分光光度计使用注意事项剖析.docx
- 文档编号:25153723
- 上传时间:2023-06-05
- 格式:DOCX
- 页数:25
- 大小:190.24KB
分光光度计使用注意事项剖析.docx
《分光光度计使用注意事项剖析.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《分光光度计使用注意事项剖析.docx(25页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
分光光度计使用注意事项剖析
分光光度计使用注意事项剖析
分光光度计的使用
一.使用及维护
1.安装环境
1.1温度要求:
装在不受阳光直接曝晒的房间;最好装空调,使室温维持在(20±2℃);仪器附近不应有高温的暖气管或其它电热器具;仪器后面板与墙之间应留一定空间。
1.2湿度要求:
水蒸气在(1350~1450)nm和(1800~1950)nm两个波长区域内有光吸收,会严重干扰测定。
潮湿会导致分光器反射膜层斑剥、脱落等。
故相对湿度最好保持在(40~75)%。
高档紫外-可见-近红外分光光度计要用高纯氮气冲洗。
干燥筒内的变色硅胶应及时更换。
1.3防震、防尘、防腐和防电磁干扰:
2.光源灯
2.1拿灯时不要碰窗口,以免手上的油污经紫外照射后,形成结痕难以去掉.倘若不小心而碰触,应及时用无水乙醇抹擦干净。
2.2灯有寿命,要节约使用.但工作间歇时间短,不要关灯和停机.
2.3在灯虽然能点亮,但不稳定或强度大大减弱而影响测量时,就应更换新灯.
2.4应待灯冷却后,再重新启动.启动后预热15-30min才能读数.
2.5不要用眼睛直视灯,因为紫外辐射会损伤人的眼睛。
3.单色器
3.1单色器是仪器的心脏部分.不要轻易装、拆,也不要去摸触镜面.
3.2平时要保持内部干燥,及时更换干燥剂,以防止色散元件和反射镜受潮而发霉,测定挥发样品必须使用密封吸收池,以免样品蒸气进入单色器,腐蚀反射镜、透镜及色散元件的镜面.
3.3如果选定波长和狭缝宽度是用旋钮,则要按说明书规定的方向转动到欲测的位置,切勿来回转动,以防回衡误差.
4.样品室
4.1样品室是存放吸收池的地方,防止样品的交叉污染,决不可将样品留在样品室中过夜.
4.2吸收池的光学面一定要维护好,不能用刷子刷.否则光学面发毛会增加散射而影响测定准确度.保护吸收池最重要的一条是使用后及时清洗,否则留下液痕,日后再洗,事倍功半.用完的吸收池可放在中性肥皂水中(将十二烷基硫酸钠用蒸馏水配制成透明的稀溶液),或放在8mol/l盐酸加45%乙醇的等量混合液中浸泡,然后用自来水冲洗,再用蒸馏水洗净,放在无灰尘的地方凉干备用.如果急于使用,可在真空中抽干.但不要用热吹风吹干。
4.3对于盛过蛋白质和核酸的样品池最好不要用市售的烷基磺化型的清洗剂,因为它们有类似蛋白质的吸收光谱,清洗不慎会引入误差,所以此时最好使用非离子型清洗剂(如triton)浸泡.如果吸收池实在太脏,质量好的吸收池可放在洗液中稍加处理,但要随即取出冲洗,不宜浸泡过长的时间。
洗液必须冲洗干净,因为它也有类似蛋白质和核酸的吸收光谱。
4.4为了精确的定量测定,吸收池应事先进行校正.校正的办法是在池中加入欲测浓度的溶液,读出各吸收池的吸光度.以一个池为标准读出其他各池的吸光度.然后在读取样品吸光度后,再予校正.市售常规光径(10mm)的吸收池一般匹配到0.Olmm.为了某种工作的需要(如差示光谱测定)必须寻找匹配池时,可在池中装入高吸收的样品,读数后加以挑选。
