PLATELIATM曲霉菌抗原检测试剂盒.docx
- 文档编号:25125291
- 上传时间:2023-06-05
- 格式:DOCX
- 页数:46
- 大小:152.88KB
PLATELIATM曲霉菌抗原检测试剂盒.docx
《PLATELIATM曲霉菌抗原检测试剂盒.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《PLATELIATM曲霉菌抗原检测试剂盒.docx(46页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
PLATELIATM曲霉菌抗原检测试剂盒
PLATELIATM曲霉菌抗原检测试剂盒
96人份62794
PLATELIATM曲霉菌抗原检测试剂盒是用于检测血清和肺泡灌洗液中的曲霉菌半乳甘露聚糖抗原的一种免疫酶夹心法微板分析技术
仅用于体外诊断
1-用途
PLATELIATM曲霉菌抗原检测试剂盒是用于检测成人血清样本中的曲霉菌半乳甘露聚糖抗原的一种免疫酶夹心法微板分析技术。
PLATELIATM曲霉菌抗原检测试剂盒是一种实验,当它联合其它诊断步骤,如微生物培养,活组织切片的病理分析和放射影像诊断依据时,被作为侵袭性曲霉菌病诊断的一种辅助方法。
2-使用说明
PLATELIATM曲霉菌抗原检测试剂盒是用于检测成人和儿科血清样本和肺泡灌洗液中的曲霉菌半乳甘露聚糖抗原的一种免疫酶夹心法微板分析技术。
PLATELIATM曲霉菌抗原检测试剂盒是一种实验,当它联合其它诊断步骤,如微生物培养,活组织切片的病理分析和放射影像诊断依据时,被作为侵袭性曲霉菌病诊断的一种辅助方法。
3-概述和解释曲霉菌感染通常开始于肺部开放部位吸入了环境中的曲霉菌孢子之后。
侵袭性感染是构成曲霉菌感染的最严重形式,在最近的10年里呈增长趋势。
这些感染主要发生在中性粒细胞减少症病人(抗癌治疗引起)和免疫抑制剂治疗的病人(器官移植,特别是骨髓移植)以及使用皮质激素治疗的病人中10。
曲霉菌几乎不能从血培养基中分离出来,诊断通常建立在非特异性诊断或放射影像学检查结果上(临床症状,CT扫描,胸部X-光检查,等)。
目前,血清中可溶性曲霉菌半乳甘露聚糖抗原检测,已成为可用于侵袭性曲霉菌感染诊断的血清学方法9,12,24,53,61。
另外,对于接受器官移植的患者,肺泡灌洗液中曲霉菌半乳甘露聚糖抗原的检测已经被证实是一种有利的诊断侵袭性曲霉菌感染的方法。
4-操作原理44
PLATELIATM曲霉菌抗原检测试剂盒实验是一步法免疫酶夹心微板分析,用于检测人类血清和肺泡灌洗液中的半乳甘露聚糖。
实验采用的鼠EBA-2单克隆抗体,直接检测曲霉菌半
乳甘露聚糖,这在先前的研究26,45中已经对其特征进行过描述。
该单克隆抗体用于
(1)包被微板小孔并结合抗原,且
(2)检测结合到已激活微板(结合物试剂:
过氧化物酶连接的单克隆抗体)上的抗原。
EDTA抗凝的血清样本已经过加热处理,以便分离免疫复合物和沉淀可能干扰实验的血清蛋白质12。
处理过的血清样本和结合物加入到已经包被过单克隆抗体的微板小孔里,孵育。
在存在半乳甘露聚糖抗原的条件下,形成单克隆抗体-半乳甘露聚糖-
单克隆抗体/过氧化物酶复合物。
冲洗微板上反应条的小孔,去除所有没有结合的物质。
接下来,加入基质液,基质液将和结合到小孔上的免疫复合物反应,呈现出蓝色。
加入酸溶液后,终止酶反应,加入的酸溶液使蓝色变成黄色。
用设置在450nm和620/630nm波长的分光光度计测定样本和对照的吸光度
(光密度)。
5-试剂
PLATELIATM曲霉菌抗原检测试剂盒:
产品号62794(96人份)
试剂盒储存于2-8℃。
