气相色谱柱详细解读111.docx

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气相色谱柱详细解读111

第四章气相色谱分析色谱柱

色谱柱是气相色谱仪的心脏，由柱管和固定相组成。

一、柱管

不锈钢、玻璃、铜、铝、塑料为材料制成。

长1～3m不等，内径多为2～6mm。

成U型、螺旋型。

一般认为，管径越细，管长越长，分离效果越好。

但过细过长会影响载气的流速，增加分析时间，又会造成填充的困难。

对易分离的组分可用短柱，反之则用长柱。

二、固定相

气-液色谱的固定相，是由载体（担体）和涂渍在载体表面的固定液组成。

1、担体

它是一种化学惰性，具有不定期粒度和多孔性固体颗粒。

它为固定液提供一个大的惰性表面。

它必须满足以下条件：

（1）学惰性；

（2）多孔性；

（3）热稳定性并有一定的机械强度；

（4）粒度均匀细小，一般用60～90目。

类别有硅藻土类和非硅藻土类两大类型。

（1）藻土型

红色硅藻土：

6201、201、C22保温砖、ChromosorbP、GasChroR等。

白色硅藻土：

101、102、Gelite545、GasChrom（A.P.Q.S.Z）、Chromosorb（W.A.G）

硅藻土载体并非完全惰性，表面仍有吸附活性中心，分析样品时常会出现色谱峰拖尾，延长保留时间，降低柱效能。

因此，常需进行处理。

处理方法有：

酸洗（AW）——用6mol/LHCl加热浸泡载体20～30min，用水洗至中性，140℃下烘干备用。

碱洗（BW）——用5～10%的NaOH水溶液煮沸或用5～10%NaOH甲醇溶液浸泡，用甲醇洗至中性，于140℃下烘干。

硅烷化——消除载体表面硅醇、硅醚活性中心。

硅烷化处理试剂有二甲基二氯硅烷（DMCS），六甲基二硅氨烷（HMDS），三甲基氯硅烷（TMCS）。

硅烷化处理是用硅烷化试剂的苯溶液浸泡，倾出后用甲醇洗到中性，于一定的温度下烘干。

（2）非硅藻土型

氟树脂、玻璃微球、高分子多孔微球等。

1、定液

它是一类高沸点的有机化合物。

混合物能否有效分离，主要取决于固定液的性质。

要求：

操作温度下呈液态，且粘度越小越好；操作温度下有较低的蒸气压；化学稳定性好；选择性高，溶解性好。

常用固定液：

（1）DC-200（甲基硅酮）、SE-30（二甲基硅酮）、DC-11（硅润滑脂）、QF-1（氟代烷基硅氧烷聚合物）、OV-17（50%苯基甲基硅酮）、PEGA（聚乙二醇已二酸酯）

当分析含有不同官能团的复杂混合物时，一种固定液很难将这些难分离的组分分离开来，此时常将性质不同的两种固定液以适当比例混合，使其对复杂混合物有较满意的分离效果。

三、色谱柱的制备

1、柱的试泥漏和清洗

（1）试漏柱管全部浸入水中，将出中堵死，通气，在稍高于操作压力下不应有气泡冒出。

（2）清洗玻璃柱用洗液浸泡洗涤2次，用自来水冲至中性，再用蒸馏水、丙酮冲洗。

内壁应不挂水珠。

烘干。

不锈钢柱用10%HCl浸泡抽洗至洗液无金属或其它悬浮物，用自来水冲洗至中性；再用10%热碱液抽洗4～5次，除去柱管内壁油腻性污物，自来水冲至中性，再用蒸馏水、丙酮洗，烘干。

1、固定液的涂渍

（1）计算载体体积与称取载体重量

计算柱体积：

柱体积=πr2L　

用量筒量取比计算所得柱体积多20～30%的载体。

注意摇实。

然后称量载体重量。

（2）据液载比和载体重量计算并称取固定液

固定液量=载体重量×液载比

在分析天平上称，准确至小数点后第三位。

（3）涂渍——静态法

称好固定液，倒入一定量的溶剂（每克红色、白色硅藻土分别约需溶剂1.5、2.0ml）中，置热水浴上（温度低于该溶剂沸点），溶解后，倒入载体，所用溶剂的量应恰好淹没载体，轻摇使载体和固定液混合均匀。