一台仪器上的比色皿不得与其它仪器上的比色皿单个调换。
比色皿每次用完后应立即用蒸馏水洗净,用软布或擦镜纸擦干,放于比色皿盒内。
5.倾注溶液时要小心,不要弄湿外壁.如不慎弄湿,可用滤纸轻轻吸干后,再用绸布或擦镜纸擦净(最好用白绸,擦镜纸常有纸毛)。
6.检测器:
检测器室要保持干燥,以保证绝缘良好.在使用光电倍增管时,最重要的一点是通电后避免不必要的曝光。
在仪器的光电倍增管的前面(通常在样品室的上方)常有暗闸(微动开关),这是光电倍增管的保护装置,用来保护其在开启样品室盖时,不受日光照射.否则通电后的光电倍增管,受强光照射,会造成永久性的损坏,或至少因“疲劳"而降低灵敏度。
7.硫化铅光电池忌受紫外线照射,否则会降低其灵敏度。
8.仪器用完后应用罩布盖好,以防落入灰尘。
9.仪器应每半年左右或搬动后应检查波长精度等,以确保仪器性能正常。
二.分光光度计的性能检查
1.波长范围
指分光光度计上限波长和下限波长之间的工作范围,在这个范围内的所有波长应具有足够的能量进行工作.这种检测波长极限是与光源、单色器及检测器的光谱响应特性有关的.如波长范围为190-900nm的紫外-可见分光光度计必须具备氘灯和碘钨灯两个光源,而只有碘钨灯的分光光度计的工作范围,在短波侧不能低于340nm.有时在说明书规定的工作波长范围的两端由于缺乏足够的能量,不能正常工作.如在两端表现为100%T或A设定困难,或基线在两端不平直等,就需要检查可能发生的原因,如光源位置需要调整、光源需要更换、样品室窗口有溶液污染、光路需要调试、检测器疲劳等等。
2.波长准确度
波长准确度(有时被误称为波长精度)是指仪器波长指示器上所指示的波长值与仪器给出的实际波长值之间的符合程度,可用二者之差(即波长误差)来衡量其准确性.如某分光光度计的波长准确度为±1.Onm,那么测定253.65nm汞灯辉线的最大能量应落在252.65nm和254.65nm之间.
波长准确度对分光光度测定是有很大影响的,因为任何分光光度定量分析工作都是依靠在一定波长下测量吸光度值(此波长大都选在样品的吸收峰位)来完成的.如波长有误差,则由于峰两旁陡坡处吸光度值随波长的变化极为迅速,会造成明显的吸光度误差.如在定性分析时单纯依靠样品的吸收峰来确定波长,可能会造成错误的判断.在有机物质的结构分析中,需要研究吸收峰波长位置与物质结构的关系.如仪器的波长误差
最小波长间隔,在不同波长范围使用的材料及方法皆不同.造成分辨率下降的原因可能有如下-些。
测定条件选择不当(狭缝宽度太宽、记录速度太快、响应速度太慢等)、光学系统失调(光源、反射镜、检测器移位)、电子系统故障等等.发现仪器分辨率下降应仔细检查,进行调整.如调整单色器,一定要请专业人员,千万不可随意乱动.
7.光度准确度
光度准确度是指仪器在吸收峰值上读出的透光度(或吸光度)与已知真实透光度之间的偏差.该偏差越小,说明光度准确度越好.
要测得正确可靠的数据取决于以下几方面
(1)样品来源,
(2)制样技术,(3)仪器的性能和操作条件的选择,(4)吸收池的质量.由此可见,光度误差是一个综合性的误差.决定仪器读数准确性的因素主要有如下几个方面:
(1)显示系统的性能,
(2)放大器的稳定性和线性,(3)检测器的线性及噪声.
检定光度准确性,必须有一定的标准样品,现已有许多测试方法和参比标准供参比,一类是标准溶液法,另-类是滤光片法.