使用前,把所有试剂置于室温(18-25℃)。
使用后,所有试剂立即返回到2-8℃储存。
未使用的微孔条重新装入袋中并密封。
不要去除干燥剂。
稀释后,洗液在
2-30℃条件下可保存14天,其他试剂应在8周内用完。
96人份试剂盒,在最大9批次的实验中,提供的试剂足够完成96人份检测。
组成
组分
数量
R1微孔板
微孔板:
-96孔(12根反应条,每条8孔)用抗-半乳甘露聚糖单克隆抗体包被
-反应条面上标记有“85”
1板/
12×8孔
R2浓缩清洗液(20
倍)
浓缩清洗液(20倍):
-TrisNacl缓冲液(pH7.4)
-2%Tween20液
-防腐剂:
<1.5%ProClin300液
1×70ml
R3阴性对照血清
阴性对照血清:
-人阴性血清
-抗-HIV-1抗体,抗-HIV-2抗体,抗-HCV抗体和HBsAg阴性
-防腐剂:
<1.5%ProClin300液
2×1.7ml
R4Cut-off
控制血清
Cut-off控制血清:
-人血清含半乳甘露聚糖
-抗-HIV-1抗体,抗-HIV-2抗体,抗-HCV抗体和HBsAg阴性
-防腐剂:
<1.5%ProClin300液
2×1.7ml
R5阳性对照血清
阳性对照血清:
-人血清含半乳甘露聚糖
-抗-HIV-1抗体,抗-HIV-2抗体,抗-HCV抗体和HBsAg阴性
-防腐剂:
<1.5%ProClin300液
2×1.7ml
R6结合物
结合物(备用):
-已标记抗-半乳甘露聚糖单克隆抗体/过氧化物酶
-防腐剂:
<1.5%ProClin300液
1×8ml
R7样本处理液
样本处理液(备用)
-EDTA酸溶液
1×13ml
R9色原:
TMB溶液
色原TMB溶液(备用)
-3,3’,5,5’-四甲基联苯胺*(<0.1%)
-过氧化氢(<0.1%)
1×28mL
R10终止液
终止液(备用)
-1N硫酸(H2SO4)
1×28mL
微板密封纸
-微板用粘贴纸
1×8张
*注释:
TMB(四甲基联苯胺)是用于过氧化物酶的非致癌和非诱导突变色原。
6-对用户的警示
1.仅用于体外诊断。
2.仅供专业使用。
3.试剂盒不建议使用人血清和肺泡灌洗液以外的样本。
4.阳性对照,Cut-off对照和阴性对照是用人血清制备,人血清经过检测,和HBsAg,HIV-1抗体,HIV-2抗体和HCV抗体不反应且有CE标记。
尽管如此,所有试剂应被看作具有传播感染能力来处理。
所有实验的操作应按照血液携带病原体OSHA标准和生物安全水平2或其它适用的生物安全操作标准进行。
5.穿戴保护性工作服,包括实验室用工作外套,眼睛/面部保护装置和一次性手套(建议采用合成的非乳胶手套)并按照好实验室操作规程的要求处理试剂盒试剂和病人样本。
做完实验后,要彻底洗手。
6.不要用嘴吸样。
7.不要在标本处理区或试剂盒试剂处理区内吸烟,吃喝。
8.避免样本或溶液溅落。
9.溅落的不含酸溶液的生物样本应该用有效的消毒剂彻底擦净。
能够使用的消毒剂(不限于此)包括10%漂白剂溶液(0.5%次氯酸钠溶液),70%乙醇,或者0.5%WescodynePlusTM。
用于揩擦溅落液的材料应按照具有生物危害的废物处理。
警告:
不要把含有漂白剂的溶液置于高压消毒锅内。
10.含有酸溶液的溅落液应被合适地吸收(擦净)或被碳酸氢钠中和,并且被污染区要清洗,擦净,干燥;如果溅落物污染区含有生物危害物质,请用其中之一的化学消毒剂揩擦污染区。
11.处理所有用于完成实验的样本和材料,就好像它们含有感染性物质一样来处置。
实验室产生的化学废品和生物危害废物必须按照当地主管部门规定,地方政府和国家相关条例来处置。
12.警告:
下面是部分试剂盒组分中含有的潜在化学危害物品列表(参看第5章-试剂):
