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132基于PLGA纳米粒子抗肿瘤药物
基于PLGA纳米粒子抗肿瘤药物
高分子纳米药物根据其制备原料的来源可分为两大类:
第一类为基于天然存在的高分子
材料制备的纳米药物,包括基于蛋白质类:
胶原(Collagen),白蛋白(Albumin),明胶(Gelatin)以及聚多糖类:
琼脂糖(Agarose),透明质酸(HA),葡聚糖(Dextran),壳聚糖(Chitosan)和环糊精(Cyclodextrins)等天然材料制备的纳米药物,如:
白蛋白结合型紫杉醇(PTX)
纳米药物Abraxane在2005年被批准用于治疗转移性胰腺癌和肺癌;CRLX-101是基于环糊
精的喜树碱纳米药物,目前在临床二期研究阶段。
第二类是基于人工合成的高分子材料制备的纳米药物,包括基于聚(丙交酯-乙交酯)(PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚乙交酯(PGA)、
聚己内酯(PCL)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚磷酸酉旨Poly(phosphoesters)、聚氰基丙烯酸烷基酯(PACAs)、聚原酸酯(POE)、聚酰胺Poly(amides)、聚酯酰胺(PEAs)以及聚氨基酸Poly(aminoacids)等制备的纳米药物,如:
PEG化的脂质体阿霉素(DOX)
Doxil于1995年被USFDA批准上市,用于治疗乳腺癌、卵巢癌、骨髓瘤以及艾滋病相关性卡波西肉瘤;基于PEG-PLA的PTX纳米药物Genexol-PM于2007年在韩国被批准用于乳腺癌、肺癌以及卵巢癌的治疗;NC-6004(Nanoplatin)是基于PEG-PGA的顺铂纳米药物,正处于临床一期研究阶段,另外其用于胰腺癌的临床三期实验也在进行中;NK911是基于
Poly(ethyleneglycol)-b-poly(asparticacid)(PEG-PAA)的DOX前药纳米药物;基于PEG-PLA的主动靶向性多西他赛(DTX)纳米药物BIND-014靶向到前列腺特异性膜抗原(PMSA),
用于治疗前列腺癌、非小细胞肺癌、宫颈癌、膀胱癌以及头颈癌的研究处于临床II期。
基于人工合成的高分子纳米药物由于其化学性质稳定、可规模化生产、便于化学修饰,
在癌症的治疗中取得了令人振奋的成果。
人工合成的高分子具有较高的均一性以及纯度,使
得纳米药物的制备具有较高的可重复性。
在众多的合成高分子材料中,PLGA由于具有良好
的生物相容性以及生物可降解性,被广泛应用于生物组织工程以及抗癌药物输送体系。
1基于PLGA的纳米抗癌药物的制备
PLGA是众多聚合物中在生物医学领域应用最为广泛的一种合成高分子材料。
由于其具
有优异的生物相容性和生物可降解性,被USFDA和欧盟医药管理局(EMA)批准用于制
备多种药物的体内递送系统。
PLGA由丙交酯和乙交酯两种单体在辛酸亚锡或者异丙醇铝等催化剂的催化作用下通过无规开环共聚制备得到。
丙交酯和乙交酯单元通过酯键连接在一起,在聚合过程中调节丙
交酯和乙交酯的比例可得到组成不同的聚合物,例如PLGA50:
50(表示聚合物由50%的丙
交酯和50%的乙交酯构成),PLGA75:
25、PLGA85:
15等。
PLGA的降解主要是聚合物链中
酯键的水解引起的,不同分子量以及单体比例的PLGA的降解时间为几天到几个月甚至几
年不等。
通常丙交酯含量较低的低分子量PLGA的降解速率较快,可能是因为乙交酯的亲
水性较强,容易吸收大量的水分,促进聚合物的降解。
另外聚合物末端的基团也会影响其降
解的速率,羧基封端的PLGA的降解速率快于羟基封端的PLGA。
通过调节PLGA的分子
量、丙交酯和乙交酯的比例以及其末端基团可以控制聚合物的降解速率。
PLGA通过水解产
生两种代谢产物:
乳酸和羟基乙酸(Figure1.3),这两种分子在体内通过Krebs循环被代谢
掉,不会产生任何系统副作用,保证了体内使用的安全性。
PLGA
IMibcW
PathMiy*
Figure1.3StructureandhydrolysisofPLGA.
