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硅水凝胶
硅水凝胶
硅水凝胶,是一种有机高分子材料,有亲水性,具有双位相材料构架,即拥有氟硅和水凝胶两种通道。
常被用来制作高档隐形眼镜。
硅水凝胶隐形眼镜是诺华集团旗下视康公司推出的创新专利镜片。
简介
水凝胶材料的结构可以描述为聚合物的“晾衣绳”。
在这个比喻中,水凝胶是由长长的的线条(即上文提到的“晾衣绳”)组成的,从而使得不同种类的化学基团能够悬浮起来(也就是像“晾衣绳”那样晾在空中)。
类别
接触晶状体材料
化学分子式:
(C103H217N3F36O49Si27)x(C5H9NO)y(C16H38O5Si4)z
结构式:
发展历程
硅水凝胶镜片经历了一、二、三代原材料的发展,每一代原材料并非取代前一种、或在前一种基础上产生。
相反,合金管www.crmo.cc三代原材料因其相互之间不同的化学聚合物、加工工艺和材料性能相互关系,各有其可取之处。
第一代
视康公司:
视康日夜型月抛(LotrafilconA),视康舒视氧月抛(LotrafilconB)
博士伦公司:
纯视月抛(BalafilconA)
第二代
强生公司:
欧舒适两周抛(SenofilconA),亮眸两周抛(GalyfilconA),舒安日抛(NarafilconA和NarafilconB)
第三代
酷柏公司:
佰视明月抛(ComfilconA),艾维娜(国外为两周抛,国内叫月抛,EnfilconA)
沙福隆公司:
Clariti月抛(FilconⅡ3)和Clariti1Day日抛(FilconⅡ3)
海昌公司:
BestBalanceO2++月抛(FilconⅡ3)溶胶或溶液中的胶体粒子或高分子在一定条件下互相连接,形成空间网状结构,结构空隙中充满了作为分散介质的液体(在干凝胶中也可以是气体,干凝胶也称为气凝胶),这样一种特殊的分散体系称作凝胶。
没有流动性。
内部常含有大量液体。
例如血凝胶、琼脂的含水量都可达99%以上。
可分为弹性凝胶和脆性凝胶。
弹性凝胶失去分散介质后,体积显著缩小,而当重新吸收分散介质时,体积又重新膨胀,例如明胶等。
脆性凝胶失去或重新吸收分散介质时,形状和体积都不改变,例如硅胶等。
由溶液或溶胶形成凝胶的过程称为胶凝作用(gelation)。
生物
生物分子下游纯化的对象一般包括蛋白、酶、重组蛋白、单抗、抗体及抗原、肽类、病毒、核酸等。
纯化前首先需要测定生物分子的各物理和化学特性,然后通过实验选择出最有效的纯化流程。
各种凝胶
1.测定——分子量、PI
当目标蛋白的物理特性如分子量、PI等都不清楚时,可用PAGE电泳方法或层析方法加以测定。
分离范围广阔的SuperoseHR预装柱很适合测定未知蛋白的分子量。
用少量离子交换介质在多个含不同PH缓冲液的试管中,可简易地测出PI,并选择纯化用缓冲液的最佳PH。
2.选择——层析方法
若对目标蛋白的特性或样品成分不太了解,可尝试几种不同的纯化方法:
一使用最通用的凝胶过滤方法,选择分离范围广阔的介质如Superose、SephacrylHR依据分子量将样品分成不同组份。
二用含专一配体或抗体的亲和层析介质结合目标蛋白。
亦可用各种活化偶联介质偶联目标蛋白的底物、受体等自制亲和介质,再用以结合目标蛋白。
一步即可得到高纯度样品。
三体积大的样品,往往使用离子交换层析加以浓缩及粗纯化。
高盐洗脱的样品,可再用疏水层析纯化。
疏水层析利用高盐吸附、低盐洗脱的原理,洗脱样品又可直接上离子交换等吸附性层析。
两种方法常被交替使用于纯化流程中。
3.纯化——大量粗品
处理大量原液时,为避免堵塞柱子,一般使用sepharosebigbeads、sepharoseXL、sepharosefastflow等大颗粒离子交换介质。
扩张柱床吸附技术利用多种STREAMLINE介质,直接从含破碎细胞或组织萃取物的发酵液中俘获蛋白。
将离心、超滤、初纯化结合为一。
提高回收率,缩短纯化周期。
4.纯化——硫酸氨样品
硫酸氨沉淀方法常被用来初步净化样品,经处理过的样本处于高盐状态下,很适合直接上疏水层析。
若作离子交换,需先用SephadexG-25脱盐。
疏水层析是较新技术,随着介质种类不断增多,渐被融入各生产工艺中。