根据欧盟和美国的法规的要求,含有ProClin™300<1.5%的部分试剂:
R43:
可能引起皮肤接触过敏
R23-24-37-60:
勿吸入蒸汽或飞沫。
避免接触到皮肤。
应配戴手套。
该物质及其容器必须按有害废物处理。
根据美国法规的要求,1.0N硫酸终止液对皮肤和眼睛具有强烈的刺激性和腐蚀性,可引起严重的眼睛损伤,包括视力的永久损害或失明。
假如接触到眼睛,立
即用大量的水冲洗,并立即寻求就医。
该组分应远离强碱和还原性试剂,禁止将
水加入到该组分中。
因这些用品产生的废物被认为是具有危害的酸废物,尽管当地主管部门,地方法规和国家条例允许,如果受过培训且配备了相关设备,这些废物亦应被中和到PH6-8作无害化处理。
13.材料安全数据表(MSDS)需要请求,才可得到。
7-对用户的预先警告
1.冰冻储存血清样本于未知条件下,可以造成由于遭受真菌和/或细菌污染引起的假阳性。
2.不要使用在标明过期日期后的试剂盒或过期日期后的任何试剂盒内的试剂。
3.不要把不同批号试剂盒内的试剂混合使用,浓缩清洗液(R2,标识*:
20倍,绿色),色原(标识*:
TMB,青绿色),终止液(R10,标识*:
1N,红色)除外。
注意:
浓缩清洗液(R2,标识*:
20倍,绿色)不能与伯乐试剂盒中的浓缩清洗液(R2,标识*:
10倍,蓝色)混用。
*在瓶标签上
4.试剂使用之前,把需要用到的所有试剂置于室温下至少30分钟。
5.稀释试剂时要彻底混匀,小心操作,避免微生物污染。
6.不要在反应性气体(酸,碱,乙醛)或灰尘中做实验,这些物质可影响结合物的酶活性。
7.对于对照液和样本的手工加样,请使用配套的吸头,以防止样本的残留。
8.为了保证小孔的充分冲洗,请遵守建议的冲洗循环次数并确保所有小孔被完全注入清洗液,然后被彻底倒空。
冲洗小孔不应该用挤压式瓶子手工进行冲洗。
9.不允许微板在冲洗循环结束和加入试剂之间进行干燥。
10.结合物和底物溶液不可使用同一容器。
11.不允许结合物或色原TMB溶液流入并接触金属或含金属离子容器。
12.避免将色原TMB溶液在储存过程中或孵育过程中暴露于强光照射下。
不允许色原溶液接触氧化试剂。
13.避免终止液接触任何氧化试剂。
不允许终止液接触金属或金属离子。
14.使用洁净的,无尘实验用品(试管,吸头,容器等),使得来自环境的曲霉菌污染可能性减低到最低。
因为半乳甘露聚糖是热稳定性物质,使用的材料消毒不保证不存在污染的抗原。
无热原质最佳,但是可以使用采取足够预防措施的标准材料。
15.禁止下列溶液(血清,肺泡灌洗液,样本处理液,结合物)或开口容器(微板,试管,
加样枪)暴露在空气中。
16.不要把任何未用的结合物倒回原容器内。
17.色原TMB溶液反应液必须是无色的。
稀释后出现蓝色,表示试剂被污染,不宜继续使用。
废弃该反应液并准备新鲜的试剂。
8-试剂准备和储存微孔板(R1)
一个包装内包括12个微孔条。
在封条的下方剪开包装袋。
打开包装袋取出微孔板。
将未使用的微孔条放回原包装内。
仔细密封原包装袋,储存在2-8℃,可稳定8个星期。
请检查干燥剂是否还存在。
工作清洗液(R2)
根据需要,通过加入1份浓缩清洗液到19份去离子水中,准备工作清洗液。
工作清洗液在
2-30℃,可以储存14天。
准备足够量的工作清洗液完成实验运行(一根微孔条需要
80mL:
4mLR2+76mL蒸馏水)。
开启后,浓缩清洗液储存于2-30℃,在未受污染的情况下,可以稳定到标签上标明的过期日期。
阴性对照血清(R3),Cut-off对照血清(R4)和阳性对照血清(R5)对照必须与病人标本一样用EDTA酸溶液(R7)处理并且加热,这是对预处理过程的质量控制。
