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FISH检测
FISH检测
FISH检测
HER-2的意义
乳腺癌有效的治疗取决于正确的选择治疗方案,肿瘤专家研究发现HER-2的水平是以阿霉素为基础药物化疗重要而独立的预后因子。
HER-2水平的检测被认为是选择乳腺癌化疗的标准依据。
HER-2水平的检测对乳腺癌治疗具有指导性意义。
不准确的结果会造成不正确的治疗方案。
导致病人遭受不必要的化疗或者使病人丧失有效的治疗良机。
HER-2/neu也称作CerbB-2,在调节细胞的生长中起着重要的作用,是分子量为185kd的转膜细胞受体,属于酪氨酸酶家族的成员。
HER-2被证实在乳腺癌、卵巢癌和其它肿瘤上扩增和过表达。
其扩增和过表达被认为是乳腺癌最重要预后和化疗标记。
大约有25%-30%乳腺癌有HER-2基因扩增。
化疗是乳腺癌术后最重要的治疗方法之一,患者肿瘤HER-2扩增对以阿霉素为基础化疗的敏感性好,研究表明,HER-2扩增的病人实施强化剂量的化疗后其生存率明显提高。
而对无HER-2扩增的病人没有那么好的效果。
所以对无HER-2扩增的病人没有必要执行这样的化疗。
准确的HER-2水平检测为正确选择治疗方案提供重要依据。
目前用于治疗乳腺癌的单克隆抗体Herceptin理论上只对细胞膜上过多HER-2蛋白表达的细胞才有作用,所以Herceptin治疗需要筛选HER-2阳性的患者才有可能成功。
目前检测HER-2基因扩增或HER-2蛋白过度表达的方法有许多种,有南方点墨法、西方点墨法、北方点墨法、免疫组织化学染色法(IHC)和荧光原位杂交法(fluorescenceinsituhybridization;FISH)等。
目前DAKOHerceptintest,VysisPathVysionHER-2DNAProbe试剂盒和OncorINFORMHER-2/neu已通过美国食品药物管理局(FDA)的认证,目前被认为是比较可靠的方法。
IHC和FISH均可以使用福尔马林固定的组织蜡块来检测,和一般病理组织标本处理相同,病理存档的组织块也能用于HER-2的检测,因此目前实验室多数使用IHC和FISH来检测HER-2。
Herceptintest和FISH相比Herceptintest操作时间比较短,大约4-6个小时即可完成,而
30-17060/35-171060
Quantity:
200uL/500uL/500uLx2forthe100assaykit
Storage:
-20℃inthedark
Composition(成分):
SpetrumGreenfluorophore-labeledalphasatelliteDNAprobeforchromosome17,SpectrumOrangefluophore-labeledDNAprobefortheHER-2/neugenlocus,andblockingDNA,pre-denaturedinhybridizationbuffer.
2)DAPIConuterstain
VysisP.N:
30-804840/30-804860/30-804960
Quantity:
300uL/600uL/1000Ul
Storage:
-20℃inthedark
Composition:
1000ng/mLDAPI(4,6-diamino-2phenylindole)inphenylenediaminedihydrochloride,glycerol,andbuffer.
3)NP-40
VysisP.N:
30-804820
Quantity:
4mL(2vials)
Storage:
-20to25℃
Composition:
NP-40
4)20XSSCsalts
VysisP.N:
30-805850
Quantity:
66gforupto250mLof20XSSCsolution
Storage:
-20to25℃
Composition:
sodiumchlorideandsodiumcitrate
Note:
MaterialSafetyDataSheets(MSDS材料安全数据表)forallreagentsprovidedinthekitsareavailableuponrequestfromtheVysisTechnicalDepartment.