1.1常规PLGA纳米药物
采用不同的制备方法,可以实现PLGA纳米载体对多种药物,包括小分子亲水或疏水
药物、大分子蛋白类药物、生物类的核酸药物DNA和RNA的包载。
此外,通过使用不同
单体比例组成、不同分子量或者不同末端基团PLGA制备的纳米抗癌药物,可以实现对药
物的控制释放。
PLGA纳米粒子主要通过乳化-溶剂挥发法、乳化-溶剂扩散法、乳化-反向盐析法、透析法、喷雾干燥法以及纳米沉淀法制备得到。
接下来将详细介绍每种制备方法的过
程、使用条件以及优缺点。
孚L化-溶剂挥发法包括单乳化法和双乳化法两种,单乳化(水包油)法:
将PLGA和药
物共同溶解在具有挥发性的有机溶剂,如二氯甲烷、氯仿或者乙腈中,然后将该溶液加入到
持续搅拌的包含有表面活性剂,如聚乙烯醇(PVA)、吐温80、泊洛沙姆188或者维生素E
聚乙二醇琥珀酸酯(VitaminE-TPGS)的水溶液中,产生稳定的乳液。
随后通过升高温度、降低压力或者持续磁力搅拌的方法将有机溶剂除去,适用于制备包载亲脂性药物分子如
PTX、DTX、DOX等。
双乳化(水包油包水)法:
将药物溶解在去离子水中并且滴加至强力搅拌的溶解有PLGA的挥发性有机相中,形成油包水的初始乳液,随后将该乳液加入到水溶液中经磁力搅拌形成最终的乳液,最后将有机溶剂通过挥发法除去,适用于包载亲水性
溶剂扩散法:
通过高速匀浆将溶解有聚合物和药物的有机相在含有表面活性剂的水溶液中进
行乳化,有机相和水相在室温条件下形成互相饱和的热力学平衡体系,随后在均匀搅拌下加
入大量的水形成胶体纳米粒子,通过挥发或者旋蒸的方法除去有机溶剂。
该方法制备的纳米粒子具有以下优点:
药物包载率高、可重复性强、易于量产、纳米粒子分布窄、制备简便。
缺点主要是对水溶性的药物包载不理想,容易泄露并且需要除去大量的水。
孚L化-反反向
盐析法:
将聚合物和药物同时溶解在与水互溶的有机溶剂中,随后将其加入到强力搅拌的溶
解有盐析试剂和乳化剂的水溶液中,形成水包油的乳液。
随后加入大量的水,挥发性有机溶
剂将会扩散至水相中,促进纳米粒子的形成。
残留的有机溶剂以及盐析试剂通过过滤的方法除去。
该方法适用于对热不稳定的药物如蛋白质、DNA、RNA的制备。
透析法:
透析法可
以制备粒径较小且分布较窄的纳米粒子。
将聚合物溶解在挥发性的有机相中,随后将其转入
透析袋中,透析袋中的有机相将被置换为水,聚合物的溶解性降低,逐步聚集最终形成均一
的纳米粒子溶液。
喷雾干燥法:
该方法可以作为制备聚合物纳米粒子的常规方法的替代。
在制备的过程中,油包水的分散液经过热空气流喷射形成纳米粒子。
该方法制备纳米粒子的
缺点是纳米粒子将会粘附在干燥喷雾器的内壁,降低了纳米粒子的回收效率。
纳米沉淀法:
又称溶剂置换法,这种方法简便易操作,只需一步操作,适用于包裹疏水性的药物分子。
将
聚合物和药物分子溶解在与水互溶的极性有机相,如丙酮、乙醇、甲醇或者乙腈中,将有机
相逐滴滴加到含有乳化剂或者表面活性剂的水溶液中,有机溶剂快速地扩散出来,形成纳米
粒子。
很多研究表明PLGA纳米粒子一旦经尾静脉注射进入体内后会与血液中存在的调理素
蛋白结合,随后被巨噬细胞吞噬,最终纳米粒子将会通过人体的网状内皮系统(RES)清除。
为了避免PLGA纳米粒子被RES清除,研究人员设计了不同的策略对PLGA纳米粒子进行
表面改性。