开启后,保存在2-8℃条件下未被污染的情况下,可稳定8个星期。
结合物(R6),样本处理液(R7),色原:
TMB溶液(R9)
为备用溶液。
开启后,保存在2-8℃条件下未被污染的情况下,可稳定8个星期。
终止液(R10)
为备用溶液。
开启后,保存在2-8℃条件下未被污染的情况下可一直稳定到标签上标示的日期。
9-标本收集血清和肺泡灌洗液可应用于本试验。
I.血清
按照标准实验室操作程序收集血液样本。
血清样本必须未受到真菌孢子和/或细菌污染。
用
密封试管运送和储存样本,不能暴露在空气中。
未开启的样本在实验前,储存于2-8℃可以稳定达5天。
首次启封后,实验前储存于2-8℃可以稳定48小时。
如果要求作更长时间的储存,请将血清储存于-70℃。
血清样本可以经受最多4次冻存/融解循环.预先冻存的样本在实验前,融解后应彻底混匀。
样本含有以下物质的量不影响检测结果:
样本含有20mg/L胆红素,脂血样本含有相当于2g/L
甘油三油酸酯(甘油三酯)或溶血样本含有165mg/L的血红蛋白。
关于过量白蛋白造成的干扰,目前还没有经过检测。
不要试图破坏血清成份的完整性。
II.肺泡灌洗液按照标准实验室操作程序收集肺泡灌洗液。
肺泡灌洗液必须使用无菌盐水收集,如果澄清的话可直接用作试验,否则的话需离心(10000转10分钟)取上清进行试验,试验前按照章节10进行预处理。
肺泡灌洗液必须未受到真菌孢子和/或细菌污染。
用密封试管运送和储存样本,不能暴露在空气中。
首次启封后,实验前储存于2-8℃可以稳定24小时。
如果要求作更长时间的储存,请将肺泡灌洗液冷冻储存(-20℃或更低),可储存5个月。
血清样本可以经受最多4次冻存/融解循环.预先冻存的样本在实验前,融解后应彻底混匀。
10-操作步骤提供的材料看试剂章节
没有提供,但是需要具备的材料
1.浓缩清洗液稀释时需要用到的蒸馏水或去离子水
2吸水纸
3.一次性手套
4.护目镜
5.次氯酸钠(漂白剂)或碳酸氢钠
6.可校正或固定移液器(加样枪或多档加样枪,可吸入和加样50ul,100ul,300ul和1000ul)
7.带有密封塞子的1.5ml聚丙烯微量离心试管,可支持加热到120℃(在加热块中)或100℃
(沸腾水育)
●螺纹帽和试管:
-1.5mL圆锥型底部试管,Bio-Rad分类号224-0100或具有相同功能的试管或者
●带有按盖的试管:
EZ微量实验试管,1.5mL,Bio-Rad分类号223-9480或具有相同功能的
试管
●微量试管盖子锁(美国本土:
FischerScientific分类号NC9346739或具有相同功能的试管,美国本土外:
VWR分类号6054001或具有相同功能的试管)。
这些试管盖子锁能够安
全密封试管,以防在温度和压力变化时,试管盖子被打开,还可以使得试管从加热块或沸腾
水育中被轻易取出。
8.实验室台式离心机1.5mL聚丙烯试管能获得10,000g的离心加速度(美国本土:
Brinkman
分类号22-36-280-1或VWRScientific分类号20901-051或等效产品)
9.如果血清或肺泡灌洗液处理要求使用加热块
●加热块。
建议使用以下型号的加热块:
-单一加热块型号:
在美国本土:
Grant分类号QBD-1L-在美国本土外:
Grant分类号QBD1
配备VWR分类460-0074以下型号)
-两个加热块型号:
在美国本土:
Grant分类号QBD-2L-在美国本土外:
Grant分类号QBD2
配备VWR分类460-0076以下型号)
●用于加热块的模块:
两种加热块(QBD-1L,QBD1和QBD-2L,QBD2)必须使用Grant加热块,分类号QB-E1,美国本土外配备VWR分类号460-8517以下型号配备。