于红外灯下赶下溶剂或自然挥干。

80～100℃下烘干。

涂渍过程中切不可图快，在高温下烘烤，溶剂挥发过快，造成涂渍不均匀；也不宜用玻棒猛烈搅拌，这样会使载体破碎。

2、柱——泵抽装柱法

装柱过程的正确与否很大程度上影响柱效能。

柱的尾端塞少许玻璃棉，接真空泵；柱的另一端接一小漏斗，在抽吸下倒入固定相，并不断轻击柱子，使均匀填充。

要避免形成细小的沟道。

填充好的柱子两端要塞上玻璃棉。

3、谱柱的老化

目的是将残余溶剂和低沸点杂质赶走。

并使固定液在载体表面分布得更均匀。

填充好的柱子要在高于操作温度10～25℃，但低于固定液最高使用温度下加热几小时，同时还要通入载气，流速约5～10ml/min。

为防污染检测器，柱出口要与之脱开。

第五章薄层色谱法（TLC法）

一、TLC原理和特点

TLC是色谱法中之一，属于液相色谱，即将吸附剂涂布于玻璃板上（或其它载体上）形成一薄层进行色谱分析。

它是分离、提纯、鉴定和检测微量物质的一种方法，具有分离鉴定速度快（30分钟完成）、简易、易于掌握、分离效率高、灵敏度高等优点，在农业、化工、医药、卫生、食品、环保等方面有广泛的应用。

但因整个操作体系是开放的，受外界影响较大，重现性差，故人们通常认为TLC是“廉价易于采用的二等检测技术”即“概略定量”。

原理（吸附薄层层析）

依据：

吸附剂对不同物质吸附能力不同；展开剂对不同物质溶解度不同，通过展开达到分离的目的。

即混合液点在薄层板上时，吸附剂对不同物质有不同程度的吸附，在用溶剂展开时，因薄层上的毛细管效应，溶剂上升，当升到原点时，混合物溶解，溶解后随着不断上升的溶剂上移于原点之上，遇到新的吸附剂又被吸附，接着又溶解、解吸，使斑点不断上移。

而在上升过程中，由于有的成分吸附得牢些，即上移速度慢些，反之则快些，从而达到“差速迁移”，当展开至一定距离后，就可达到分离混合物的目的。

斑点上升的高度用Rf表示：

原点至斑点中心的距离

Rf=所以Rf≤1

原点至溶剂前沿的距离

二、薄层色谱基本程序：

薄层板的制备

样品的提取、纯化、点样

展开剂的选择、展开

斑点检出

原点观察、显色、萤光观察

定性、定量、分离、提纯

三、试剂

（一）吸附剂

1、种类：

硅胶、三氧化二铝、硅镁型吸附剂、纤维素、硅藻土等。

（1）硅胶：

极性吸附剂成分SiO2.xH2O

总表面积：

300-600平方米/克。

分类：

硅胶G、硅胶H、硅胶GF254、硅胶HF254

适用范围：

适于分离大多数物质或反复杂的混合物分离成许多组分物质，因硅胶呈弱酸性（PH3-5），故不适宜于分离强碱性物质，还不透于分离化性十分接近而且仅仅是双键位置不同的物质。