在PLGA纳米粒子的表面覆盖一层亲水性的分子或者利用生物体内本身存在的物质将PLAG纳米粒子伪装”成体内的内源性物质,可以有效避免RES对PLGA纳米粒子
的清除。
1.2PEG改性的PLGA纳米药物
PEG是最常用于纳米粒子表面改性的亲水性聚合物,其具有优异的生物相容性。
PEG
化作用能够有效地降低纳米粒子与血液中蛋白的结合,显著提高纳米粒子的稳定性、延长体
内循环时间,从而增加纳米药物在肿瘤组织的富集。
将PLGA纳米粒子表面PEG化有两种
方法,一种是通过化学键直接将PEG与PLGA键合在一起,制备双亲性的聚合物如
PEG-PLGA、PLGA-PEG-PLGA或者PEG-PLGA-PEG,然后通过聚合物的自组装形成PLGA
为核PEG为壳的纳米粒子。
例如,Haddadi报道了一种由两嵌段聚合物PEG-PLGA通过在
水溶液中组装形成的PLGA纳米粒子(PLGA-PEGNPs)。
装载DTX后纳米粒子显著延长了药物的半衰期,其t1/2分别是PLGA包载的DTX以及自由DTX的2.62倍和3.69倍。
Chen报道了PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物胶束包载穿心莲内酯(ADG),用于药物的细胞内递
送。
胶束包载的ADG具有更高的生物利用率,相对于自由ADG,其药时曲线下面积(AUC)
和血浆平均停留时间分别提高了2.7倍和2.5倍,说明包载ADG的胶束极大地改善了药物
的生物利用度。
此外,载药胶束对MDA-MB-231细胞表现出了较强的细胞增殖抑制作用以
及促进细胞凋亡的效果。
另外一种方法是将含有PEG的两亲性聚合物与PLGA通过共组装
或者后修饰的方式包被在PLGA纳米粒子的表面。
Zhang等报道了由PLGA、二硬脂酰磷脂
酰乙醇胺(DSPE)与mPEG-DSPE通过一步纳米沉淀法制备的纳米粒子(PLGA-Lipid-PEG
NP)(Figure1.4)。
同时制备了由PEG-PLGA自组装形成的PLGA-PEGNP以及表面未经过修饰的PLGA纳米粒子PLGANP作为对照组。
在含有10%人血清白蛋白的介质中孵育60min
后,PLGA-Lipid-PEGNP以及PLGA-PEGNP粒径基本保持稳定,而PLGANP的粒径从90
nm增大至200-300nm。
将PEG修饰在PLGA纳米粒子表面后,显著减少了纳米粒子对蛋白的吸附,增强了其在血液中的稳定性。
Figure1.4Developmentoflipidpolymerhybridnanoparticles(NPs).(A)SchematicillustrationshowstheformulationoflipidpolymerhybridNPs.TheNPscompriseahydrophobicPLGA(polylactic-co-glycolicacid)core,ahydrophilicPEG(polyethyleneglycol)shell,andalipid(lecithin)monolayerattheinterfaceofthehydrophobiccoreandthehydrophilicshell.(B)Transmissionelectronmicroscopy(TEM)imagedemonstratedthestructureofthehybridNPsproposedin(A).