7.1标准溶液法
(1)硫酸铜溶液
溶液制备:
硫酸铜(CuSO4·5H20含量99.7%)20.000g
硫酸(比重1.835)10.0ml
用蒸馏水稀释到1000m1
测量温度25℃
吸收池光径10.00mm
650、700、750nm时的吸光度分别为0.224、0.527、0.817A
(2)硫酸钴铵溶液
溶液制备:
硫酸钴铵(COS04·(NH4)2SO4.6H2O)(钴(加镍)的含量为100%,镍和钴的比为l:
200)14.481g
硫酸(比重1.835)10.0ml
用蒸馏水稀释到1000ml
测量温度25℃
吸收池光径10.00mm
510nm处有最大吸收,吸光度为0.1742A
(3)铬酸钾溶液
溶液制备:
氢氧化钾溶液:
3.3gKOH(85%KOH)溶解后,用蒸馏水稀释到1000ml
O.0400g/1铬酸钾(K2Cr04)溶在0.05mol/1氢氧化钾溶液中
275nm吸光度为0.7620,370nm吸光度为0.9914,
7.2滤光片法
用标准滤光片来检查光度标尺的正确性,颇为方便.滤光片又可分为有色玻璃和中性玻璃(又称灰色玻璃)两种,中性滤光片由于在不同波长处的吸光度相对恒定,因而对仪器的波长设定、狭缝宽度、杂散光等要求不严,比有色玻璃优越,且有较好的重复性.使用滤光片作标准时,要严格清洁滤光片,避免手指印、灰尘、硬物擦碰.随着玻璃表面空气接触或清洗时摩擦等影响,透光度会逐渐发生变化.因此,在精确的标定工作中,还必须对这些标准滤光片的透光度作经常性的光度标定(通常为半年-次).
造成仪器光度准确度下降的主要原因往往是电子系统由于光源供电电源不稳定,引起光源发光特性的变化;光检测器工作电压波动,使光电信号变化,放大器工作点漂移或信噪比下降等因素.
8.光度线性
优质的光度线性是用这个分光光度计测量时,对遵守比尔定律的溶液能给出一个吸光度对浓度(A对c)的线性曲线.这个参数对定量测定是非常重要的.检查光度线性可用溶液稀释法、吸收池光径法、中性滤光片叠加法.
8.1溶液稀释法
重铬酸钾的吸收峰在350nm和257nm.称重铬酸钾0.200g,用0.005mol/1硫酸溶解,在1000ml容量瓶中稀释至刻度.这个溶液的读数大约为3.(重铬酸钾的线性范围约为0-3A).用此溶液作为母液,然后进一步稀释.样品配制后,立即读数,因为重铬酸钾遇光容易光解,所以最好使用棕色容量瓶.
8.2吸收池光径法
使用不同光径的吸收池测定同一浓度的溶液来检查光度线性,可以避免稀释时容量误差.但吸收池的光径必须事先用长度计量方法精确测定
8.3中性滤光片叠加法
现在有很多生产厂用这种方法检查光度线性.测试方法是将三块中性滤光片分别叠加后,比较测定值与计算值之差,具体方法如下.
先测出单片滤光片的吸光度A1、A2、A3.再分别把滤光片叠加起来,测定叠加后的吸光度(A1+A2)、(A1+A3)、……等.
当A1+A2=(A1+A2)、Al+A3=(A1+A3)时,说明光度系统在这个测量点上是线性的.
当Al+A2≠(A1+A2)时,则光度系统在这个测量点上是非线性的.线性偏差ε=A1+A2-(A1+A2)
用这种方法找出各个位置的线性偏差ε,通过ε对测定结果进行修正:
为了避免滤光片多次反射的影响,必须把滤光片倾斜放置,倾斜角度要足够大,-般为±100,以保证其反射光不进入检测器.
除了上述三种方法外,还可采用光叠加法和旋转扇形板法等,影响光度线性的原因与光度准确性下降的原因是相似的。
9.光度重复性
光度重复性是在相同的仪器上,相同条件下,对同一样品进行多次重复测定吸光度(或透光度).计算每次读数对平均值的偏差和这些偏差的平均值.
影响光度重复性的原因同样与影响光度准确度和线性的原因相似.在样品吸收增加时,由于比较低的信号水平时,仪器噪音增加,光度重复性可能不佳.
