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细胞
一、组织培养的基本概念
Tissueculture:
从体内取出组织摹拟体内的生理环境,在无菌、适当温度、和一定营养条件下,使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。
体外培养常用上皮组织:
胚胎发育的内、中、外三个胚层均可分化成上皮组织。
细胞形态较为规则,细胞间常以黏着物和特殊连接牢固相连。
.细胞培养培养物是单个细胞或细胞群。
细胞在培养时都要生活在人工环境中,由于环境的改变,细胞的移动或受一些其他因素的影响,培养时间加长,传代导致细胞出现单一化型。
器官培养器官培养:
与组织培养条件相似,培养的是器官的原基,器官的一部分或整个器官,以便能够在体外生存、生长和保持一定功能的方法。
细胞培养目的与用途
•1、科学研究:
药物研究开发与基础研究
•
(1)新药筛选:
(2)疫苗研究与开发:
(3)基因工程药物研究与开发:
(4)细胞工程药物研究与开发:
(5)单克隆抗体制备:
(6)药物作用机理(6)基因功能(7)疾病发生机理
•2、生物制药
•
(1)疫苗生产:
(2)基因工程药物生产:
(3)诊断用和药用单克隆抗体生产
•(4)细胞工程药物生产:
对组织培养的评价
•优点:
1、直接观察活细胞的形态结构和生命活动。
2、便于用各种不同技术方法研究细胞。
3、培养细胞携带有与体内细胞同等的基因组,广泛用于分子生物学和基因工程研究。
4、同时提供大量的生物学性状相似的实验对象。
•不足:
利用培养细胞做实验对象时,不应视为与体内细胞一样。
组织培养细胞生物学
•一、体内外细胞的差异
•“反祖”(Atavism)现象:
细胞失去原有组织结构和细胞形态、分化减弱或不显;表现为细胞趋于单一化,或获得永生性,或变成具有恶性性状的细胞群。
•二、培养细胞的分化
•1、不适应(deadaption)细胞在原体内时所拥有的分化特征减弱或不显。
(培养的肝细胞酪氨酸转移酶特性丧失)。
生存条件改变使分化阻抑。
•2、脱分化或去分化(Dedifferentiation):
•细胞失掉发生分化的能力(培养的肝细胞失掉产生精氨酸酶、氨基转移酶等特性后,则失去储存肝糖原能力)。
是基因突变所致
•培养细胞在体外生存时间与其分化能力呈反向关系。
•细胞分化的关键在于是否存在有诱导细胞发生分化的因子。
培养细胞的形态分类
根据是否附于支持物上生长的特性,分为:
贴附型悬浮型
(一)贴附型
细胞贴附在支持物表面生长,只依赖贴附才能生长的细胞叫做贴附型细胞(Anchorrage-dependentcells)这种现象与细胞分化有关。
贴附型细胞的分型
1.成纤维型细胞:
(fibroblast)来自中胚层
特点:
与体内成纤维细胞形态相似,胞体梭型或不规则三角形,中央有圆形核,胞质向外伸出2~3个长短不同的突起。
细胞在生长时呈放射状,漩涡或火焰状走行。
起源:
细胞来自中胚层间充质组织。
除真正的成纤维细胞、心肌、平滑肌、成骨细胞血管内皮细胞。
注意:
细胞在培养时成为成纤维型细胞是一种惯称,与体内细胞不同。
2.上皮型细胞(epithliumcelltype)来自外胚层特点:
扁平不规则多角型、圆形核、细胞紧密相连成细胞增殖数目增多时,整个上皮膜随之移动。
边缘细胞很少脱离细胞群而单独活动“拉网”现象与起源内外胚层组织有关。
组织:
皮肤表皮及其衍生物(汗腺、皮脂腺)消化道分上皮、肝、胰、肺泡上皮。
3.游走型细胞(wanderingcelltype)
特点:
在支持物上散在生长,不连接成片,胞质伸出伪足或突起呈活跃的游走或变形运动,速度快不规则,密度大连接成片呈多角形不易与其他类型的细胞区别。
4.多形型细胞(polymorphiccelltype)
特点:
无规律的形态,如神经细胞。
悬浮型细胞(suspendedcelltype)
特点:
不贴附在支持物生长,胞体圆形,在培养液中生长空间大,可长时间的生长,繁殖旺盛便于做细胞代谢研究。
S180肉瘤、血液里的白细胞、K562、HL-60。
分型的目的:
方便描述细胞在培养过程中的形态变化。
培养条件好时,细胞相对稳定,可反映出起源、正常异常的区别,作为判定细胞生物学性状指标。
强调:
一般形态并不是一项可靠指标要受各方面影响。
如:
反复开关温箱、温度、C02的浓度、培养基变碱、支原体、pH值。
细胞在接种时呈三角型状态,经培养一定时间后,细胞在传代前已形成上皮型细胞。
