凝胶成像及QuantityOne中文操作说明.docx

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凝胶成像及QuantityOne中文操作说明

集团标准化办公室：

[VV986T-J682P28-JP266L8-68PNN]

凝胶成像及QuantityOne中文操作说明

第一章简介

凝胶电泳是每个做分子生物学的研究者天天都要打交道的基本技术。

电泳之后的信息处理与电泳本身同样重要。

目前有大量软件可以用于分析电泳结果，要向大家介绍的是Bio-Rad公司的1D凝胶分析软件QuantityOne（Bio-Rad还有一个做2D凝胶分析的软件PDQuest）。

QuantityOne软件是常用1D凝胶分析软件中功能最强大，自动化程度最高的软件。

这个软件的最新版本可以在Bio-Rad的网（）免费下载，以供试用或用户升级之用。

QuantityOne软件的主要功能包括定量分析（VolumesQuickGuide），电泳条带分析（BandAnalysis），差显分析（DifferentialDisplayAnalysis），克隆计数（ColonyCountingAnalysis）等，此外，还可以直接控制Bio-Rad公司的各类图像仪和ExQuest自动切胶仪，使您的凝胶分析工作变得极为轻松。

QuantityOne软件拥有与windows操作系统下绝大多数应用软件相同的友好界面。

插入密码狗，打开QuantityOne软件，可以看到最上缘蓝色横条幅是标题栏，往下依次是菜单栏和工具栏。

File

图像打开、保存、引入、打印等操作

Match

分子量估算、条带匹配分析

Edit

图像普通编辑操作

Volumn

定量分析

View

图像缩放、三维视图、看光密度值等操作

Analysis

浓度估算、克隆计数等分析

Image

图像旋转、翻转、裁切等操作

Reports

分析结果输出

Lane

泳道分析

Window

窗口分析

Band

条带分析

Help

帮助、快捷菜单、软件注册等

每个菜单的主要功能如下：

往下一行是工具栏，上面每个按钮的功能见下表：

QuantityOne软件HelpàQuickGuide快捷指南提示如何实现一个功能，如定量分析（VolumesQuickGuide），电泳条带分析（BandAnalysis），差显分析（DifferentialDisplayAnalysis），克隆计数（ColonyCountingAnalysis）等。

快捷指南下有1，2，3…步骤，根据提示完成。

使用QuantityOne软件进行电泳结果分析，通常包括图像获取、图像预处理、分析、结果输出四部分。

图像获取就是通过软件控制扫描仪（GS-800、PharosFX等）或凝胶成像系统（GelDoc、ChemiDoc、VersaDoc等），图像预处理就是将扫描或拍照获得的原始图像进行初步处理，以便更好地进行后续分析。

接下来是分析过程，根据分析的方法和目的不同，又可以分为定量分析、条带分析、克隆计数、差异（聚类）分析等等。

不管如何分析，最终我们都必须通过软件的输出功能，得到我们想要的结果。

QuantityOne软件提供了多种结果输出方式。

在接下来的几章里，我们将按照这个思路，一步步引导您使用这一软件。

第二章图像获取

QuantityOne－版本可以控制Bio-Rad目前几乎所有的图像仪，如GelDocXR、ChemiDocXRS等。

这些图像仪采集到的图像，可以直接保存成软件可直接分析的图像，即扩展名1sc的原始图像文件。

下面将具体介绍如何通过QuantityOne软件从GelDocXR获取图像。

GelDocXR是Bio-Rad凝胶成像系统中最常用，操作最简便的仪器，它可以用来拍摄EB、SYBRGreen等染料染的核酸电泳凝胶；SyproRuby、银染、考马斯亮蓝等方法染的蛋白电泳凝胶；以及化学显色的印记膜等。

使用GelDocXR之前，先接通电源，打开位于仪器背面右下角的电源开关；然后根据具体的应用选择合适的照明和滤光片位置。

原则如下：

表格形式

模式1.如果样品是通过EB、SYBRGreen、SyproRuby等染料通过紫外激发来显色，就先将样品置于紫外透射平台（UVTransilluminator）的中间，关上暗箱门，然后按下面板上的“TransUV”按钮，并将滤光片选择杆置于位置“I”处。

模式2.如果样品是通过金属银、考马斯亮蓝等染料染色，就先将白光转换屏（WhiteLightConversionScreen）取下，打开下部的开关，放在紫外透射平台上，样品置于白光转换屏中间。

