩增往往不能成功。
(4)当被扩增的靶DNA序列较大,引物可能与靶DNA的多个地方结合,造成结果中有多个条带出现。
(5)引物3’端是延伸开始的地方。
①3’端不应超过3个连续的G或C,因这样会使引物在G+C富集序列区被错误引发。
②3′端也不能有形成任何二级结构可能,除在特殊的PCR(AS-PCR)反应中,引物3′端不能发生错配。
③若扩增编码区域,引物3′端不要终止于密码子的第3位,因密码子的第3位易发生简并,会影响扩增特异性与效率。
(6)引物自身不应存在互补序列,引物自身连续互补碱基不能大于3bp;两引物之间不应存在互补性,一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。
2.2DesignPCRPrimersforDNA
将rabbit’smyc.txt(ORF)直接改成rabbit’smyc.seq;
(1)打开软件DNAMAN8,然后打开”File”,选择”Open”,选择rabbit’smyc.seq;
(2)然后打开”Primer”,选择”DesignPCRPrimersforDNA”,出现设计引物的界面;
(3)设置参数,如下图所示;
(4)引物结果;
选择如下引物:
5’primer:
CATCCACCAGGAAGGACTAC;
3’primer:
TTTCAACTGTTCTCGCCG;
相关参数见上图;
2.3RestrictionAnalysis
(1)点击”Restriction”,然后选择”RestrictionAnalysis”,然后进行参数设置,点击进入下一步;
(2)选择所有酶,进行匹配;
(3)酶切分析结果如下;
①Restrictionanalysisonlcl|AF519451.1_cds_AAN03876.1_1
Methylation:
dam-Yesdcm-No
Screenedwith117enzymes,5sitesfound
BglIGCCNNNN/NGGC1:
133
BstEIIG/GTNACC1:
2
Eco57ICTGAAGNNNNNNNNNNNNNNNN/1:
181
PstICTGCA/G1:
15
PvuIICAG/CTG1:
124
ListbySiteOrder
2BstEII124PvuII133BglI181Eco57I
15PstI
NonCutEnzymes
AatIIAcc65IAccIIIAclIAflIIAgeI
AhaIIIAlw44IAlwNIApaBIApaIApaLI
AscIAsp718IAsuIIAvrIIBalIBamHI
BbeIBbvIIBclIBglIIBpu1102IBsc91I
BsiIBsmIBsp1407IBspHIBspMIBspMII
BssHIIBstD102IBstXIBsu36IClaICsp45I
CspICvnIDraIDraIIIDrdIEagI
Eam1105IEcl136IIEco31IEco47IIIEco52IEco56I
Eco72IEcoICRIEcoNIEcoRIEcoRVEheI
EspIFseIHindIIIHpaII-PpoIKpnI
MfeIMlu113IMluIMscIMstIMstII
NaeINarINcoINdeINheINotI
NruINsiIPacIPflMIPinAIPmaCI
PmeIPvuIRleAISacISacIISalI
SapISauIScaISciISfiISgrAI
SmaISnaBISpeISphISplISpoI
SrfISspISstISstIIStuISunI
SwaITth111IVspIXbaIXcmIXhoI
XmaIXmaIIIXmnIXorII
Restrictionsitesonlcl|AF519451.1_cds_AAN03876.1_1
BstEIIPstI
1GGGTCACCATCTGCAGGGGGCCACAGCAAACCTCCACACAGCCCGCTGGTCCTCAAGAGG
CCCAGTGGTAGACGTCCCCCGGTGTCGTTTGGAGGTGTGTCGGGCGACCAGGAGTTCTCC
61TGCCACGTCTCCACCCATCAGCACAATTACGCCGCGCCCCCATCCACCAGGAAGGACTAC
ACGGTGCAGAGGTGGGTAGTCGTGTTAATGCGGCGCGGGGGTAGGTGGTCCTTCCTGATG
PvuIIBglI
121CCAGCTGCCAAGCGGGCCAAGTTGGACAGTGGCCGAGTCCTGAAGCAGATCAGCAACAAT
GGTCGACGGTTCGCCCGGTTCAACCTGTCACCGGCTCAGGACTTCGTCTAGTCGTTGTTA
Eco57I
181CGCAGATGTGCCAGCCCCAGGTCCTCAGACACCGAGGAGAACGACAAGAGGCGGACACAC
GCGTCTACACGGTCGGGGTCCAGGAGTCTGTGGCTCCTCTTGCTGTTCTCCGCCTGTGTG