Storageandhandling贮存和处理
未开封的PathVysis试剂盒-20℃贮存并避光和潮湿。
20XSSC盐和NP-40可以单独贮存于室温。
每一种成分包装上面都标明了有效期。
同时也标明了打开和未开包装的贮存条件。
试剂盒中的某些成分接触光、热或潮湿会影响试剂的有效期,应该避免。
不按包装规定的条件保存可能会影响检测结果。
需要的材料但Vysis公司不提供
实验室试剂
·HER-2/nue探针检测正常对照(正常信号率)orderNo.30-805093
·福尔马林固定,石蜡包埋,培养好的人细胞株(normalLSIHER-2/nue;CEP17ratio)应用型显微镜载玻片数量:
5片,对照片在15-30℃干燥剂防潮密封在容器中贮存。
·HER-2/nue探针界限对照片(弱扩增信号率)orderNo.30-805042;福尔马林固定,石蜡包埋。
培养好的人细胞株(低水平HER-2/nue扩增)应用型显微镜载玻片数量:
5片,对照片在15-30℃干燥剂防潮密封在容器中贮存。
·石蜡预处理试剂盒(Vysiscat.﹟32-801200)盒内包括:
·预处理液(NaSCN)数量:
5X50mL
·蛋白酶(胃蛋白酶2500-3000单位/mg)数量:
5X25mg
·蛋白酶缓冲液(NaClsolution,pH2)数量:
5X50Ml
·缓冲洗液(2XSSC,pH7)数量:
2X250mL
·中性缓冲福尔马林液(4%多聚甲醛PBS配制)
·Hemo-De(血液德)透明剂(FisherproductNo.15-182-507A)
·苏木精和伊红(H&E)
·适当的荧光显微镜浸泡油。
室温贮存
·超纯甲酰胺。
从发货计算4℃保存1个月(查看生产商推荐的详细信息)
·100%乙醇。
室温贮存
·浓缩的(12N)盐酸
·1N氢氧化钠
·纯净水(蒸馏水或去离子水或Milli-Q)。
室温贮存
·橡胶水泥胶
·Drierite德里拉特[干燥用无水硫酸,商品名]和液氮
实验室设备
·预清洁硅化或正电荷显微镜载玻片
·载玻片加热器(要求有准确的温度数字显示)45-50℃
·22mmX22mm玻璃盖玻片
·可调容积吸管(1-10uL)和无菌微量移液管头
·聚丙烯微量离心管(0.5-1.5mL)
·计时器
·切片机
·磁力搅拌器
·漩涡混合器
·微量离心机
·刻度量筒
·水浴锅(37±1℃,72±1℃和80±1℃)
·水浴(40℃)无蛋白质
·干燥箱(37℃-56℃)
·钻石笔
·杂交湿盒
·镊子
·一次性注射器(5mL)
·染色缸(6)建议型号:
WheatonProductNo.900620竖式染色缸
·荧光显微镜设备和推荐的滤光片(见第二部分)
·pH计和pH试纸
·温度计
·带盖载玻片盒
·0.45细孔过滤设备
显微镜设备和附属品
显微镜:
观察原位杂交结果需要一种磊照明荧光显微镜,如果有合适的荧光显微镜。
应该检查荧光显微镜是否能较好的观察原位杂交样品。
用老式显微镜一般DNA染色例如DAPI,碘化丙啶和奎纳克林不具备足够的功能进行FISH检测。
显微镜常规清洁和定期调试应该由生产商家的技术人员完成。
注释:
Oftenapresumedfailureofreagentsinaninsituassaymayactuallyindicatethatamalfunctioningorsub-optimalfluoroscopeorincorrectfiltersetisbeingusedtoviewasuccessfulhybridizationassay.
激发光源:
100W汞灯它的大约寿命200小时是推荐的激发光源。
汞灯用后应该记录使用小时数。
超过规定的时间之前应该更换。
确保汞灯适当的应用。
接物镜:
显微镜汞灯100W使用的荧光接物镜浸泡油数值孔径≥0.75。
一个40X接物镜用10X目镜连接适合扫描。
对FISH分析用63X或100X油浸消色差透镜型接物镜就可以获得满意的结果。
浸泡油:
油浸接物镜使用的浸油,是一种低自发荧光和专用荧光显微镜的配方。
滤光片:
多带通荧光显微镜滤片装置最适合用于CEP和LSIDAN探针试剂盒可以从Vysis获得一些显微镜滤片型号。
PathVysion试剂盒推荐滤片装置是DAPI/9-Orange双带通,DAPI/Green双带通和DAPI/Green/Orange三重带通。
LSIHER-2/nue原位杂交和CEP17探针对它们的靶区分别标记橙色和绿色荧光。