（2）、三氧化二铝：

吸附作用是利用其表面活性。

总表面积：

100-350平方米/克。

种类：

同硅胶有四种

用范围：

适于分离空间排列或官能团型式不同的极性不大的物质，尤其适合于分离在分子内部能形成氢键的物质。

2、活性与吸附性能

（1）活性：

用来表示吸附剂吸附力的强弱。

吸附力强的活性大，反之则小。

活性大小与吸附剂含水量多少密切有关，水分含量高则活性小，反之则活性大。

（2）为使TLC测定结果有较好的重现性，必须注意吸附剂活性的稳定性，所以吸附剂有使用前常需烘干脱水或加水以控制活性大小，分别称为“活化处理”和“减活处理”。

（3）在吸附剂上，样品各个组分，按怎样顺序展开分离？

一般地：

极性越强的组分，越易被吸附剂吸附，即在薄层上越不易展开，Rf越小。

极性相同时，分子量越大的组分RF越小。

（4）因此选择展开剂应从两个方面考虑：

被分离物质极性大小；吸附剂的吸附性能强弱。

一般被分离的物质的极性大，应选择吸附能力弱的吸附剂；反之也然。

（二）展开剂

展开剂在TLC中作为输送物质的载体（流动相），常用的是低沸点的有机溶剂。

1、常用展开剂的极性：

正已烷（石油醚）<正庚烷〈环已烷〈四氯化碳〈苯〈二氯甲烷〈三氯甲烷〈乙醚〈乙酸乙酯〈正丁醇〈丙酮〈乙醇〈甲醇〈水〈有机酸或碱。

在同一薄层上展开剂的极性越大，则被测物质在薄层上被推得越远，RF越大。

2、为使混合物达到良好的分离，通常采用两种或两种以上溶剂组成“展开系统”。

展开剂底剂（基础溶剂）：

常用极性小的（90%）；洗肢剂：

常用极性大的（10%）。

3、展开剂的选择：

被测物是非极性的，要求选择非极性的或弱极性的展开剂和活性高的吸附剂。

对于实际业务，样品极性，吸附剂的吸附能力在一定情况下是一定的，所以主要是改变展开剂来提高分离效率，当然展开体系的选择也需要通过多次实验才能确定。

四、薄层色谱技术

包括制板、点样、展开、显色、检测等。

（一）制板

方法：

涂布法、倾注法、浸润法、喷涂法。

这里介绍倾注法：

1、清板：

载板是表面平滑的玻璃板，矩形，规格根据需要定，常见有：

5×15；5×20；8×20；10×20；20×20等。

同玻璃仪器洗涤方法洗净、晾干或烘干、用乙醇擦净。

2、调浆：

称一定量吸附剂于研钵中（0、3mm薄层100平方厘米需硅胶G1克三氧化二铝1、2克），加2倍量水（先加部分，迅速研磨，再倒入全部水），研磨至浆液刚粘稠时进行涂布。

注意：

掌握加水量；研磨动作适中，防止产生气泡；掌握浆液的涂布“火候”。

3、涂布：

将浆液沿玻棒倒于板的一端，并将这端提起，用玻棒带动吸附剂涂遍整板迅速震拍使厚薄均匀，平放、晾干（10-15分钟）。

这一步是关键，要求涂布好的薄层，厚薄均匀、表面平滑、没有气泡波纹、牢固不易脱落。

4、活化：

风干后的薄层板直接放于烘箱中烘干或放在干燥铝架上烘干。

烘干温度与时间视需要定，一般硅胶板在105℃下烘1小时，三氧化二铝板在200-220℃下烘4小时。

活化后的薄层板储存在干燥器内一周后应另行活化。

（二）点样

这是关键的操作，只有原点足够小，形状规则，才有可能得到较高的分离度和灵敏度。

要求：

点样精确、迅速（不超过10分钟）；斑点集中（溶剂扩散直径不超过3mm）；各点大小一致，在同一起始线上。

工具：

微量注射器或定体积毛细管。

操作：

刀片刮去薄层板边缘的吸附剂；作出起始线和溶剂前沿记号（起始线距底端2-3厘米，前沿视展距而定）；用注射器点样，点与点间距1、0-1、5厘米，点与边缘距离0、5厘米。

注意：

板不得点破；点样体积少于2微升；点样量几至几十微克；边点边用洗耳球吹风以去溶剂；点样时间长时要在干燥盒内点样。

（三）展开

方法：

上行法、下行法、园形离心法、园形向心法、程序多级展开法等，最多的是上行法。

装置：

展开（立式、卧式）（内衬滤纸，以使溶剂挥发）。

方法：

1、内加适量展开剂，加盖密闭10分钟，使内溶剂蒸汽饱和。

2、将薄层板点有样品液的一端浸入展开剂中（5-7mm）。

盖好盖子（注意展开剂不得浸没样点、浸没部分要与起始线平齐）。

3、展开到达溶剂前沿时取出薄层板挥干溶剂。

注意：

展开剂用过1-2次后要更换，因底剂与洗脱剂的比例已改变；展开过程中槽内要保证溶剂蒸气饱和，以防边缘效应。

（四）显色

1、显色剂显色法：

喷雾显色，借助喷雾器喷细雾至板面湿润。

2、紫外线照射法：

如AFTB1在WL365nm观察；有机氯在254nm下显色。

3、对本身是有色的斑点则不需显色。

（五）定性定量

1、定性：

斑点显色后量出高度，求得Rf值，通过查阅文献鉴别各种物质。

但Rf可受到外界因素的影响而使不易重现，这些外界因素有：

吸附剂的种类及粗细度、粘合剂的性质及含量、薄层厚度、展开系统组成、展开槽内蒸汽的饱和程度、展距、薄层板活性及点样量大小等。

所以通常的定性方法是将样液和标液点到同薄层上作对照。

为了增加鉴定可靠性，可进行确证或更换展开系统。

2、定量：

传统的方法是目视半定量法，此法简便易行，无需贵重仪器，易于推广。

（1）最低检出量法，用不同浓度的标准溶液点板、展开、显观察、反复核定在该实验条件下标准物质的最低检出量是多少。

最低检出量（ug）=最低检出量时的体积（ul）*标准溶液浓度（ug/ul）

将不同量的样液与最低检出量时的标液点板，薄层色谱分离，经显色后观察。

如果各标准点相同位置上样液的斑点大小、颜色深浅相同，就可以认为滴加的样液中含有最低检出量待测物；如果比最低检出量点颜色深，则需稀释，直到相同。

（2）目视直接比较法：

在同一薄层板上点不同体积的样液和各种浓度的标液，展开、显色后，用肉眼观察比较与标准的面积大小和颜色深浅，台两者近似，即可以认为此样品液体积中含待测物量与标准点中所含物质的量相同。