利用HitrapHICTestKit和RESOURCEHICTestKit可在八种疏水介质中选择最适合介质及最佳的纯化条件。
低盐洗脱的样品可稍加稀释或直接上其它吸附性层析。
5.纯化——糖类分子
固化外源凝订素如刀豆球蛋白、花生、大麦等凝集素,可结合碳水化合物的糖类残基,很适合用作分离糖化细胞膜组份、细胞、甚至亚细胞细胞器,纯化糖蛋白等。
两种附上外源凝集素的Sepharose6MB亲和层析介质,专为俘获整个细胞或大复合物,如膜囊等。
6.纯化——膜蛋白
膜蛋白分离常使用去污剂以保持其活性。
离子性去污剂应选用与目标蛋白相反电荷者,避免在作离子交换时和目标蛋白竞争交换介质,籍此除去去污剂。
非离子性去污剂可以疏水层析除去。
7.纯化——单抗、抗原
单抗多为IgG.来源主要是腹水和融合瘤培养上清液。
在培养前除去IgG.重组蛋白A介质Mabselect和rProteinASepharoseFF对IgG有更高的载量和专一性,基团脱落更少。
脱落的rProteinA用离子交换QSepharoseHP或凝胶过滤Superdex200,很容易去除。
疏水层析PhenylSepharoseHP亦很适合纯化IgG.宿主抗体和污染IgG可用凝胶过滤Superdex200在精细纯化中去除。
纯化IgG抗原最有效的方法是用活化偶联介质如CNBr、NHsactivatedSepharoseFF偶联IgG,再进一步获取IgG抗原。
HiTrapIgM是用来纯化融合瘤细胞培养的单抗IgM,结合量达5mgIgM.HiTrapIgY是专门用来纯化IgY,结合量达100mg纯IgY.
8.纯化——重组蛋白
重组蛋白在设计、构建时应已融入纯化构想。
样品多夹杂了破碎细胞或溶解产物,扩张柱床吸附技术STREAMLINE便很适合做粗分离。
Amershambiosciences提供三个快速表达、一步纯化的融合系统。
一GST融合载体使要表达的蛋白和谷胱甘肽S转移酶一起表达,然后利用GlutathioneSepharose4B作亲和层析纯化,再利用凝血酶或因子Xa切开。
2.蛋白A融合载体使要表达的蛋白和蛋白A的IgG结合部位融合在一起表达,以IgGSepharose6FF纯化。
二含组氨酸标记(Histidine-tagged)的融合蛋白可用ChelatingSepharoseFF螯合Ni2+金属,在一般或变性条件(8M尿素)下透过组氨酸螯合融合蛋白。
HisTrap试剂盒提供整套His-Tag蛋白的纯化方法。
9.纯化——包涵体蛋白
包涵体蛋白往往需溶于6M盐酸胍或8M尿素中。
一般包涵体蛋白样品的纯度越高,复性效果越好。
SOURCE30RPC反相层析介质很适合纯化复性前的粗品,并可以1MnaOH重生。
此方法纯化后的包涵体蛋白,复性回收率明显提高。
10.包涵体蛋白固相复性
许多文献报导将包涵体蛋白在变性条件下固定(吸附)在层析介质上,一般用各种SepharoseFF离子交换层析介质。
而且无需大量稀释样品,并将复性和初纯化合二为一,大大节省时间及提高回收率。
固相复性方法也被用于以HiTrapChelating金属螯合层析直接复性及纯化包涵体形式表达的组氨酸融合蛋白;以HiTrapHeparin肝素亲和层析直接复性及纯化包涵体形式表达的含多个赖氨酸的融合蛋白。
两种亲和层析预装柱均可反复多次重复使用,比一般试剂盒更方便、耐用。
11.纯化——中草药有效成分
中药的化学成分极其复杂。
例:
如用甲醇分离黄酮甙,三糖甙先被洗下来,二糖甙其次,单糖甙随后,最后是甙元。
SephadexLH-20可使用水、醇、丙酮、氯仿等各种试剂,广泛用于各种天然产物的分离,包括生物碱、甙、黄酮、醌类、内脂、萜类、甾类等。
生物碱在酸性缓冲液中带正电,成为盐,HiTrapSP阳离子交换层析柱可以分离许多结构非常近似的生物碱。
相反,黄酮、蒽醌、皂甙、有机酸等可溶于偏碱的缓冲液中,在HiTrapQ阴离子交换柱上分离效果良好。
一般多糖纯化大多使用分子筛如Sephadex,Sephacryl.若分子量在600KD以下,并需更高分辨率,可选择新一代的Superdex.一般植物可能含水溶性、酸溶性、碱溶性多种多糖。
SOURCE5、15、30RPC反相层析也很适合各种中药有效成分的检测、分离和放大制备。
由于中药的成分非常复杂,SOURCE反相层析可用范围为PH1-14,并可用1MNaOH,1MHCL清洗、再生。