培养细胞的生长和增殖过程
•
(一)组织培养细胞生命期:
原代培养期
•传代期衰退期
•原代培养(primaryCulture)从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段。
细胞群是异质的,细胞相互依赖性强。
细胞独立生存性差。
•传代培养:
当细胞增殖达到一定密度后,需要分离出一部分细胞和更新培养液,继续接种进行培养。
这一过程称为传代。
否则将影响细胞的继续生存。
•细胞系(cellline):
初代培养细胞一经传代后,称做细胞系。
•无限细胞系:
细胞获永久性增殖能力。
核型大多变成异倍体。
•克隆形成率(CloningEfficiency):
细胞被稀释分散成单个细胞进行培养时,形成细胞小群(克隆)的百分数。
•克隆细胞株:
从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法,由单细胞增殖形成的细胞群.
•
(一) 细胞生命期(lifespanofculturecells)指细胞在培养过程中持续增殖和生长的时间。
一般根据细胞种类、性状和原供体的年龄的情况而定。
•如:
二倍体成纤维细胞,在不冻存和反复传代条件下可传30~50代,相当于150~300个细胞增殖周期,能维持一年左右的生命,细胞便开始凋亡(apoptosis)。
1.原代培养期(primaryculture)组织到第一次传代时间大约为1~4周
特点:
细胞活跃移动,分裂,但不旺盛多呈二倍体核型。
原代与体内原组织形态结构和功能活动基本相似。
各细胞的遗传性状互不相关,细胞相互依存性强,如果把这种稀释分散成单细胞,在软琼脂培养基中进行培养细胞克隆的形成率(cloningefficiency)下降,表明细胞独立生存性差。
2.传代期(passage)初代培养细胞一经传代便称之为细胞系(cellline)
特点:
细胞增殖旺盛,并维持二倍体核型,也叫二倍体细胞系(diploidcellline)为了保存二倍体细胞性质,细胞应在初代或传代早期冻存为好。
一般细胞在10代以内冻存。
冻存配方:
向培养液加入保护剂二甲基亚砜(DMSO)或甘油,封入安瓶中。
存于在液氮中温度可达到-196℃,可长期储存。
如解冻后细胞复苏,仍能继续增殖生长,细胞性状不受影响,成为保存细胞最主要的手段。
3.衰退期
特点:
细胞仍生存增殖减慢不增殖轮廓增强衰退凋亡
注意:
细胞在三期中的任何一期(一般发生在传代后期或衰退期)在某些因素影响下,如血清质量不佳、病毒污染、温度和pH不稳等,细胞可能发生自发转化(spontaneoustransformation);
细胞可能获得永生性(immortality)或称为恶性性(malignancy)。
细胞获得持久性的增殖能力,这样的细胞群体称为连续细胞系(continuouscellline)。
而细胞获得不死性后,细胞核型大多变成异倍体(heteroploid)接触抑制消失。
(二)培养细胞一代生存期
“一代”指细胞接种到分离再培养的所用的时间。
与细胞倍增一代不是一个含义。
在细胞一代中,细胞能倍增3~6次,经历三个阶段:
1.潜伏期(latentphase):
接种经过悬浮期(细胞质回缩,胞体呈圆球形)贴壁。
•初代培养细胞经过10~24小时或更多时间。
•连续细胞系和癌细胞系经过10~30分钟贴附。
贴附现象是一个非常复杂和受多种因素的影响。
影响细胞贴附:
底物表面不干净,影响细胞贴附。
利于细胞贴附:
底物表面带有阳性物质与特殊物质:
纤粘连蛋白(fibronectinFN)、
细胞表面蛋白(cellsurfaceproteinCSP)
这些物质有的存在与细胞表面,有的来自血清。
潜伏期特点:
长短与细胞接种密度、种类、使用的培养基性质有关。
(1)细胞贴附后进入潜伏期,细胞无增殖。
少见分裂相,细胞有运动活动。
(2)初代培养细胞潜伏期约为24~96小时或更长,
连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期约6~24小时。
(3)细胞接种密度大潜伏期短。
(4)细胞出现分裂相增多时,标志细胞进入指数增生期。
2指数增生期:
细胞增殖最旺盛,细胞分裂相增多。
是细胞一代中活力最好的时期,是进行各种实验最好和最主要的阶段。
持续3-5天。
•细胞分裂指数(MitoticIndex,MI):
细胞群中每1000个细胞中的分裂相数.
