一种新的大鼠脊髓半离断损伤模型.docx
- 文档编号:25551148
- 上传时间:2023-06-09
- 格式:DOCX
- 页数:7
- 大小:22.46KB
一种新的大鼠脊髓半离断损伤模型.docx
《一种新的大鼠脊髓半离断损伤模型.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《一种新的大鼠脊髓半离断损伤模型.docx(7页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
一种新的大鼠脊髓半离断损伤模型
一种新的大鼠脊髓半离断损伤模型
【摘要】目的:
探讨一种对机体影响较小、复制性良好的大鼠脊髓损伤模型,为后期药物及干细胞干预脊髓损伤后修复提供条件。
方法:
采用改良注射针头连接注射器作为损伤工具,在不打开脊髓腔的前提下沿脊椎棘突左侧垂直插入脊髓,造成大鼠腰髓一侧离断性损伤。
除观察动物的一半行为学改变外,并对脊髓损伤后对大鼠的感觉功能(热痛反应)、运动功能(抓力测试)变化进行定时观测,以确定模型复制成功。
结果:
大鼠麻醉苏醒后即刻出现一侧后肢瘫痪、拖地行走,但无排尿及排便失禁,动物一般状态良好,后期未见合并感染,表明动物模型复制成功。
结论:
用自制的注射器针头造成的脊髓损伤模型操作简便、损伤较小、重复好,并且因与其折射相连,可在造模同时局部给予药物或试剂进行干预,为探索脊髓损伤再生困难的分子机制提供了实验基础。
【关键词】SD大鼠;脊髓损伤;脊髓半离断术
【Abstract】Objective:
Toinvestigatealateralspinalcordinjurymodelwithlesstraumaandbetterreplication.Themodelwouldbeusefullforthestudyofvariousnewmedicinesorstemcelltherapyonspinalcordinjury.Method:
Amodifiedself-madeneedlewasusedtoinsertintolumbarspinalcordofSDratswithoutopeningthecavummedullare,thelateralspinalcordinjurywasestablished.Thegraspingability(movementfunction)andsensoryfunctionbytempratureofhind-limbsweremeasuredandcomparedwithcontralateralsideatdifferenttimepointsafterinjuryforinsurethemodelwassuccessfully.Result:
Itshowedthatlateralspinalcordinjurymodelofratsappearedobviouslateralparalysis,butwithoutincontinenceofurineanddefecation.Alsononeofthemhadinfectionlocallyorsystemically.Themodelwassuccessfully.Conclusion:
Thespinalinjuremodelmadebyself-mademodifiedneedleinsertionintoSDratslumbarspinalcordiseasytohandle,repeat,andinduceobviouslateralparalysiswithoutseverecomplications.Duetoitsadvantageofconnecting,somemedicinesorstemcellscouldbeinjectedconvenientlyatthesametimewhilesurgeryprocessed,thenprovidesanexperimentalbasistoexplorethemolecularmechanismofspinalcordinjuryregenerationdifficulty.
【Keywords】SpragueDawleyrat;Spinalcordinjury;Spinallateralamputation
First-author’saddress:
ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China
doi:
10.3969/j.issn.1674-4985.2015.07.005