VitaminE-TPGS是一种水溶性的PEG衍生物,在制备PLGA纳米粒子时通常被用做表面活性剂,不仅可以增强PLGA纳米粒子的稳定性而且可以增加对药物的包载效率。
Feng
报道了VitaminE-TPGS孚L化制备的PLGA纳米粒子用于抗癌药物DTX的高效包载以及肿瘤
递送,PLGA-b-TPGS对DTX的包载效率为85.91%,明显高于PLGA(78.36%),并且具有较
强的抑制细胞增殖的能力其半数抑制浓度(IC50)为0.33冯/mL相对于自由DTX其细胞毒
性提高了32倍。
1.3多糖及蛋白改性的PLGA纳米药物
将生物相容性良好的天然聚多糖包括HA、Dextran、Chitosan等,以及一些人体内的内
源性物质如人血清白蛋白(HSA)修饰到PLGA纳米粒子的表面也可以改善其表面性质,降低蛋白吸附,延长纳米药物的循环时间提高抗肿瘤效果。
例如,Du报道了基于两亲性共
聚物Dex-PLGA制备的胶束包载PTX用于肿瘤的递送。
Dex-PLGA/PTX相对于自由PTX,
对多种癌细胞如SKOV-3、0VCAR-8以及MCF-7细胞表现出较强的抗细胞增殖作用。
此外,该载药胶束显著提高了药物的体内最大耐受剂量(MTD>200mgPTX/kg),相对于自由PTX
提高了8倍。
体内抗肿瘤实验结果表明,Dex-PLGA/PTX能够有效抑制肿瘤的生长以及显著
降低药物的毒副作用,而且在高剂量药物作用下可以完全消除肿瘤。
Dinarvand报道了HSA
表面修饰过的PLGA纳米粒子,能够有效地将PTX运送至T47D乳腺癌细胞中。
当PTX浓度为15nM时,细胞的存活率为43%,细胞杀伤力明显强于自由PTX、未经HSA修饰的载
PTX纳米粒子。
1.4细胞膜“伪装”的的PLGA纳米药物
将细胞膜包被在PLGA纳米粒子表面制备得到细胞膜伪装”的PLGA纳米药物,不仅
能够显著延长药物的循环时间,而且可赋予纳米粒子主动靶向功能,提高癌细胞对纳米粒子
的摄取量,进而增强PLGA纳米药物的抗肿瘤治疗效果。
近些年来,研究者们制备了不同
细胞膜,主要包括红细胞膜、癌细胞膜、血小板膜伪装的PLGA纳米药物用于多种癌症的
治疗。
其制备过程主要包含细胞膜的提取、纳米粒子的制备以及细胞膜和纳米粒子的融合。
例如,Figured5是红细胞膜(RBC)包被的PLGA纳米药物的制备流程图,RBC膜伪装”
的PLGA纳米粒子的循环时间极大地得到延长,为39.6h,经过PEG进行表面修饰后的PLGA
纳米粒子的循环时间为15.8hoZhang报道了乳腺癌MDA-MB-435细胞膜包被的PLGA纳
米粒子,显著提高了其对MDA-MB-231细胞的主动靶向能力。
该纳米粒子能够高效的被
MDA-MB-435细胞摄取,摄取量分别是PLGA纳米粒子的40倍和红细胞膜包被的PLGA纳米粒子的20倍。
Liu报道了RBC包被的包载四氟化碳的PLGA纳米粒子(PFC@PLGA-RBCM),经过RBC包被之后,PLGA纳米粒子的稳定性明显得到提高,而且极大地延长了体内循环时间。
PFC具有极高的溶氧气能力,相对于未经过RBC包被的
PLGA纳米粒子(PFC@PLGA),PFC@PLGA-RBCM能够以一种更具有持续性的方式将O2
释放出。
通过TEM可以观察到PFC@PLGA-RBCM的结构在释放O2前后没有发生明显地
变化。
药代动力学研究表明,PFC@PLGA-RBCM具有较长的体内循环时间,约为13.93h,
相对于他们之前报道的白蛋白包被的PLGA纳米粒子的循环时间延长了2倍。
纳米药物的最终目标是将活性药物以自由的分子形式传递到癌细胞内,并发挥其药效。
通常静脉注射到生物体的纳米药物要经历一个五级的级联步骤才能将药物递送到细胞内:
通
过血液的长循环、由EPR效应在肿瘤部位富集、渗透到肿瘤组织深处、内吞进入细胞、细胞内释放药物(Figure1.6)。
因此,尽可能地提高每一个步骤的效率才能实现最佳的药物传递效率。
VCWIMln
Figure1.5Redbloodcell(RBC)membrane-coatedpoly(D,L-lactide-co-glycolide)(PLGA)nanoparticles(NPs).Cellularmembranesprovidearobustnaturalfunctionalitytotheparticle.Incomparativestudieswithpolyethyleneglycol(PEG)-coatedNPs,RBCmembrane-coatedNPsexhibiteda39.6-hhalf-lifecomparedwith15.8hforPEGNPs.