条件:
分裂相数与细胞种类、培养成分、pH培养箱温度有关。
正常细胞:
细胞相互接触能抑制细胞运动,这种现象称为接触抑制(contactinhibition)。
肿瘤细胞:
没有这种现象,可作为区别正常与肿瘤细胞的标志之一。
当肿瘤细胞达到一定密度后向三维空间发展,使细胞发生堆积(piledup)。
由于细胞不断增殖分裂,细胞数量持续增多,培养液的营养成分减少,代谢产物增多,细胞受营养的枯竭和代谢物的影响,则发生密度抑制(Densityinhibition),导致细胞分裂停止。
3.停滞期(stagnatephase)
细胞量和密度达到饱和,细胞停滞增殖。
表明细胞进入到停滞期,细胞数量持平,也称为平顶期(plateau)。
特点:
细胞不增殖,有代谢活动。
培养液中的营养已逐渐耗尽,代谢产物积累增多,pH降低,此时需要传代,否则细胞将会中毒,发生形态改变,细胞会从底物脱落死亡。
注意:
传代过晚将影响下一代细胞的生长,至少要再传1~2代,通过换液淘汰死细胞和受损较轻的细胞。
待细胞全部恢复后再用。
在这一点上要特别注意。
培养细胞的增殖过程
G1期特点:
细胞进入增殖状态。
细胞持续时间的长短取决与营养物质的获得和生长因子的作用短则4~6小时,长可达几天;此期细胞内蛋白质合成、RNA合成、核糖核蛋白体合成增多,胞体增大,是镜下唯一可见的变化。
G1期的细胞是接收外界因子影响的特定阶段称为调节点(reguluationpointRP)如细胞获取营养不足或因子的缺乏在R点作用下,细胞在G1期发生受阻,G1期时间延长。
S期特点:
细胞发生DNA合成,约为6~8小时,DNA合成一经开始,能持续进行,独立性较大,并对环境不利因素有一定耐受能力。
由于DNA在进行合成时,多核苷酸双链发生分离,细胞易受到突变或致癌因素作用的影响。
值得注意:
S期是遗传物质易受突变物损伤的时期。
G2期特点:
•DNA含量加倍,具有4倍量的DNA。
细胞持续时间较短平均为2~5小时。
•细胞发生与细胞分裂有关的RNA合成和染色质螺旋化。
•细胞对外界环境敏感,易受温度、pH及各种其他因素的影响而受阻,不能进入M期。
当不利因素消除后,细胞能很快恢复。
M期特点:
是研究细胞有丝分裂过程理想的对象,细胞分裂相形态和分裂过程,在相差显微镜下可清晰观察到。
细胞分裂过程分为四期:
前期:
细胞质逐渐回缩,细胞体变园与底面附着面减少,脱落入培养液中,染色体由分散状态开始向细胞中央部移动,突然“冻结”于赤道平面,前期持续时间为20~30分钟。
后期:
染色体分成两组分别向两极移动,整个细胞由圆球形变成椭圆形,胞体呈哑铃形,后期时两组染色体相互分离。
细胞分裂过程最快持续时间5~7分钟,在镜下可直接观察到。
末期:
两组染色体达到两极,胞体中部变细染色体变成染色质,核仁核膜再现、胞体逐渐分离、形成两个子细胞,有细丝相连,经过较长时间两个子细胞各自独立。
细胞质延展于底物变扁。
末期持续时间为20~30分钟。
细胞分裂全程持续时间一般为30~60分钟。
因细胞种类不同和温度变动,分裂时间将有一定差别。
细胞和细胞、细胞和基质的相互关系
一定条件下:
单个细胞表现出独立性,生存和增殖,但不能长久生存。
有活力的细胞需要繁殖形成群体细胞,是培养细胞的基本存在形式。
与体内细胞相似,细胞与细胞之间具有形态和机能上相互依存关系。
结构:
上皮细胞可见桥粒,说明细胞间有扩散的能力。
生理活动:
•单个细胞生存能力不如群体细胞强,说明细胞之间能相互沟通信息。
•正常细胞一旦两相邻细胞发生接触,出现接触抑制现象,导致运动停止。