近十年，原位直接定量有了新的发展，薄层扫描仪和棒状薄层色谱氢焰扫描仪的出现，使极微量的物质（PPb-PPm级）在分离后可直接在薄层上得到精确的定量，从而使该法从过去的半定量成为现代化全新定量。

*薄层扫描仪简介：

它是可以对斑点进行扫描的专用分光光度计，用可见光或紫外光作光源，线性扫描或锯齿扫描薄层板展开后的斑点，该斑点就吸收该组分特征波长的单色光，剩余的单色光经透射或反射或发射荧光，由检测器积分起来，获得这块斑点面积的待测物质含量。

有透射法；反射法；萤光测定法。

*棒状薄层色谱氢焰扫描仪简介：

用表面涂有吸附剂的石英棒（直径0、9mm；长200mm）代替薄层板，点样于棒一端，按一般方法展开，以氢焰检测器为检测单元，棒放于仪器内，点火，以一定速度扫描。

斑点洗脱后测定法：

薄层经展开后用刮刀或捕集器将斑点的吸附剂捕集后，再用适当有机溶剂洗脱，然后用可见、紫外分光光度法、荧光分光光度法测定含量。

但样品斑点不能喷显色剂，以免影响不测定，斑点位置的确定方法。

样品在紫外线下发射荧光的，可在紫外灯下观察斑点并用针划去斑点位置。

用碘蒸汽显色，在组分处理出棕色斑点（碘吸附后会挥发）。

用标准物对照，将标准点于边上一测显色时，盖住样品，定出斑点位置。

五、高效薄层色谱（HPTLC）简介

采用粒度分布很窄的微粒硅剂（5-10um）制备高效薄层板，用程序多级展开或园形展开技术使薄层色谱的灵敏度和分辨率大大提高。

特点：

1、提高分辨效率：

分辨率与吸附剂微粒半径的平方成反比。

100um的吸附剂制成的薄层，理论增板数为200左右，而小于20um硅胶制板其增板数可增至数千至上万，而5-10um硅胶板的增板数还要更高。

2、缩短分析时间：

展开速度与吸附剂颗粒半径成正比，故颗粒越小，展开速度越慢，但因分离效率提高了之后可以大大缩短展开距离。

3、增加检出灵敏度：

采用程序多级展开技术，可以克服因吸附剂颗粒小造成的拖尾现象，并可使圆或椭圆斑点集中在一条线，使斑点的单位面积中样品浓度增加，从而提高检出灵敏度。

要求：

点样体积小于0、1ul，原点直径小于1、0mm，甚至0、1mm。

关于特殊展开技术

1、多级展开：

第一次展开后用同一展开剂再展一至多次，相当于增长了展距，使分离度改善。

多次展开时斑点的浓集，使圆形斑点变为椭圆形甚至线形。

（1）单向多级展开：

同一薄层板，用同一溶剂沿同一方向，进行同一距离的展开，它能增加相邻点间的距离。

（2）增量多级展开：

同一薄层板，用同一溶剂，沿同一方向，进行逐次增加展距的展开，它能提供一个比一般薄层色谱好得多的分离度。

（3）程序多级展开：

同一薄层板，用同一溶剂，沿同一方向，逐次增咖展距，并在溶剂上升至前沿后用惰性气体或辐射加热控制薄层板上的溶剂，使溶剂由前沿退回原点。

但在溶剂展开与干燥过程中，薄层板一直与溶剂接触，这样使斑点在溶剂再次上升和溶剂缩回时浓集，最后使斑点集中成一条线。

2、分级展开：

同一薄层板，沿同一方向，用两类显著不同的溶剂进行不同距离的展开，它对同一物质中吸附性质或分配性质存在着明显区别的组分分离是非常成功的。

3、双向展开：

同一薄层板，沿两个不同方向，用两种性质不同的溶剂进行展开，它对每组分混合物的分离很有价值。

梯度洗脱：

在展开过程中，两种或多种不同极性组成的展开剂不断地混合，连续改变浓度和极性，增加展开剂洗脱能力。