其它所有DNADAPI染色为绿色荧光。
工作液的准备
20XSSC(3M氯化钠,0.3M柠檬酸钠,pH5.3)
配制20XSSCpH5.3加入的顺序:
66g20XSSC
200mL纯化水
250mL最终量
彻底混合,用pH计室温下测pH,用浓盐酸调pH到5.3。
加纯水至总量250没mL。
通过0.45um孔径的过滤设备过滤。
室温贮存6个月。
变性液(70%甲酰胺/2XSSC,pH7.0-8.0)
配制甲酰胺的顺序:
49mL甲酰胺
7mL20XSSC,pH5.3
14mL纯化水
70mL最终量
彻底混合,用pH计室温下测pH,用玻璃电极(glasselectrode利用薄玻璃膜将两种溶液隔离而产生电势差的电极,常用于测量溶液的pH)调pH至7.0-8.0之间。
液体可以保存一周。
每次用前检查pH。
贮存于2-8℃,不用的时候盖紧容器的盖子。
乙醇液
用100%乙醇和纯化水v/v稀释70%,80%。
避免蒸发或稀释过量,不用的时候盖紧容器的盖子。
配制后可以使用一周。
后杂交缓冲洗液(20XSSC/0.3%NP-40)
配制顺序:
100mL20XSSC,pH5.3
847mL纯化水
3mLNP-40
1000mL最终量
彻底混合,用pH计室温下测pH,用1N氢氧化钠调pH至7.0-7.5。
加纯化水到总量1000mL。
通过0.45um孔径的过滤设备过滤。
使用过的液体当日丢弃,未使用过的液体室温贮存6个月。
注意事项和预防措施
1.VysisPathVysionHER-2DNAProbekit用于体外诊断使用。
2.ThePathVysionKit仅用于福尔马林固定石蜡包埋乳腺癌组织;不作为新鲜组织或非乳腺癌组织使用。
3.所有生物学标本经过防止传染病传递的药剂处理。
盒子里提供的是人细胞株经过10%福尔马林固定的对照细胞涂片。
因为常常不清楚是否会引起传染,所有人标本和对照片是经普遍预防处理。
标本处理指南从美国疾病控制中心获得。
4.标本应该避免酸,强碱或过热,这样的条件会破坏DNA引起FISH检测失败。
5.下面所有步骤对标本变性,杂交和检测可以引起不可接受失败或错误的结果。
6.相同组织块的第10张切片应该进行H.E染色对靶区进行辨认。
7.使用其它试剂代替Vysis公司提供的试剂可能对杂交条件产生不利的影响。
8.确保标记的有效期以盒子上正确贮存说明为基础,不按贮存说明要求存放可能对检测结果不利。
9.如果贮存在低温,20XSSC可以出现结晶,如果结晶在室温下不能再溶解,该液应该丢弃。
10.如果其它工作液沉淀或浑浊应该丢弃,从新配制新工作液。
11.该DAPI对比染色含有DAPI(4,6-二氨基-2-苯基吲哚)和1,4苯二胺。
DAPI是一种可能的诱变剂明确建立在遗传毒性影响的基础上。
1,4苯二胺被认为是一种皮肤致敏剂和一种可能的呼吸致敏剂,避免吸入,摄取或皮肤接触。
参考MSDS详细警告。
12.荧光暴露在光线下容易被光漂白,限制这种降级。
操作所有含荧光的液体时要减少光线暴露。
所有步骤牵涉到处理杂交的切片。
所有(孵育、洗等)步骤不要在光线下应该在暗处操作。
13.LSIHER-2/neuCEP17DNA探针混合物含有甲酰胺,一种致畸因子。
避免接触皮肤和黏膜。
14.校准温度需要测量液体、水浴锅和恒温箱的温度。
15.总要核实预处理液,变性液和洗液的温度,使用前用标准温度计对科普林缸内液体进行测量核对温度。
16.所有有危险的物质应该按当地和国家指导方针进行无害化处理。
标本处理和载玻片准备
标本收集和处理
PathVysion试剂是为福尔马林固定石蜡包埋的组织样品检测而设计的,组织收集应该按照实验室标准程序执行。
PathVysion检测对组织的选择应该由病理学家完成。
标本避免接触酸,强碱或非常高的温度。
这种情况会破坏DNA导致FISH检测失败。
切片厚度4-6微米,福尔马林固定,石蜡包埋的组织可以按照实验室常规步骤处理和贮存。
确保PathVysion试剂盒检测的最佳结果,对所有标本分析这些方法应该一致。
用于FISH检测分析组织块的第10张作H.E染色,以便对靶区进行辨认。
组织切片应该贴在胶包被载玻片的正面,以便在FISH检测中脱片。
PathVysion试剂盒有足够检测大约20人份的试剂;每份限定22mmX22mm区域。
较大的组织切片超过22mmX22mm区域每份加探针应该大于10uL。
福尔马林固定石蜡包埋组织切片准备