•正常细胞群体依赖性(populationdependencePD)比恶性细胞PD小。
•单细胞培养和软琼脂培养是检测细胞PD的常用方法。
体内细胞:
细胞的分化与细胞外基质(extracellularmatrixECM)有密切关系。
离体培养细胞:
细胞对ECM也仍有依存性。
应用适应的ECM(如上皮细胞对胶原)能诱导细胞特性表达;ECM对细胞贴附、分化、生长和增殖等都起到重要作用。
培养细胞生存环境、条件和代谢
•一、无污染环境二、温度:
三、气体环境和pH四、培养细胞生存所需基本物质
1、糖2、氨基酸3、各种维生素4、促生长因子*:
血清*5、其他物质
五、渗透压
(二)温度:
人哺乳动物:
36.5℃±0.5℃;
鸟类:
38.5℃;
一般培养细胞对低温的耐受力比高温强温度上升不超过39℃时,细胞代谢强度与温度成正比。
39~40℃1小时,受损伤的细胞可能恢复;
41~42℃1小时,严重损伤,个别细胞恢复;
43℃以上1小时,细胞全部死亡。
温度不低于0℃时,细胞代谢有影响,无伤害作用;
置于25~35℃,细胞能生存,但生长速度减慢;
放在4℃数小时,再放回37℃细胞仍继续生长。
细胞代谢随温度降低而缓慢,温度降至冰点以下时,细胞因胞质结冰受损而死亡。
(三)气体环境和氢离子浓度
气体:
氧气和二氧化碳
氧气:
参与三羧酸循环产生能量供给细胞生长、增殖和合成各种所需成分。
•氧气分压1995~89975Pa,适用于封闭式单层细胞培养;
•开放式培养(碟皿或培养瓶松盖培养)细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中。
CO2:
细胞代谢产物,也是细胞所需成分。
其主要作用维持培养基的pH值。
大多数细胞的适宜pH7.2~7.4,偏离此范围对细胞将产生有害的影响。
有些细胞存在差异。
如羊水细胞培养检测染色体时pH为7.6。
细胞耐酸比耐碱性大一些,在偏酸性环境中更有利于细胞生长。
为了维持培养液恒定的pH,最常用磷酸缓冲剂方法。
磷酸缓冲剂中NaHco3,可供给CO2但容易逸出,适用:
封闭式培养的细胞。
(无CO2培养箱)
羟乙基哌嗪乙硫磺酸(N`-2-HydroxyethylPiperazine-N`-EthanesulfonicAcid缩写HEPES)
HEPES:
对细胞无毒性也不起缓冲作用,主要作用是:
防止pH迅速变动,在开瓶通气培养或活细胞观察时能维持恒定的pH。
细胞生存所需基本物质
与体内基本相同,除碳水化合物、氨基酸、脂类三大类营养物质外,一定量的无机盐、维生素和微量元素等,但需要的量以及代谢方式与体内细胞不尽相同。
糖:
六碳糖是主要的能源通过糖酵解形成乳酸和通过柠檬酸形成CO2。
胚胎细胞和一些转化细胞的培养基中常见到乳酸堆积现象。
糖是合成某些氨基酸的原料;
经过乙酰辅酶A(CoA)合成脂肪;
经过糖解磷酸通路能合成核酸。
各种糖的吸收取决于它们进入细胞的能力,其中葡萄糖最强,半乳糖最低。
2.氨基酸:
12种氨基酸:
精氨酸(Arg)、胱氨酸(Cyst)、异亮氨酸(Zle)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、蛋氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、苏氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、组氨酸(His)、酪氨酸(Tyr)、缬氨酸(Val)是细胞蛋白质合成的原料。