比传统硅胶反相层析更易于工艺优化及在位清洗,寿命也更长。
12.纯化——肽类
肽类的来源有天然萃取,合成肽和重组肽三种。
肽容易被酶降解,但可从有机溶剂或促溶剂中复性,所以多以高选择性的反相层析如SOURCE30RPC、SOURCE15RPC、SOURCE5RPC或离子交换Minibeads、Monobeads作纯化。
SuperdexPeptideHR是专为肽分子纯化设计的凝胶过滤预装柱,能配合反相层析做出更精美的肽图。
肽分子制备可用离子交换配合凝胶过滤Superdex30PG。
医学都市多功能
13.纯化——核酸、病毒
核酸的纯化用于去除影响测序或PCR污染物等研究。
核酸可大致上分为质粒DNA、噬菌体DNA和PCR产物等。
病毒也可视作核酸大分子,和质粒DNA一样,可用分离大分子的SephacryS-1000SF、Superose或Sepharoce4FF凝胶过滤介质去除杂蛋白,再配合离子交换如MonoQ、SOURCEQ分离核酸。
14.纯化——寡核苷酸寡酸苷酸
多应用在反义(anti-sense)DNA、RNA测序、PCR和cDNA合成等研究。
合成后含三苯甲基的寡核苷酸以阴离子交换的MonoQ或快速低反压的SOURCEQ在PH12下可除副产物,并避免凝集和保护基的脱落。
载量大大高过反相层析,可用做大量制备。
不含三苯甲基的失败序列可用反相柱ProRPC去除。
15.脱盐、小分子去除
使用凝胶过滤介质SephadexG10,G15,G25,G50等去除小分子,效率高,处理量可达床体积30%.只需在进样后收集首1/3-1/2柱体积的洗脱液,HiPrepDesalting(26ml)可在数分钟为多至10ml样品脱盐。
16.疫苗纯化
使用凝胶过滤介质Sepharose4FF纯化疫苗,去除培养基中的杂蛋白,处理量可大于床体积10%.柱高一般40-70cm,整个过程约半至一小时。
使用此法生产的疫苗品种有乙肝、狂犬、出血热、流感、肺结核、小儿麻痹疫苗等。
分子量较小的疫苗可使用SephacrylS-500HR,如甲肝疫苗等。
17.抗生素聚合物分析
中国药典从2000年版起要求抗生素头孢曲松钠需要找出聚合物占产品的白分比,规定使用SephadexG10凝胶过滤法测定。
18.纯化-基因治疗用病毒载体
SORRCE15Q
19.纯化-基因治疗用质粒
QSepharoseXL,SOURCE15Q,STREAMLINEQ,SephacrylS500,Plasmidselect在下游纯化中,可应用不同层析技术在纯化生物分子的同时,去除各种污染物。
去除病毒
1.去除——内毒素
内毒素又称热原。
含脂肪A、糖类和蛋白,是带负电的复合大分子。
内毒素的脂肪A部份有很强的疏水性。
但在高盐下会凝集,无法上疏水层析。
利用疏水层析试验盒(17-1349-01)可选择结合目标蛋白的介质而去除内毒素。
内毒素与阴离子交换介质Q或DEAESepharoseFastFlow有较强结合。
可在洗脱目标蛋白后用高盐缓冲液或NaOH去除。
利用CNBr或NHSSepharoseFF可偶联内毒素底物如LAL,PMB,自动成亲合层析介质结合内毒素。
内毒素经常是多聚体,凝胶过滤层析可有效地将之去除。
2.去除——蛋白中的核酸
大量核酸增加样本黏度,令区带扩张,反压增加,降低分辨率和流速。
药审和食检对核酸含量也有严格限制。
胞内表达蛋白的核酸问题尤其严重。
核酸带阴电荷,在初步纯化时利用阳离子交换介质如STREAMLINESP,SPSepharoseBigBeads,SP或CMSepharoseFF,SPSepharoseXL结合目标蛋白,可除去大量核酸。
核酸在高盐下会和蛋白解离,疏水层析介质很适合用来结合目标蛋白,在纯化蛋白的同时去除核酸。
利用核酸酶将核酸切成小片断,用凝胶过滤做精细纯化时便很容易去除了。
3.去除——病毒和微生物
病毒和微生物可成为病原,应尽量减除。
结合不同层析技术,使用注射用水,用NaOH定期进行仪器和凝胶的在位消毒和在位清洗,皆可避免污染物增加。
病毒大都有脂外壳。
可用与目标蛋白电荷相反的S/D(solvent/detergent)处理,使病毒失活,如Triton和Tween.再用适当的离子交换介质如CMSepharoseFF结合目标蛋白,去除S/D.