使用下列方法进行准备
1.切片4-6微米。
2.切片飘在无蛋白质40℃水中。
3.贴在有机硅烷胶包被载玻片的正面。
4.让切片在空气中干燥。
(StartprocessingProbeChekcontrolslideshere)
5.烤切片56℃过夜。
切片预处理
在进行PathVysion试剂盒检测前标本需要经过固定,切片必须脱蜡。
PathVysion预处理试剂盒插在包装中,(ProductNo.32-801200)含有详细的说明。
下面是简要的步骤说明。
切片脱蜡
切片浸在Hemo-De10min,室温。
用新Hemo-De重复两次。
切片在100%乙醇5min,室温,重复。
空气干燥切片或把切片放在45-50℃载玻片加热器上。
预处理切片
切片浸在0.2NHCI20minutes
切片浸在纯化水中3minutes
切片浸在缓冲洗液中3minutes
切片浸在预处理液中80℃30minutes
切片浸在纯化水中1minutes
切片浸在缓冲洗液中5minutes,重复
蛋白酶处理
在载玻片边缘用纸巾吸干载玻片上过多的缓冲液
切片浸在蛋白酶液中37℃,10minutes
切片浸在缓冲洗液中5minutes,重复
干燥切片在45-50℃载玻片加热器上2-5minutes。
标本固定
切片浸在中性缓冲福尔马林液中,室温,10minutes。
切片浸在缓冲洗液中5minutes,重复
干燥切片在45-50℃载玻片加热器上2-5minutes。
继续thePathVysion检测拟订计划
FISH测试步骤
FluorescenceInSituHybridizationProcedureSummary
样品DNA变性
探针液DNA变性和杂交步骤准备工作应该同步进行。
1.将杂交用的湿盒在37℃中预热(湿盒内放有湿纸巾)。
2.使用前在室温下将变性液pH调到7.0-8.0,把变性液加入玻片染色缸内(Coplinjar)而后在72±1℃水浴至少30min或变性液达到72±1℃,使用前测量温度。
3.使用钻石笔尖划刻标记杂交区域。
4.将准备好的切片放入到达到72±1℃的变性液中(<6片/缸)5min。
Note:
Verifythesolutiontemperaturebeforeeachuse.
5.用镊子从变性液中取出切片并立即放入室温70%酒精洗液中。
摇动切片去除甲酰胺,让切片在酒精中维持1min。
6.从70%酒精取出栽玻片,放入80%酒精,再入100%酒精。
7.载玻片的底部接触到一个小瓶子排掉载玻片上过多的酒精,用实验室纸巾擦干载玻片的底面。
8.放在45-50℃载玻片加热器上2-5min。
探针准备
1.室温下让探针复温,降低探针的黏度,以便探针充分准确吸取。
2.涡流混合。
把内容物装入试管底部,每个试管用台式离心机离心2-3秒,然后再次轻轻涡流混合。
杂交
1.加10uL混合后的探针到载玻片的靶区,立刻在探针上加盖22mmX22mm盖玻片,让探针均匀的在盖玻片下扩散。
气泡会干扰杂交应该避免。
探针使用后需要及时再冷冻保存。
2.按下列方法用橡胶水泥密封盖玻片:
用5mL注射器抽橡胶水泥,在盖玻片的周围注射少量的橡胶水泥于盖玻片和载玻片交界处重叠,因此在盖玻片和载玻片周围形成密封圈。
3.把载玻片放入预热的杂交湿盒中,盖紧湿盒的盖子37℃过夜(14-18小时)
杂交后洗涤
1.加杂交后缓冲洗液(2XSSC/0.3%NP-40)到玻片染色缸内。
放进72±1℃水浴中预热杂交后缓冲洗液至少30min或液体温度已经达到72±1℃。
注:
在每次洗浴之前洗液的温度必须回到72±1℃。
2.室温下加杂交后缓冲洗液到第二个玻片染色缸。
洗液使用1天后都要丢弃。
3.首先用镊子轻轻拉掉密封剂,去除载玻片上密封的橡胶水泥。
4.在室温下将载玻片浸入杂交后缓冲洗液中漂洗掉盖玻片。
5.盖玻片小心被去掉后,吸干载玻片边缘过多液体,把载玻片浸入杂交后缓冲洗液中72±1℃2min(<6片/缸)。
6.从杂交后缓冲液中移出每张载玻片,把载玻片放在暗处竖立空气中干燥。
(关闭抽屉或关闭贵出门足可以)
7.加1010uLDAPI复染载玻片靶区并加盖盖玻片。
在信号计算前载玻片贮存于暗处。
载玻片贮存
在暗处杂交载玻片(带有盖玻片)贮存于-20℃。
使用荧光显微镜时,先从-20℃移出来让载玻片达到室温。
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