所有细胞都需要谷胺酰胺,其特殊的作用,可促进各种氨基酸进入细胞膜。
所含的氨是核酸中嘌呤和嘧啶的来源;
是合成3,2和一磷酸腺苷时所需物;
是能源和碳的来源。
如没有谷胺酰胺细胞生长不良而发生细胞死亡。
所以要求各种培养液中都含有较大量的谷胺酰胺。
谷胺酰胺在溶液中不稳定,应放置在-20℃冰箱保存,用前加入培养液内。
已含有谷胺酰胺的培养液在4℃冰箱内可放置两周以上时重新加入原来量的谷胺酰胺。
需要维生素、生物素、叶酸、胭酰胺、核黄素、硫胺素、泛酸、吡多醇及B12等。
这些维生素在常用培养基中已成为固定组成分。
脂溶性维生素对细胞生长也有作用,一般从血清中得到补充。
3.促生长因子:
培养液除营养成分外,也需要激素类物质起到促进细胞增殖生长作用。
•胰岛素(1~10单位)促进细胞利用葡萄糖和氨基酸;
•氢化可的松(10-8~10-7M)促进表皮上皮细胞和乳腺上皮细胞增殖生长的作用,提高神经胶质细胞和成纤维细胞的克隆形成率;
4. 其它物质:
在细胞生长过程中,需要钾、钠、钙、镁氮和磷以外,还需要微量元素,如铁、锌、硒铜、锰、钼钒等。
需要促细胞粘附物质其作用是:
有助于促细胞贴附在各种底物或支持物上组织生长。
5.人工培养基:
细胞在体外的生存环境是人工模拟的,除注意到无菌、温度、空气等条件外,最主要的是培养基,是供给细胞营养和保证细胞生长组织的物质。
培养基的种类分为半固体和液体培养基两类。
液体培养基:
分为合成、天然和无血清培养基三种。
A.合成培养基:
成分清楚,通过调节各种成分的数量和种类,再借观察细胞生物状况反应性变化,测定细胞与外界环境的适应能力。
借以了解细胞生存条件,诱导细胞进行定向分化的等。
合成培养基在应用上广泛。
B.天然培养基:
用人或动物血清、血浆和胎汁等。
常用牛血清。
血清含有多种促生长因子、贴附因子及其它活性物质等。
•加入5%血清:
维持细胞不死或缓慢生长;
•加入10%~20%血清:
细胞增殖生长。
血清的主要作用
•提供细胞生存、生长和增殖所必需的生长调节因子。
•补充培养液中没有或量不足的营养成分。
•含有生长基质成分使细胞易贴附在培养器皿上。
•提供载体蛋白,可结合维生素、脂质、金属离子等。
•有中和毒性物质保护细胞不受伤害。
•提供蛋白酶抑制剂,保护细胞不受死细胞释放的蛋白酶的损害。
血清存在的问题
•存在有害于细胞生长和繁殖的物质。
如补体、免疫球蛋白和一些生长抑制因子。
•成分不明确,影响对结果的分析。
•不同动物、不同批次的血清和活性差别较大,使培养的结果不稳定。
C.无血清培养基:
培养基内加入促细胞生长因子,当前发现各种促细胞生长因子已达几十种。
还有三碘甲状腺素、转铁蛋白及大鼠颌下腺粗提物。
具有促进细胞生长增殖的作用。
6.附着底物:
除少数悬浮型细胞外,绝大多数体外培养细胞需附着在适宜的底物上生长。
细胞贴附在底物上生长的性质称锚着依赖性。
不同细胞对底物要求不同,底物不适对细胞生长不良。
常用的底物:
A.玻璃:
如用NaOH处理,性质能受到一定影响;酸中和以后再用(新的盐酸泡)易碎。
B.一次性塑料:
聚苯乙烯:
多为一次使用。
聚四氟乙烯包括:
充电荷:
亲水性,适用单层培养
不充电荷:
疏水性,适用巨噬细胞、转化细胞的培养。
聚四氟乙烯透气性好可制成薄膜,剪成小块后放入各种瓶皿中,适于细胞贴附生长,也便于取出,可进行染色和做电镜切片。
C.微载体:
由聚苯乙烯和聚丙烯酰氨混和制成小球体,附着面大,利于大量繁殖细胞。
D:
饲细胞(Feedercells):
也称为滋养细胞,用成纤维细胞或其它细胞长成单层后,用大剂量射线照射,使细胞失去增殖能力,但能存活和有代谢活动。