其它污染物可以改变pH和离子强度使其从目标分子中解离或失活,凝胶过滤介质Superdex及多种吸附性介质,SOURCE都是很好的精细纯化介质,可去除多种微量污染物。
凝胶作用
凝胶是指颗粒大小在1埃到10埃之间的混合物。
高分子溶液和某些溶胶,在适当的条件下,整个体系会转变成一种弹性的半固体状态的稠厚物质,失去流动性。
这种现象称为胶凝作用,所形成的产物叫做凝胶或冻胶.
“气凝胶”是指分散系为气态的,如:
云,雾等,“固凝胶”有烟水晶等,“液凝胶”就是呈液态的胶体,如氢氧化铁胶体。
举例
食品级葡甘露胶(GumKonjac-GM)
葡甘露胶(又称:
魔芋胶)系一种新型多用途微粒状可食用胶。
这里推出之葡甘露胶是以优质魔芋中提取的葡萄甘露聚糖为原料保持或强化了葡萄甘露聚糖所具有的降糖、降脂、减肥等保健功能,大大拓宽了魔芋应用的范围;价格低廉、使用方便。
葡甘露胶能广泛用于食品、饮料、医药、日用化工、科研等领域,作为琼脂、果胶、海藻胶等的替代产品,价格低廉,且使用时无需改变原有的设备及工艺,能大幅度降低添加剂的使用成本,是一种理想的新型凝胶添加剂。
为满足不同产品开发的需要:
一、凝胶(果冻)型:
能与各种天然果汁、物料及色素良好混合,作为广谱凝胶赋型剂,是制作果冻、水晶软糖等的极佳原料,也可作为培养基支持体,且不需再添加其它任何胶类或碱性成份;凝胶成型条件随意、脱杯完整,凝胶强度高、韧性大。
用量:
0.7~0.9%。
用法:
在适量温水中溶胀3~5分钟,煮沸冷至70度左右时加入糖及各种配料,冷却至室温即成。
二、培养基型:
用作替代琼脂作为花卉及其它植物进行组织培养的支持体。
组培苗根粗、苗壮,使用效果理想,成本大幅降低。
用量:
0.5~0.6%。
用法:
在温水中溶胀3~5分钟,煮沸后冷却即可。
三、果肉(茶)饮料型:
作为稳定剂与悬浮剂,替代琼脂和羧甲基纤维素等,广泛用于粒粒橙、果茶、果汁、豆奶、银耳羹、八宝粥等异相悬浮剂等(或混合)饮料中,防止沉淀或分层。
用量:
0.15~0.25%左右。
用法:
在适量温水中充分溶胀后加入物料中。
四、冷冻制品型:
用于冰棒、冰淇淋等各种冷冻制品,可增大膨胀,减少冰晶,提高抗热融性,使产品更加爽口。
用量:
0.15到0.25%左右。
用法:
在适量温水中充分溶胀,然后加入物料中。
五、增稠型:
用于果酱、米、面制品中,可增大膨胀率,提高韧性,改善赋型和口感。
是进口洋槐豆胶的理想替代物。
用量:
0.2~0.3%左右。
用法:
在适量温水中充分溶胀后加入物料中。
凝胶糖果
在凝胶糖果生产制造中,怎样才能够合理使用复配胶呢?