如果血清处理使用沸腾水育处理:
●1L烧杯用的圆形,漂浮微量离心架(在美国本土:
VWRScientific分类号60986-100或
Nalgene分类号5974-1015或等效产品)
●沸腾水育温度在100℃
10.漩涡式振动搅拌机
11.微板孵育温度范围37±1℃
12.半自动或全自动微板洗板机
13.备有450nm和620/630nm滤光片的微板读数仪。
操作步骤评论
阴性对照,阳性对照和Cut-off对照在每次实验中必须检测,以验证实验结果的有效性。
血清和肺泡灌洗液的处理
所有对照血清:
阴性对照(R3),Cut-off(R4)对照和阳性对照(R5)必须和血清/肺泡灌洗液样本在同一时间里处理:
1.吸取300uL每份受检测血清和300uL对照液分别到1.5mL聚丙烯试管
2.每个试管内加入100uL血清处理溶液(R7)。
3.通过大力混匀或漩涡式搅拌彻底混匀试管。
加热过程中,紧密盖严试管,以防盖子打开。
4.加热块选项:
在加热块内,120℃加热试管6分钟。
当且仅当达到规定的温度(*)时,试管才能放进加热块内。
或者水育选项:
如果采用沸腾水育:
在100℃,加热试管3分钟。
当且仅当达到规定的温度(*)时,试管
才能放进加热块内。
5.从加热块或沸腾水育中小心取出热的试管,放进离心机。
将试管在10,000g下离心10分钟。
取上清液用于检测半乳甘露聚糖抗原
6.按照下面步骤检测上清液。
准备完成后,可以取出上清液,在实验之前,在2-8℃可以储存48小时保持稳定。
如果结果分析表示要求重新检测,必须处理另一等份的血清用来检测。
(*)实验成功的关键在于严格遵守规定的温度和规定的轮转时间,这和建议采用的材料
同等重要。
不要根据设备显示的温度,请用校正过的温度计检查温度是否符合规定,该温度计放进含
有矿物油的试管里:
试管内温度必须达到120℃,而沸腾水育时,试管内温度必须达到
100℃。
EIA操作步骤严格按照推荐的协议执行。
按照好的实验室操作规程进行。
1.在使用前,把试剂放置室温(18-25℃)至少30分钟。
2.准备工作清洗液,基质-色原反应液,阴性对照,阳性对照和Cut-off对照液
3.准备一份可以识别微板上受检测血清和对照液的图表。
用其中一孔作为阴性对照血清使用(R3),两孔作为Cut-off对照血清(R4),一孔用于阳性对照血清(R5)。
R5
S5
S13
R4
S6
R4
S7
R3
S8
S1
S9
S2
S10
S3
S11
S4
S12
123456789101112
ABCDEFG
H
4.从微板袋中取出微板座和微孔条(R1)。
将不准备使用的所有反应条返回袋中,连同干燥剂一起,封入袋中。
5.使用前,颠倒结合物小瓶(R6),混匀其中的试剂。
每个小孔加入50uL结合物(R6)。
接下来,按照上面的规定,加入50uL处理过的血清上清液到每个小孔。
在加入结合物前,不要加入血清样本到小孔中。
6.用微板密封胶纸覆盖微板,或者采用其他方式防止蒸发,确保全部表面已被覆盖,并且不漏水。
7.在干燥的微板孵育器内孵育微板,37℃(±1℃)孵育90±5分钟。
8.去除微板密封胶纸。
吸干所有小孔内的液体到废液桶里(桶内含次氯酸钠)。
用至少
800uL的工作清洗液,冲洗微板5次。
最后一次清洗结束后,反扣微板,轻轻在吸水纸上拍打以除去小孔内残留的液体。
9.快速加入200uL色原TMB溶液(R9)到每个小孔,避免暴露在明亮的光线下。
10.在室温下(+18-25℃),黑暗处孵育微板30±5分钟。
在此步孵育步骤中,不要使用粘帖胶纸。
11.每个小孔内加入100uL终止液(R10),与加入色原TMB溶液采用同样的顺序。