脊髓损伤(SpinalCordInjury,SCI)是指由于各种严重创伤直接或间接导致的脊髓损伤[1]。
根据损伤的部位及受累神经不同,其临床表现不完全相同,多数患者出现脊髓损伤相应节段以下的各种运动、感觉和括约肌难以恢复的功能障碍。
通常脊髓损伤的程度和临床表现取决于原发性损伤的部位和性质,大多数患者伴有程度不等的肢体瘫痪,因此SCI是一种致残率很高的临床病症。
由于其本身的解剖结构特征,脊髓损伤后很难再生修复,因此,寻找能够刺激损伤脊髓神经组织再生修复的新药制剂及其探索脊髓损伤难以再生的分子机制是临床及科研领域的重要任务之一。
随着社会各行业的快速发展,脊髓损伤的发病率也随之增加。
因此,对脊髓损伤的研究与关注仍是目前的热点课题[2]。
脊髓损伤的动物模型是进行脊髓损伤与修复研究的必要基础,根据相关文献报道,脊髓损伤的模型有很多种,譬如:
(1)挫伤性SCI(重力堕落性);
(2)切割或吸除型SCI;(3)脊髓压迫性SCI模型;(4)光化学诱导性SCI模型;(5)牵拉性SCI模型等。
然而,目前大多数SCI模型均存在有很多弊端。
因此本实验旨在设计一种新型的大鼠脊髓损伤的模型,使其具有较高的稳定性和可复制性,成为今后探讨某些制剂对脊髓损伤的长期影响的动物模型[3]。
1资料与方法
1.1一般资料选取健康SD大鼠6只,体重180~200g,正常饲料饲养,动物使用及操作按照本校相关规则执行。
1.2实验器械手术刀片、持针钳、蚊氏钳、血管钳、手术镊、组织剪、缝针。
1.3方法
1.3.1SCI模型自制改良1mL注射器针头制备方法模型制作过程需要两个注射器针头,首先将其中一个注射器的针头在石板上磨平并消毒,见图1a;将另一个注射器针头用持针器向着针头斜面背侧弯曲90°,被弯曲的针头长度为0.3cm,见图1b。
1.3.2SCI模型制备
(1)麻醉:
采用无菌1%戊巴比妥钠注射液腹腔注射,0.4mL/100gBW。
(2)大鼠采用俯卧位放置手术平台上,剃去背部毛发,并用碘酊消毒皮肤。
(3)确定T10~T12位置:
SD大鼠腰段脊椎棘突突出且斜向尾端,而胸段棘突则略呈直角状向背侧突出,因此,L1与T13棘突间有一个较大的裂隙,以此来判断T9~T12的位置[4]。
确定好位置后沿脊柱正中线、T9~T12部位切开背部皮肤,约2~3cm,分离脊柱表面的肌肉和筋膜,暴露T9~T12棘突和椎板。
随后,用组织剪和蚊氏钳将T9~T10棘突左侧的肌肉和韧带剥离彻底暴露T9~T10的棘突和横突,确定T9~T10间隙。
(4)将磨平的1mL注射器针头(图1a)从T10和T9间隙、紧靠棘突左侧垂直插入脊髓腔并进入脊髓,同时垂直上下抽插针头,感觉有较大的活动空间,表明针头在脊髓腔内,然后拔出针头。
由于脊髓腔内为负压,椎间隙为软组织,因此进针时不需太用力,针头很容易进入脊髓腔及脊髓。
当针头进入脊髓后,大鼠会剧烈抖动。
随后,将弯曲的针头(图1b)从进针点垂直插入,进针时弯曲的针尖朝向左侧。
待针头进入脊髓腔后一直插入脊髓腔腹侧壁,然后向脊髓左侧小幅摆动针头3~4次,此时应绝对避免弯曲的针头超过棘突中线进入右半侧脊髓,由此只破坏左侧脊髓。
进行此项操作时,左侧(损伤侧)后肢出现抽搐,拔出针头前再进行3~4次垂直抽插,以保证左侧相应断脊髓严重离断性损伤。
最后轻缓地以垂直角度拔出针头,此时脊髓半离断模型建立步骤基本完成,见图2。
(5)手术完毕后缝合肌肉及皮肤,碘酊清洁局部并将大鼠置于干燥,清洁笼内,大鼠清醒后在安静,自然光条件下普通饲料喂养,并定期用碘酊清洁消毒创口。
1.3.3观察内容
(1)动物一般行为观察:
术后1h,动物清醒后单独放置于饲养笼内,容许自由活动,观察大鼠的日常行为活动,如饮水、进食、活动能力、行走姿态和状态以排泄情况等。
(2)感觉、运动功能测定:
于术后24h,1、2、3、4周分别对模型大鼠左侧(损伤侧)及右侧(健侧)后肢的感觉和运动功能进行检测。
感觉功能检测采用热痛敏感仪进行测定,热痛反应时间用秒(s)表示,操作方法:
将大鼠置于底面为玻璃面(可传导热)的方盒内,待其处于安静状态后用发热光源照射大鼠的后足底,这时开始计时,直至其感到热痛后抬足终止计时。
运动功能测定采用啮齿类动物抓力仪,抓力大小用克(g)表示,操作方法:
大鼠抓持时应轻拿轻放,避免将其激怒,左手将大鼠上半身抓住按放在抓力板上,右手拉住鼠尾,抓力板随右手拉鼠尾的力量向前滑行,待动物用力抓住抓力板时应及时加力后拉,使其测到动物的最大抓力。
(3)脊髓一般形态学检查及损伤部位确定:
模型大鼠饲养4周后,采用4%的多聚甲醛灌注固定,沿背部脊柱中线自上而下切开皮肤,减去脊柱周围的筋膜与肌肉,充分暴露脊椎,用蚊氏钳自脊椎尾端逐级打开整个椎板,暴露髓腔和脊髓,观察损伤所在部位及伤势,同时取损伤脊髓段(包括损伤部位头尾各0.5cm)进行冰冻切片及HE染色,观察组织形态变化[5]。
1.4统计学处理实验中采集数据应用SPSS统计学软件进行统计学分析,计量资料采用(x±s)表示,比较采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1一般观察指标及感觉运动功能测定正常大鼠四脚触地,可直立。
清醒后的脊髓半离断术模型大鼠术后3~5d手术切口处红肿,数日后恢复正常。
与正常大鼠进行对比,模型动物左侧后肢瘫痪、拖地行走,且不能直立(图3)。
但大鼠可进行正常日常活动,饮食及排泄均正常,术后并发症少,且存活时间较长,截止实验结束时大鼠一般状态良好,对侧肢体活动正常。
2.2后肢热痛实验模型复制前大鼠两侧后肢热痛实验皆为阳性,脊髓损伤后,不同时间点的热感刺激显示,大鼠左侧与右侧后肢术后对热敏感的刺激反应明显不同,损伤侧动物行热刺激时,抬腿消失,热敏实验阴性。
而健侧后肢对热痛反应消失后渐渐恢复,两侧相比差异具有统计学意义(P<0.05),见表1。
术后不同时间点大鼠抓力实验于20:
00进行检测。
模型大鼠左侧后肢在不同时间(术后24h,1周,2周,3周,4周)的抓力明显小于健侧后肢(P<0.01,差异具有统计学意义),而且随着模型复制时间的延长,抓力并无明显改变,见表2。
通过对脊髓半离断术后的大鼠进行抓力和热痛反应试验可看出,手术前大鼠的双后肢的感觉和运动能力均正常。
手术后,随着时间的推移,患侧后肢的运动感觉和反射功能均无恢复,同时,健侧后肢运动能力不受影响,对热痛觉没有反应,但随着时间的推移,热痛反应可以渐渐恢复。
因此,本模型的脊髓损伤是成功的,且为单侧离断性脊髓损伤,对大鼠造成感觉和运动功能障碍;同时,根据脊髓形态定位,T9~T10棘突间隙插入针头造成的损伤为腰髓部位的损伤,但该模型不伴有明显的排泄障碍。
2.3脊髓组织损伤定位及一般形态学观察肉眼观察:
术后24h大鼠伤口处肿胀,1周后伤口愈合,4周时背部皮肤基本恢复正常。
打开脊椎椎板后可见针头插入部位位于腰髓段,此处脊髓仍充血肿胀,脊髓组织软化崩解。
显微镜下观察(HE染色):
术后大鼠脊髓的损伤区可见纵行脊髓纤维断裂,损伤区域内神经结构基本消失,髓鞘不可辨认,见图4。
3讨论
随着转化医学理念的引入,各种用于科学研究的动物疾病模型应更符合临床实际,并能根据实验需要进行药物治疗、行为干预及长期疗效观察。
因此,作为理想化的脊髓损伤模型应具备以下几个条件:
第一是能反应实验动物脊髓损伤的神经生理、运动行为的情况;第二是可以提供与临床脊髓损伤一致或相似的动物模型,即具有良好的临床相关性:
第三是模型要具有可复制性。
研究脊髓损伤需大量的实验动物,这就需要制造模型的标准化[6]。
以往文献报道的常用的动物脊髓损伤模型有下列几种:
(1)挫伤型脊髓损伤模型:
此种脊髓损伤模型由相关学者在上个世纪初期首次设计的脊髓背侧打击模型[7]。
该模型主要利用不同重量的砝码从不同高度沿着套管垂直落下打击大鼠脊髓背侧造成不同程度的损伤。
模型的最大不足之处在于影响因素复杂,操作重复性较差,譬如:
同样的势能造成的损伤程度并不一致,且在打击瞬间撞击锤与脊髓相接触的面积不一。
(2)钳夹型脊髓损伤:
为一种急性脊髓挤压性损伤模型[8]。
模型主要是通过手术方式打开SD大鼠椎板,用动脉瘤夹钳夹相应的脊髓段。
由于该方法需要去除椎板,对动物损伤较大,同时感染机率较大,动物常由于感染而发生死亡;另外由于钳夹对脊髓损伤的力度不同,容易造成大鼠下肢全瘫,对大鼠术后护理造成很多不便。
(3)切割型脊髓损伤模型:
与钳夹型脊髓损伤模型类似,也需要通过手术打开椎板,暴露相应脊髓[9]。
脊髓暴露后,采用锐利的虹膜刀片或者显微剪全横断或半横断脊髓。
该模型手术步骤较复杂,对大鼠的损伤较大,且用刀片对脊髓的横断面较整齐,与临床实际病例有一定差异。
(4)脊髓缺血及再灌注模型:
与前述脊髓损伤模型的不同在于,该模型主要采用夹闭降主动脉造成脊髓缺血造成脊髓损伤[10]。
但是阻断脊髓供血的同时也造成了血管阻塞及其他组织器官的损伤,影响了随后脊髓损伤行为学的观察。
本实验中所采纳的脊髓损伤模型与上述各种模型相比而言具有以下优点:
(1)皮肤创面较小,且不需打开椎板进行操作。
由于不破坏椎板的完整性,因此大鼠出血量很少,术后很少发生椎管内感染,动物存活时间较长。
(2)利用自制改良的注射器针头插入棘突间隙进行损伤,操作难度较小,且定位准确,损伤力度基本一致,既可以进行半离断性损伤,也可以进行全离断性损伤,由于损伤的可控性较好,术后并发症较少。