关上暗箱门，然后按下面板上的“TransWhite”按钮，并将滤光片选择杆置于位置“I”处。

模式3.如果是化学显色等非透明可见样品，则用模式2中所示方法，将样品置于白光转换屏中间。

关上暗箱门，然后按下面板上的“EpiWhite按钮”，并将滤光片选择杆置于位置“O”处。

接下来打开QuantityOne软件，选择File》GelDocXR，按以下顺序操作：

①按下Live/Focus，成像仪进入实时成像；

②选择照明模式，一般核酸胶用UV,蛋白胶用White模式；注意，选择完成后，要按下成像仪面板上相应的光源按钮

③此功能有三个上下键按钮：

IRIS（光圈），ZOOM（缩放），FOCUS（聚焦），您可在软件上直接调节或在仪器面板上手工调节调节步骤：

a调大IRIS，以看到图像

b点ZOOM,将胶适当放大

c调节IRIS至合适大小（一般情况下尽量选择小光圈，因为小光圈景深大，图像更清晰）

d调节FOCUS，至图像最清晰按

④按“AutoExpose”；如是，单击AutoExpose,系统将自动选择曝光时间成像，如不满意，单击ManualExpose，并输入曝光时间（秒），图像满意后保存,在自动曝光期间，图象会持续的输入到CCD中，直到达到一定比例的饱和象素值，此比例在Optionsdialogbox中设定（默认值=％）。

一旦图象质量达到要求，点击Freezebutton来终止曝光。

⑤如是蛋白凝胶，接第6步直接将清晰的图像保存即可

⑦按下“Analyze”；这将会打开一个新的窗口来显示捕获的图象，该图象具有默认名称，具有日期、时间及用户名（如果已知的话）等信息。

⑧按下“Save”键，保存图像。

第三章图像分析

QuantityOne的图像分析功能相当强大，根据不同的需要，可以分为定量分析、条带分析、相似性分析以及克隆计数（用于蓝白斑筛选）等等，而且每种分析法都有独特的优点和输出方式。

本章重点介绍常用的定量分析和条带分析方法，其余更细更深的功能请参考软件自带的用户手册。

一．定量分析（VolumnAnalysis）

定量分析是计算选定区域内信号强度的总和，是QuantityOne最方便的定量工具。

这种分析方式考虑选定区域的真实形状，可用于电泳条带、斑点、大型芯片等图像的定量。

这种定量的方法可以扣除背景，可以按照用户的标准曲线计算出条带或斑点的浓度，但它不能计算分子量，也不能进行条带匹配和相似性分析。

QuantityOne软件称这类定量的结果为Volume。

Volume＝选定区域内所有像素信号强度的总和×像素面积

Volume的单位：

int×mm2

快捷指南VolumesQuickGuide，能够指导您对任意所选区域进行定量分析,此分析可以报告多种结果，常用的结果是相对浓度和绝对浓度（须提供标准品）。

具体的操作方法如下：

1．选择成像系统或打开已保存的文件（软件可以控制Bio-Rad所有的成像系统如GelDoc,ChemiDoc,VersaDoc,GS-800,FX,如不是Bio-Rad成像系统所摄取的图象，将图象保存为Tiff文件格式，软件也可进行分析处理）

2．ZoomBox，缩放，对图象进行放大观察

3．Transform转化，调节图象的对比度黑白

4．选择待分析区域：

VolumnContourTool等高线勾勒区域，自动连接浓度相同的点，如U1

VolumeFreehandTool自由画笔选择区域，可以勾勒出无规则形状,如U2

VolumeRectTool矩形区域选择，如U3

VolumnCircleTool圆形选择区域，如U4

按上面4种方法选择需要定量的区域。

5．双击所选区域，出现如下窗口，定义样品类型，如未知样品Unkonwn（U1,U2…即待计算样品），背景Background（B1,B2…，软件在算浓度时会将此区域的浓度自动扣除）或标准样品Standard（Std1,Std2,如果该样品是浓度标准样品，即定量标准，需在浓度concentration一栏输入该样品的浓度）。

6．SelectTool选择不同区域

7．PrintImage打印图像

8．VolumeAnalysisReport定量报告结果，打开出现如下窗口，选择要报告的参数，主要有2个参数Volume、adj.Vol.（即adjustedvolume）和Concentration。