充
分混匀。
12.彻底擦净每个微板的底部。
13.在450nm处,读出每个小孔的光密度(参考滤光片620/630nm)。
加入终止液后,微板必须在30分钟内完成读数。
11-质量控制(有效标准)
Cut-off对照液:
每个Cut-off对照液血清的光密度必须≥0.300且≤0.0800
阳性对照:
阳性对照血清指数必须大于1.50
阳性对照光密度(R5)
I=
Cut-off对照光密度均值
>1.50
阴性对照:
阴性对照血清指数必须小于0.40
阴性对照光密度(R3)
I=
Cut-off对照光密度均值
<0.40
符合上述有效标准的对照液的任何失败将使得分析无效,病人标本的结果不能报告。
重新审阅操作步骤后,操作者可能决定重做分析,或者可能咨询生产商,寻求帮助。
如果重做分析,在重做分析中应使用新的一等份同一样本。
计算举例:
样本
吸光度(光密度)
阴性对照(R3)光密度
0.116
Cut-off对照液(R4)光密度
0.513
0.533
阳性对照(R5)光密度
1.834
计算
Cut-off对照均值
为了计算Cut-off对照液(R4)光密度的均值,将两个Cut-off对照液平行测定的光密度值相加,结果除以2:
阴性对照指数
(0.513+0.533)÷2=0.523
为了计算阴性对照对照指数,将阴性对照的光密度值除以Cut-off对照液的光密度均值:
0.116
I=
0.523
=0.22
阳性对照指数
为了计算阳性对照对照指数,将阳性对照的光密度值除以Cut-off对照液的光密度值均值:
1.834
有效性在上述的例子中:
I=
0.523
=3.51
●每个Cut-off对照光密度值≥0.300且≤0.800,表示Cut-off对照液有效。
●阴性对照指数<0.40,表示阴性对照有效。
●阳性对照指数>1.50,表示阳性对照有效因为实验结果符合每个对照的有效标准,在该例子中的实验运行被认为是有效的。
12-结果的解释在受检样本中是否存在或缺失半乳甘露聚糖抗原,可通过每个病人样本的指数计算来断定。
指数(I)是样本的光密度值除以含Cut-off对照血清的小孔光密度值均值得到的。
Cut-off对照光密度均值的计算
合并含Cut-off对照血清(R4)两个小孔的光密度,总和除以2。
每个受检血清指数(I)的计算:
为每个受检血清计算下面的比率:
样本光密度
I=
指数<0.50的血清的解释:
Cut-off对照光密度均值
指数<0.50的血清被认为是半乳甘露聚糖抗原阴性注释:
阴性结果表示病人的结果低于实验的可检测水平。
阴性结果不排除侵袭性曲霉菌感染的诊断。
如果结果是阴性的,而怀疑感染了疾病,建议
重做检测。
指数≥0.50的血清的解释:
指数≥0.50的血清被认为是半乳甘露聚糖抗原阳性对于所有阳性病人,建议随后的检测,从同一样本中取新的一等份重做检测,如同从病人采集新样本一样。
注释:
吸光度低于0.000,可以表示实验步骤或设备出错,应当对错误进行评估。
实验结
果无效并且标本需要重做。
高风险病人的常规筛选(每周两次)建议增加实验的灵敏度和早期的阳性率。
注释:
PLATELIATM曲霉菌抗原检测试剂盒实验用于帮助侵袭性曲霉菌感染的诊断。
从PLATELIATM曲霉菌抗原检测试剂盒实验获得的阳性结果应联合其他诊断步骤如微生物培养,活组织切片的病理分析以及放射影像学检查结果一起来参考。
计算举例:
样本
吸光度(光密度)
阴性对照(R3)光密度
0.116
Cut-off对照液(R4)光密度
0
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- PLATELIATM 曲霉 抗原 检测 试剂盒