制作过程
首先,我们应该弄清相关的凝胶糖果制造的基本机理和凝胶剂之间的协同增效作用;其次是如何选择具有协同增效作用的凝胶剂进行合理的复配。
否则,只将会事倍功半,甚至于会产生凝胶剂之间的拮抗作用,阻碍凝胶的形成,也就谈不上凝胶糖果的生产制造。
凝胶糖果可以看作是一种糖果溶液的凝胶体,而凝胶体的形成取决于凝胶剂的水合作用。
因此,所有用于糖果的凝胶剂都必须是亲水性的胶体,当胶体分子的亲水基(-OH,-COOH等),吸持一定量的水份而形成水合作用,水作为溶剂分子覆盖其上形成水化层,同时,胶体分子的非亲水基(-CH3、-CH2等)产生分子间的相互吸引力。
有助于将单一胶粒形成线状分子并进而聚集成束状胶团。
如果在形成凝胶状态的时候,我们将熬煮浓缩成一定浓度的糖浆加入,则糖类物质——多种碳水化合物的浓缩糖浆均匀地填满充实在凝胶错综复杂的网络空隙里,并使之固定化下来,从而形成一种非常稳定的含糖的凝胶。
即使给予它较大的外来压力,也不会将其糖分子或水分子析出。
如果我们再将其放置在一定的温、湿度的环境中,让体系内水分子进一步扩散、逃逸、蒸发。
我们将得到的是质构非常坚固与紧密的含糖的凝胶体——凝胶糖果。
制造差别
不同的凝胶糖果的制造,其影响因素,工艺条件很多,成因又非常的复杂,这主要是因为不同凝胶剂的类型,分子结构,物理化学的性质都有很大的差异,优选复配胶的最佳组合和它们最佳的组合比例。
现以琼脂凝胶糖果为例。
在许多的凝胶剂中,槐豆胶、角豆胶、黄原胶和明胶均与琼脂之间存在着协同增效作用。
只是它们的增效程度和最佳添加比例范围不同,而瓜尔胶和果胶都与琼脂之间会产生拮抗作用。
这主要是由于它们的分子结构所决定的。
槐豆胶、角豆胶都是半乳甘露聚糖构成,以甘露糖残基为主链,平均每隔4个毗邻的甘露糖残基就连接一个半乳残基支链,但支链倾向于连接在一系列连续的甘露糖残基上形成“手发链段”和“光秃链段”,与琼脂双螺旋结合,交联,产生叠加增效效应。
在淀粉型糖果配料中,如果添加0.05%的黄原胶,可以改进加工性能,即在熬煮好混合糖液后,便可以立即急剧冷却成凝胶,大大缩短了凝胶形成时间,为改变传统的烘房干燥工艺创造了良好的条件。
如果将明胶和魔芋甘露胶按3~4:
1进行复配制造凝胶糖果,则可制得口感柔润、咀嚼性好,富有弹性,更光亮透明的明胶凝胶糖果。
原理方法
Native-PAGE原理
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)是在不加入SDS疏基乙醇等变性剂的条件下,对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,常用于同工酶的鉴定和提纯。
未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳可以使生物大分子在电泳过程中保持其天然的形状和电,电泳后将凝胶切成两半,一半用于活性染色,对某个特定的生物大分子进行鉴定,另一半用于所有样品的染色,以分析样品中各种生物大分子的种类和含量。
实验方法
非变性聚丙烯酰胺凝胶和变性sds-page电泳在操作上基本上是相同的,只是非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制和电泳缓冲液中不能含有变性剂如SDS等。
一般蛋白进行非变性凝胶电泳要先分清是碱性还是酸性蛋白。
分离碱性蛋白时候,要利用低pH凝胶系统,分离酸性蛋白时候,要利用高pH凝胶系统。
酸性蛋白通常在非变性凝胶电泳中采用的pH是8.8的缓冲系统,蛋白会带负电荷,蛋白会相阳极移动;而碱性蛋白通常电泳是在微酸性环境下进行,蛋白带正电荷,这时候需要将阴极和阳极倒置才可以电泳分离酸性蛋白。
工作液配制
1.40%胶贮液(Acr:
Bis=29:
1);
2.4×分离胶Buf(1.5MTris-HCl,pH8.8):
18.2gTrisbase溶于ml水,用浓HCl调pH8.8,加水定容到100ml,4℃贮存;