10.噪音
噪音(100%线噪音和0%线噪音)是信号随时间而无规则的变化(由外线电压突然变化引起的记录笔或表头的突然变化所形成的噪音是无常的)
噪音测量的方法是在仪器预热稳定后,在一定波长和一定缝宽下,扫描100%线和0A线数分钟,并量取峰-峰之间的值作为绝对噪音水平.但在实际应用中,常用信噪比来描述仪器的性能.例如:
在100%时如噪音是1%,则信噪比是100:
1.如果电子系统质量良好,噪音主要取决于检测器.但如果电子系统设计不良、元件质量低劣、仪器接地不良、光源不稳、工作环境潮湿、外界电磁干扰严重等,也会使噪音增大,应设法排除.
由于噪音对光度准确度的影响比较大,-般分光光度计都设有响应时间选择钮,可以根据具体测定情况选用适当的测定系统响应时间.增加响应时间可以改善信噪比.
11.基线稳定性
基线稳定性是指双光束分光光度计在扫描100%线或0A线时(样品室中不放任何东西),读数偏离的程度.如果基线稳定性不好,当然会影响光度准确度.引起基线不稳定的原因与引起噪音的原因相似.
12基线平直性
基线平直性是指双光束分光光度计扫描基线(100%线或oA线,空气对空气)时,基线倾斜弯曲的程度,它是仪器的重要性能指标之一.
基线平直性不良通常说明光路不平衡、光学元件位置不准确或反射镜质量下降,电子和机械系统不良也会影响基线的平直性.基线的平直性还可用来考察噪音和光源或色散元件切换时的谱线衔接情况等.基线平直性不良会对各个吸收峰之间的比值产生影响,给物质结构的定性分析带来困难.过去用多点电位器来补偿光束不平衡,使基线平直.现在则用微处理机来补偿,效果大大改善.采用单光束分光光度计加计算机的方法来扫描基线就不存在光束不平衡的问题了.
双光束分光光度计使用日久或搬动、受震后,其基线会弯曲.引起基线不平直的原因主要是光学系统失调,两个光束不能很好平衡.有时电子系统工作失调也会使基线弯曲或倾斜.
基线不平直应首先检查光源部分是否移位松动.若肯定光源部分无故障后,可用白纸片在入射狭缝前检查光斑.如有散焦、偏位、切割、不对称等情况,应请专业人员检查和调整光学系统.
注意事项
1.空白溶液与供试品溶液必须澄清,不得有浑浊。
如有浑浊,应预先过滤,并弃去初滤液。
2.测定时,除另有规定外,应以配制供试品溶液的同瓶溶剂为空白对照,采用1cm的石英吸收池。
3.在规定的吸收峰波长±2nm以内测试几个点的吸收度,以核对供试品的吸收峰波长位置是否正确,除另有规定外,吸收峰波长应在该品种项下规定的波长±2nm以内;否则应考虑该试样的真伪、纯度以及仪器波长的准确度,并以吸收度最大的波长作为测定波长。
4.一般供试品溶液的吸收度读数,以在0.3~0.7之间的误差较小。
5.吸收池应选择配对,否则要引入测定误差。
在规定波长下两个吸收池的透光率相差小于0.5%的吸收池作配对,在必要的情况时,须在最终测量扣除吸收池间的误差修正值。
6.由于吸收池和溶剂本身可能有空白吸收,因此测定供试品的吸收度后应减去空白读数,再计算含量。
7.仪器的接地必须良好,一切裸露的零件对地电位不得超过24伏(测电笔的氖管不得发亮)。
8.在使用过程中,如需开启试样室盖时或暂时停止测试时,必须及时推入光门钮杆(使光电管前光门关闭),保护光电管,以防止光电管受强光或长时间照射而损坏。
9.在测定时或改测其它检品时,应用待测溶液冲洗吸收池3~4次,用干净绸布或擦镜纸擦净吸收池的透光面至不留斑痕(切忌把透光面磨损)。
10.取吸收池时,应拿毛玻璃两面,切忌用手拿捏透光面,以免粘上油污。
使用完后及时用测定溶剂冲净,再用纯化水冲净,用干净绸布或擦镜纸擦干,晾干后,放入吸收池盒中,防尘保存。
11.若吸收池内外壁沾污,两池差较大的处理。