将其作为底物,其它细胞接种上面;饲细胞的代谢产物也有利于其它细胞生长。
饲细胞用于:
特殊难培养细胞,注意避免用同源细胞。
7.抑制细胞生长因素
1.培养液消毒
2.操作不慎使有毒物质混在细胞生存的环境中,抑制细胞生长。
3.血清灭活处理可除去补体和降低免疫球蛋白的毒性,并不损伤多肽生长因子,但可能消灭另一些更有用的营养成分,因此有人提出,灭活血清不一定比不灭活血清更好。
体外培养细胞成功率分析
•成功的关键:
培养物必须贴附在底物上
•细胞生长和增殖
•一、组织和细胞的供体年龄二、培养条件三、贴附底物四、培养方法:
酶消化分离
组织培养设施和基本条件
•实验室设计
•细胞培养是一种无菌操作技术,要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其它有害因素的影响。
细胞培养室和设计原则是防止微生物污染和有害因素影响,要求工作环境清洁、空气清新,干燥和无烟尘。
细胞培养室的设计原则一般是无菌。
操作区设在室内较少走动的内侧,常规操作和封闭培养于一室,而洗刷消毒在另一室。
常用设施及设备
•
(1)超净工作台:
。
•
(2)无菌操作间:
一般由更衣间、缓冲间和操作间三部分组成。
操作间放置净化工作
•台及二氧化碳培养箱、离心机、倒置显微镜等。
缓冲间可放置电冰箱、冷藏器及
•消毒好的无菌物品等。
•(3)操作间:
普通培养箱、离心机、水浴锅、定时钟、普通天平及日常分析处理物
•(4)洗刷消毒间:
烤箱、消毒锅、蒸馏水处理器及酸缸等。
•(5)分析间:
显微镜、计算机及打印机等。
培养器皿
•常用的器皿有下面几种。
•
(1)液体储存瓶:
用于储存各种配制好的培养液、血清等液体,常用规格有500ml、250ml、100ml。
•
(2)培养瓶:
根据培养细胞种类要求不同培养瓶的形态各异,规格有200ml、100ml、50ml、25ml、10ml等几种
•(3)培养皿:
用于开放式培养及其它用途。
分直径30mm、60mm、120mm
•(4)培养板
培养用液
•平衡盐溶液(BalancedSaltSolution,BSS)
•天然培养基(NaturalMedium)
•合成培养基(SyntheticMedium)
水
•培养细胞用水不含内毒素和有机污染物
•最好用玻璃或石英蒸馏器制备的三蒸水
•水不能放置太久,不超过2周
•Hanks’平衡盐溶液(Hanks’BalancedSaltSolutions,HBSS)
•成分含量(g/L)
•CaCl2(无水氯化钙)0.14
•KCl0.40
•KH2PO40.06
•MgCl2·6H2O0.10
•MgSO4·7H2O0.10
•NaCl8.00
•NaCO30.35
•Na2HPO4·7H2O0.09
•D-Glucose1.00
•PhenolRed0.01
•钙镁有促使细胞凝聚作用,配制离散细胞用的消化液和细胞洗涤液时,宜采用D-Hanks
天然培养基
•血清细胞培养液中添加的血清有牛血清、马血清、人血清等,其中牛血清是最常用的血清,分为胎牛血清和新生小牛血清
•热灭活是指56℃,30分钟加热已完全解冻的血清。
加热过程中須規則搖晃均勻。
此热处理的目的是使血清中的补体成分(complement)灭活。
除非必须,一般不建议作此热处理,因为热处理会造成血清沉淀物显著增多,而且还会影响血清的质量
合成培养基
•一、种类
•RPMI1640:
适用于很多细胞的生长,
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