3.4×堆积胶Buf(0.5MTris-HCl,pH6.8):
6gTrisbase溶于80ml水,用浓HCl调pH6.8,加水定容到100ml,4℃贮存;
4.10×电泳Buf(pH8.8Tris-Gly):
30.3gTrisbase,144g甘氨酸,加水定容到L,4℃贮存;
5.2×溴酚蓝上样Buf:
1.25mlpH6.8,0.5MTris-Cl,3.0ml甘油,.2ml0.5%溴酚蓝,5.5mldH2O;-20℃贮存;
6.10%APS;
7.0.25%考马斯亮蓝染色液:
CoomassieblueR-2502.5g,甲醇ml,HAc100ml,dH2O450ml;
8.考马斯亮蓝脱色液:
100ml甲醇,100冰醋酸,800mldH2O
电泳胶的配制及电泳条件(上槽电极为负,下槽电极为正)
1.碱性非变性胶17%分离胶(10ml)4%堆积胶(5ml)
2.40%胶贮液(40%T,3.3%C)4.25ml0.5ml
3.4×分离胶Buf(1.5MTris-HCl,pH8.8)2.5ml
4.4×堆积胶Buf(0.5MTris-HCl,pH6.8)1.25ml
5.水3.2ml
6.10%APS35ul
7.TEMED15ul
8.10×电泳Buf(pH8.8Tris-Gly):
100ml稀释到L
电泳条件:
100V恒压约20min,指示剂进入浓缩胶;改换160V恒压,当指示剂移动到胶板底部时,停止电泳,整个过程约80min。
染色和脱色:
取出胶板于0.25%考马斯亮蓝染色液中染色约30min,倾出染色液,加入考马斯亮蓝脱色液,缓慢摇动,注意更换脱色液,直至胶板干净清晰背景。
也可以用银染或者活性染色。
分离碱性蛋白
要用低pH凝胶系统,并使用以下缓冲液体系:
1.分离胶:
0.06MKOH,0.376MAc,pH4.3(7.7%T,2.67%C);
2.堆积胶:
0.06MKOH,0.063MAc,pH6.8(3.125%T,25%C);
3.电泳缓冲液:
0.14M2-丙氨酸,0.35MAc,pH4.5
将正负电极倒置,用甲基绿(0.002%)为示踪剂
实验操作同分离酸性蛋白。
PAGE的分类
非变性凝胶电泳,也称为天然凝胶电泳,与非变性凝胶电泳最大的区别就在于蛋白在电泳过程中和电泳后都不会变性。
最主要的有以下几点:
1.凝胶的配置中非变性凝胶不能加入SDS,而变性凝胶的有SDS。
2.电泳载样缓冲液中非变性凝胶的不仅没有SDS,也没有巯基乙醇。
3.在非变性凝胶中蛋白质的分离取决于它所带的电荷以及分子大小,不像SDS-PAGE电泳中蛋白质分离只与其分子量有关。
4.非变性凝胶电泳中,酸性蛋白和碱性蛋白的分离是完全不同的,不像SDS-PAGE中所有蛋白都朝正极泳动。
非变性凝胶电泳中碱性蛋白通常是在微
酸性环境下进行,蛋白带正电荷,需要将阴极和阳极倒置才可以电泳。
5.因为是非变性凝胶电泳,所有的电泳时候电流不能太大,以免电泳时产生的热量太多导致蛋白变性,而且步骤都要在0-4度的条件下进行,这样才可以保持蛋白质的活性,也可以降低蛋白质的水解作用。
这点跟变性电泳也不一样。
所以与SDS-PAGE电泳相比,非变性凝胶大大降低了蛋白质变性发生的机率。
问题和解答
1.非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时预电泳是怎么回事的?
预电泳时要加6×DNA上样缓冲液吗?
电泳1-2小时再加结合反应产物吗?
预电泳是除去凝胶中没有聚合的单体和双体和聚合引发剂,提高分辨率,不加任何物质,一般30-60分钟后加样电泳。
2.银染的步骤是什么?
银染的关键因素是什么?
步骤是:
(1)固定:
10%冰乙酸min。
(2)清洗:
双蒸水冲洗凝胶次,每次1min。
(3)染色:
染色液(1g硝酸银,.5mL37%甲醛,1L双蒸水。
现配)染色30min。
(4)清洗:
迅
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- 凝胶