(1)可用绸布缠在扁竹条外或用脱脂棉缠在细玻璃棒上蘸上乙醇,轻轻摩擦,再用纯化水冲净。
(2)如上述方法处理不好,必要时可用重铬酸钾-硫酸洗液泡洗1~2分钟,用自来水冲净,再用纯化水冲净。
(3)不得用毛刷刷洗或硬物拭擦,以防止表面光洁度受损影响正常使用。
12.请务必注意经常保持硅胶的干燥,目的是保护光学元件和光电放大器系统不致受潮损坏而影响仪器的正常工作,如发现有的硅胶由蓝色变为粉红色,应立即更换。
该仪器干燥剂筒有两个:
一个是装在放大器暗盒上,另一个装在单色光器暗盒上。
13.在更换硅胶干燥剂时,应关闭切断电源。
14.在停止工作期间,主机试样室内应放入袋装或筒装硅胶干燥剂。
用防尘罩罩住整个仪器,并在防尘罩内放数袋防潮硅胶。
15.仪器在操作中,狭缝的宽度应从小逐渐开大。
若狭缝过大,由于进入光电管的光能量强度过大,将会使放大器输出信号达到饱和,以至数字显示出溢出(即数字闪烁或示1不变)。
这不是仪器有故障。
16.将波长旋转放在625nm,铗缝关闭在0.02nm附近,选择按键恢复在停止工作部位(即三个键均弹出)。
17.搬动仪器时应搬在主体端,不要搬在试样室和光电管盒端以及光源灯室部位,以防止仪器狭缝或光路部件受力而发生变形。
并在搬动或运输时,应将可动部分固定,如各旋钮可用胶布贴住,狭缝位置开大些,然后固定,不要关小狭缝,以免运输时振动使狭缝刀口受损坏。
18.仪器的光栅、反射镜绝对不能擦拭,否则将损坏仪器光学表面,增加杂散光。
19.仪器经过搬动请及时检查并纠正波长精度,为保证测定的准确性请经常校准波长精度。
如有异常,应立即报告质量保证部,但不得擅自调整,并及时做好记录。
附紫外、可见、近红外分光光度计检定规程
本规程适用于新制造、使用中和修理后的、波长范围为190~2500nm(或以此为主要光谱区)的紫外、可见、近红外分光光度计的检定。
一概述
紫外、可见、近红外分光光度计(以下简称仪器),是依据物质在紫外、可见、近红外区吸收光谱的特性及朗伯-比尔定律的原理对物质进行定性鉴别和定量分析的仪器。
朗伯-比尔(LambertBeer)定律的数学表达式为
(1)
式中:
A——物质的吸光度;
φ0——入射辐射(光)通量(W);
φtr——透射辐射(光)通最(W);
τ-----物质的透射比;
ε——物质的摩尔吸收系数(L/cm.mol);
b——光路长度(cm或mm);
C——物质的摩尔浓度(mol/L);
本类仪器主要由光源、单色器、样品室、检测器和显示系统等5部分组成.
二检定项目和技术要求
l外观
1.1仪器应具有铭牌,并注明仪器名称、型号、编号、制造厂名及电源电压.
1.2仪器应具有使用说明书.新制造的仪器应具有出厂检验合格证;已检定过的仪器应附有上一次的检定证书.
1.3仪器应能平稳地置于工作台上,各紧固件应无松动,接插件应紧密配合,接触良好。
l.4仪器所有刻字、刻线应均匀、清晰,数字显示不得有缺点、缺画现象。
仪器上各开关、调节器和按键应能正常工作;荧光屏图象应清晰、亮度可调。
1.5样品室应无漏光现象
1.6仪器启动后应无异常的杂音,预热30min后应能正常工作。
2波长准确度与波长重复性
仪器的波长准确度与波长重复性应符合表l的规定.
表1(nm)
仪器级别
波长范围
准确度
重复性
A
紫外-可见
±O.3
0.2
近红外
±1.5
1.O
B
紫外-可见
±O.5
O.3
近红外
±2.O
1.O
C
棱镜式
光栅式
棱镜式
光栅式
350
±O.7
±0.5
0.3
O.3
600
±2.O
±0.5
1.O
0.3
700
±4.8
±O.5
2.5
O.3
lOOO
±8.O
±2.O
4.0
1.O
2500
±lO.0
±2.O
5.O
1.O
3分辨率或最小光谱带宽
3.1分辨率应符合表2的规定.