(3)注射器针头造成的损伤属于不规则性损伤,损伤断端更符合临床实际。
(4)自制改良的1mL注射器针头容易制作,技术难度较小,操作容易,重复性较好,造成的感觉运动功能障碍明显[11]。
另外,模型整体操作对大鼠的损伤小,伤口自愈时间短。
(5)模型最大的特点是可以通过注射针头所连接的注射器在损伤的部位注射药物,对神经营养因子或神经干细胞等干预损伤,为探讨临床新的治疗脊髓损伤的新药制剂提供了良好的实验基础,并可在此基础上探讨脊髓神经损伤后再生机制。
模型制作同时局部注射药物或制剂进行干预是本模型的独特所在[12-13]。
总之,本模型的建立属于大鼠脊髓损伤模型的新方法之一,主要解决现有模型中存在的诸多弊端。
利用注射器针头造成的脊髓损伤模型操作简便,损伤较小,重复性高,功能障碍显著,同时,由于模型动物术后感染机率低、并发症少、存活率高、可重复性好,有良好的推广使用前景。
模型的建立为今后研究具有刺激或促进脊髓再生的药物或制剂提供了良好的条件及环境,为探索临床药物的分子作用机理提供实验基础。
参考文献
[1]刘雷,裴福兴.脊髓损伤模型制备及评价的研究进展[J].中国康复学杂志,2004,18(12):
70-72.
[2]AdshimaY,SetoguchiT,YamauraI,etal.Preventiveeffectoferythropoietinonspinalcordcellapoptosisfollowingacutetraumaticinjuryinrats[J].Spine,2006,31(21):
2432-2438.
[3]RonsynMW,BernemanZN,VanTendelooVF,etal.Cancelltherapyhealaspinalcordinjury[J].SpinalCord,2008,46(8):
532-539.
[4]武庚,赵富生,潘秀丽.大鼠脊髓半离断模型制备新方法[J].牡丹江医学院学报,2008,29
(2):
5-7.
[5]高峰,贺世明,王学廉,等.成年大鼠脊髓神经干细胞的培养与鉴定[J].中国临床保健杂志,2008,5(3):
278-281.
[6]卢鹏.实验动物脊髓损伤模型[J].中国骨与关节损伤杂志,2008,23
(2):
174-176.
[7]YezierskiRP.Spinalcordinjury:
Amodelofcentralneuropathicpain[J].Neurosignals,2005,14(4):
182-93.
[8]李刚,李新钢,吴承远,等.钳夹型大鼠脊髓损伤模型的建立及X线照射对损伤区组织结构恢复的影响[J].中华实验外科杂志,2006,23
(2):
248.
[9]房成,苏蔚.电针对神经痛大鼠治疗作用的研究[J].新乡医学院学报,2008,25(5):
473-475.
[10]MarsalaM,YakshTL.TransientspinalischaemiaintheratCharacterizationofbehaviouralandhist.pathologicalconsequencesasafunctionofthedurationofaorticocclusion[J].CerebBloodFlowMetab,1994,14(5):
526-535.
[11]纪江峰,冯世庆.脊髓损伤模型研究进展[J].中华实验外科杂志2006,23(9):
1151-1152.
[12]BassoDM,BeattieMS,BresnahanJC,etal.GradedhistologicalandlocomotoroutcomesafterspinalcordcontusionusingtheNYUweight-dropdeviceversustransaction[J].ExpNeurol,1996,139
(2):
244-256.
[13]BavettaS,HamlynPJ,BurnstockG,etal.TheeffectsofFK506ondorsalcolumnaxonsfollowingspinalcordinjuryinadultrats:
neuroprotectionandlocalregeneration[J].ExpNeurol,1999,158
(2):
382-393.
(收稿日期:
2014-11-18)(本文编辑:
周亚杰)
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 一种 大鼠 脊髓 半离断 损伤 模型