Volume为定量值，adj.Vol.为扣除背景后的定量值，如有浓度标准样品（Std），软件可报告Concentration绝对浓度。

参数选好后，按下按钮“done”。

9．软件报告如下图所示：

按右侧输出按钮，可将表格保存成txt文件，按左侧打印按钮，可将报告打印出来。

二．条带分析（BandAnalysis）

条带分析是QuantityOne最基本的分析工具，它可以自动识别电泳泳道和识别条带，依据泳道的平均光密度和条带宽度对每个条带进行模式化定量。

这种分析方式虽然不如定量分析来得方便，但这样可以实现非常复杂的电泳分析，满足各种不同的结果需要。

这种方式的最大优点在于它可以完全抛弃人为主观因素而进行全自动定量。

用条带分析的方法进行定量的结果叫TraceQuantity（TraceQty），计算方法是：

首先软件自动计算条带上每一横排像素的平均光密度和平均光密度分布曲线，然后每个具体条带的定量值是平均光密度曲线的线下面积的积分，即：

TraceQuantity＝平均光密度×条带上下边界的距离

TraceQuantity的单位：

OD*mm

下面介绍用此功能对泳道内的所有条带进行分子量确定，相对浓度分析

1．打开已保存的文件（如不是Bio-Rad成像系统所摄取的图象，将图象保存为Tiff文件格式，软件也可进行分析处理）

2．ZoomBox，缩放，对图象进行放大观察

3．Transform转化，调节图象的对比度黑白

4．确定泳道（lane）,并对泳道进行各种调整（实际实验中泳道往往不是垂直的而出现各种变形）。

按下图所示在软件的工具栏中有一LaneTool图标，包含有更多泳道编辑工具。

5．选择FrameLanes，输入图像实际泳道（lane）数并确认。

此时图像上泳道的位置上会出现一条条红线，每条红线就代表一根泳道。

6．选择Add/AdjustAnchors，此时泳道红线上会出现一些小圆圈。

这些小圆圈称为锚定点（anchor），锚定点规定了泳道走向。

当泳道不直时，点击出现弯曲的泳道部位，就可以增加锚定点。

鼠标按住锚定点，可以拖动锚定点，让每根红线始终位于泳道的中间线上。

7．LaneBackground去除泳道背景。

点击该按钮，选择一条适当的泳道点击之，然后在弹出的对话框中选“AllLaneOn”，在“RollingDiskSize”中填入适当的数值。

8．DetectBand，检测泳道内的条带，打开出现如下窗口。

通过调节sensitivity灵敏度可调节检测出的条带数，调节LaneWidth使代表表带的红色横线与条带宽度差不多宽。

中间一行人工编辑按钮可以用来增加/减少条带、调节条带的上、下边界等。

打开工具栏中BandTool条带编辑工具包可看到更多编辑工具（如上图）

9.Standard输入分子量标准，软件自带有许多Bio-Rad的分子量标准，如你用的是自己的标准，进入NewStandard建立新的分子量标准，软件可以选择标准单位是MW（蛋白质）还是BP（核酸）等（左下图）。

在Protein-Standard对话框中输入分子量数值，完成后单击赋值图标（右下图），回到图象文件上单击标准样品的泳道，软件自动将所输的分子量数值和泳道内的条带一一对应。

10.BandAttribute条带属性，在完成第9步以后，软件已自动计算出了其他未知条带的分子量,打开bandattribute选择要报告的参数，这里我们选择MolecularWeight，图象上可以看到所有条带的分子量（红颜色标记），标准分子量为蓝色标记。

11.PrintImage打印图象

12.AllLaneReport所有泳道条带结果报告。

打开窗口，选择要报告的参数，如.（分子量，如左下图），软件将报告结果（右下图），在报告的右下脚有一报告输出工具，点击可将报告结果输出成.txt文本格式或输出至剪贴板，可粘贴到EXCEL，WORD等文件下。

常见问题及处理：

1问：

为什么我新买的QuantityOne软件几天前还能用，现在只能使用最基本的功能了？

答：

可能是密码未正确安装，而试用期已过。

2问：

为什么我重新安装QuantityOne软件后就不能使用了？

答：

可能是安装了超过版本限制的高版本QuantityOne。

3问：

我的密码狗还在，可密码找不到了，我该如何填写密码？

答：

可以暂时将电脑连到Internet上，打开QuantityOne软件，选择Help》Register》CheckLicense，或直接打电话800-820-5567，向Bio-Rad工程师询问。

4问：

QuantityOne软件能否分析通过其它公司成像仪或扫描仪得到的照片？

答：

可以，但前提是照片必须是未经压缩的TIFF（tif）文件，且数据采集位数是8位或12位。

5问：

我拍出的图片，条带很明显，为什么软件总找不到？

答：

打开QuantityOne软件，鼠标放在图像上，同时按下Ctrl.+T，看看条带数据是否大于背景，如果不是，则选择Image》InvertData，然后同时按下Ctrl.+B，选择InvertDisplay。

6问：

为什么我拍出来的照片，总有一根根很粗的背景？

答：

可能是应该使用滤光片而没有使用，把照明灯管摄入照片。

7问：

为什么我用ChemiDocXRS拍出来的照片，总有一条条向电泳条带的影子？

答：

可能是在以前使用动态平场功能时，未将样品取出，导致参考背景始终有以前样品的影子。

8问：

为什么我的白光转换屏不亮了？

答：

白光转换屏下方有电源插口和开关，检查电源线是否插紧，开关是否打开。

9问：

我想割胶，如何打开紫外透射平台的紫外灯？

答：

将暗箱门关好，将抽屉式紫外透射平台完全拉出，安上有机玻璃保护屏，然后按下“TransUV”按钮和“PrepUV”按钮。

10问：

为什么我拍出来的照片越来越模糊？

答：

可能是焦距没调好，如果排除这个原因，并且是若干年前买的老机器，请检查滤光片有没有被腐蚀。