表2
仪器级别
τ(%)
A
>20
B
>15
C
棱镜式
光栅式
>12
>lO
3.2最小光谱带宽;仪器的最小实际带宽不应大于实际设置带宽的1.2倍。
4杂散辐射率
仪器杂散辐射与主辐射之比例,即杂散辐射率应符合表3的规定。
表3
仪器级别
波长(nm)
杂散辐射率k(%)
A
220
340 <0.0Ol 620 1690 B 220 340 620 1690 C 220 34O 5透射比准确度与透射比重复性 仪器透射比准确度与透射比重复性应符合表4的规定. 仪器级别 准确 重复性 A 士0.5 O.2 B ±0.6 O.3 C ±0.8 O.4 6基线平直度 仪器的基线平直度应符合表5的规定. 表5 仪器级别 波长范围(nm) 吸光度 A 紫外—可见 士0.002 近红外 ±O.003 B 紫外一可见 ±O.003 近红外 ±O.OO5 C 紫外可见 ±O.005 近红外 ±0.008 7漂移 仪器的漂移量应符合表6的规定. 表6 仪器级别 测定波长(nm) 测定时间(min) 漂移量(A) A 500 30 <0.001 B 500 3O C 500 30 8噪声仪器噪声应符合表7的规定. 9绝缘电阻 绝缘电阻不低手20MΩ. 表7 仪器级别 测定波长(nm) 100%线(A) 0%线(%τ) A 230(或340) / 500 <0.001 l000 <0.001 / B 230(或340) / 500 <0.002 <0.03 1000 / C 230(或340) <0.006 / 500 1OOO / 三检定条件 10电源及环境条件 10.1电源: 电压变化不大于220±22V;频率变化不踅过50±1Hz. 10.2室温15~30℃. 10.3环境相对湿度小于85%. 10.4仪器不受阳光直射. 1O.5室内应无强气流及腐蚀性气体. 10.6周围不应有影响检定的强烈振动和强电场、强磁场的干扰. 11主要检定设备及材料 11.1天平(称量200g,分度值O.1mg) 11.2兆欧表(500V) 11.3挡光板(12×12×45mm的不透光矩形块) 11.4衰减片(1/100,10/100). 12标准物质(国家批准颁布相应的标准物质后,应立即采用)及化学试剂 12.1低压汞灯;氧化钬玻璃(厚度2~2.5mm);苯(二级);1,2,4一三氯苯(三级)。 12.2透射比的标称值为10%、20%、30%左右的中性滤光片(标准值的不确定度优于0.2%τ)。 12.3质量分数为0.06000/1000的重铬酸钾紫外分光光度标准溶液(标准值的不确定度优于O.3%τ);紫外可见分光光度标准溶液。 12.4标准石英吸收池(标准物质编号GBW13304)。 12.5碘化钠及亚硝酸钠(二级);亚甲基蓝及二溴甲烷(三级). 四检定方法 13外观 按第1条要求进行,仪器开机预热30min后检定以下各项。 14波长准确度与重复性 14.1用低压汞灯检定.关闭仪器光源,将汞灯放置于入射狭缝处.采用波长扫描(或重复扫描)方式、扫描速度慢(如15nm/min)、响应快、最小带宽(如0.1nm)、置程0~100%(或参照仪器说明书设定条件),在200~2500nm范围内单方向重复扫描3次,由仪器识别记录各峰值(仪器无“峰检测”功能,应对指定波长进行“单峰”扫描.).分别测量出谱图上紫外、可见、近红外三个波段范围的各二条谱线波长(棱镜式仪器应按表l要求进行),与附录l表1比较,按公式 (2)计算波长准确度△λ: △λ= -λr (2) 式中: ——波长测量的平均值;. λr——波长标准值. 按公式(3)计算波长重复性δλ: δλ=λmax-λmin(3) 式中: λmax、λmin——三次测量波长的最大值与最小值。 14.2若仪器不能放置低压汞灯时,采用下述办法分区检定。 14.2.1紫外和可见区 (1)
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 分光 光度计 使用 注意事项 剖析