241AACGTCTTGGAACGCCAGAGGAGAAATGAGCTGAAAAGGAGCTTTTTTGCCCTGCGTGAC
TTGCAGAACCTTGCGGTCTCCTCTTTACTCGACTTTTCCTCGAAAAAACGGGACGCACTG
301CAGATCCCAGAGTTGGAAAACAATGAAAAGGCCCCCAAGGTAGTTATCCTTAAAAAAGCC
GTCTAGGGTCTCAACCTTTTGTTACTTTTCCGGGGGTTCCATCAATAGGAATTTTTTCGG
361ACGGCGTACATCCTGGCCGTCCAAGCAGAGGAGCAAAAGCTCATTTCAGAGAAGGACTTG
TGCCGCATGTAGGACCGGCAGGTTCGTCTCCTCGTTTTCGAGTAAAGTCTCTTCCTGAAC
421TTGCGGAAACGGCGAGAACAGTTGAAACACAAACTTGAACAGC
AACGCCTTTGCCGCTCTTGTCAACTTTGTGTTTGAACTTGTCG
②环状酶切图谱
3HomologousGene(BLAST)
3.1FASTA之后,找到“RunBLAST”,点击进入下一页面;
3.2选”blastn”,网页已经自动添加了文件:
3.3选择database,一般选择”Nucleotidecollection”,然后选择”Highlysimilarsequences(megablast)”;
3.4click“BLAST”直接开始进行blast,后面的”Algorithmparameters”一般不用修改;
3.5result:
3.6选择其他同源序列:
根据“Querycover”的高低,选择了11种同源序列,结果如下:
>Feliscatus(domesticcat)XM_011291443
CCGCACCCGCGAAACTTTGCCGGTTGCGGCGGGCGGACACTGTTCCCTGGAACTTACAACACCCGAGCAA
GAACGCGACTCTCCGGTCCGCCTATTTGGGGAAACACTTCTCCCCTACGCTGCCCGGGACCCGCTCCTCT
GAAAGGGCGCTCCTCGCCGCTTTTCGGACGCTGGATTTCCTTCGGATAGTGGAAAACCCGCAGGCTGCCG
CGATGCCCCTCAACGTCAGCTTCGCCAACAGGAACTATGACCTCGACTACGACTCGGTGCAGCCCTATTT
CTACTGCGACGAGGAGGAGAACTTCTACCAGCAGCAGCAGCAGAGCGAGCTGCAGCCGCCGGCGCCCAGCGAGGATATCTGGAAGAAATTCGAGCTGCTGCCCACCCCGCCGCTGTCCCCGAGCCGCCGCTCGGGGCTCT
GCTCGCCCTCCTACGTCGCCTTCGCGTCCTTCTCCCCCCGGGGGGACGACGACGGCGGCGGCGGCAGCTT
TTCCACGGCCGACCAGTTGGAGATGGTGACCGAGCTGCTGGGAGGAGACATGGTGAATCAGAGCTTCATC
TGCGACCCGGACGACGAGACCTTCATCAAAAACATCATCATCCAGGACTGCATGTGGAGCGGCTTCTCGG
CCGCCGCCAAGCTCGTCTCGGAGAAGCTGGCCTCCTACCAGGCTGCGCGCAAAGACAGCGGCAGCCCGAG
CCCCGCCCGCGGGCCCGGAGGCTGCCCCACCTCCAGCTTGTACCTGCAGGACCTGACCGCCGCCGCCTCC
GAGTGCATCGACCCCTCCGTGGTCTTCCCCTACCCGCTCAACGACAGCAGCTCGCCCAAGCCCTGCGCCT
CCCCCGACTCCGCCGCCTTCTCCCCGTCCTCGGACTCTCTGCTCTCCTCGGCGGAGTCCTCCCCGCGGGC
CAGCCCCGAGCCCCTGGCGCTCCACGAGGAGACACCGCCCACCACCAGCAGCGACTCTGAGGAAGAACAA
GAGGAAGAAGAAGAAATTGATGTCGTTTCTGTGGAGAAAAGGCAGCCCCCTGCCAAAAGGTCGGAATCGG
GGTCACCCTCTGCCGGAGGCCACAGCAAACCTCCTCACAGCCCGCTGGTCCTTAAGAGATGCCACGTGCC
CACCCACCAGCACAATTACGCAGCGCCCCCCTCCACTAGGAAGGACTACCCAGCCGCCAAGAGGGCTAAG
TTGGACAGTGGCAGGGTCCTGAAACAGATCAGCAACAACCGCAAATGCATCAGCCC
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