传统纳米药物虽然降低了药物的系统毒副作用,但是其对肿瘤的治疗效果还与理想状态
相差甚远,其原因非常复杂。
PEG化的纳米药物虽然减少了蛋白的吸附,但是由于位阻作
用降低了肿瘤细胞对纳米药物的内吞,纳米药物进入细胞后由于聚合物降解缓慢,导致其释
药速率缓慢,药效不足。
基于此,研究者们设计制备了具有多功能的PLGA纳米抗癌药物
如主动靶向PLGA纳米抗癌药物和刺激响应PLGA纳米抗癌药物,这些纳米抗癌药物在临
床前试验中表现出了良好的抗肿瘤效果,极大地促进了PLGA纳米抗癌药物的发展,为其
临床转化提供了无限的可能。
TheCAPi^ofCancerDrugDelivery
*Tobethere丿Tobefree
〉5乳日戸(:
卅円尺€33£3肓]>Q=QrXQ#XQpXQ『XQ^
Figure1.6AsketchoftheCAPIRcascadeofananomedicinetodeliverafreedrugintocancercells:
circulationinthebloodcompartments,tumoraccumulationandpenetration,andsubsequentcellularinternalizationandintracellulardrugrelease.
2主动靶向PLGA纳米抗癌药物
通过对PLGA纳米粒子进行表面改性可以减弱RES的清除作用,延长其循环时间,提
高纳米粒子在肿瘤组织的富集量。
然而大多数药物需要进入细胞内部才能产生作用,为了促
进纳米药物快速、大量进入细胞内,研究者们在纳米药物的表面修饰具有主动靶向功能的配体来促进细胞的内吞。
在纳米药物的表面修饰肿瘤特异性的配体如抗体、抗体片段、多肽、多糖、适配子、叶酸等,使纳米药物通过受体-配体结合作用介导的内吞方式进入细胞,提
高其在癌细胞内的富集,称为主动靶向(Figure1.7B)。
主动靶向型纳米药物通过增加与细
胞的有效结合、减少非特异性的吸附和摄取以及规避细胞的耐药等作用增加其在肿瘤细胞内的富集。
Figure1.7(A)Passivetargetingofnanocarriersand(B)activetargetingstrategies.Ligandsgraftedatthesurfaceofnanocarriersbindtoreceptorsoverexpressedbycancercellsorangiogenicendothelialcells.
近些年来,研究者们设计了不同靶向配体修饰的PLGA纳米药物用于多种肿瘤的主动
靶向递送,包括表面偶联抗体的PLGA纳米药物、多肽分子修饰的PLGA纳米药物、适配
体修饰的PLGA纳米药物[64-66]、小分子修饰的PLGA纳米药物以及多糖饰的PLGA
纳米药物。
2.1蛋白介导的的PLGA纳米药物
近些年来,抗体、抗体片段、生长因子、转铁蛋白等被用作靶向配体修饰在纳米药物的
表面以制备主动靶向纳米药物。
抗体及其衍生物对其靶点具有非常高的特异性亲和力,在过
去的几十年中,单克隆抗体在癌症治疗中得到了广泛地应用。
很多抗体被用作靶向分子,例
如用于形成抗体-药物偶联物(ADCs)以及修饰在纳米粒子表面。
Benita报道了表面偶联西
妥昔单抗、包载了一种PTX前药的PLGA纳米粒子,用于EGFR过表达的非小细胞肺癌的
靶向治疗。
CLSM结果显示,孵育4h后,包载香豆素6的纳米粒子在A549细胞的细胞质中显示出明显的荧光信号,相对于无靶向的纳米粒子,细胞对表面偶连了西妥昔单抗的纳米粒子的摄取量更多。
在加入单抗对细胞进行预处理之后,纳米粒子荧光强度减弱,证明细胞
对纳米粒子的摄取受到了抑制。
荷瘤小鼠体内抑瘤实验结果显示,在接种之后的56天内,
相对于非靶向载药纳米粒子、自由药物,靶向载药纳米粒子具有显著提高的肿瘤抑制效果
(**p<0.05),并且显著延长了小鼠生存率(***p<0.001)°Du制备了CA19-9抗体修饰的、
基于PEG-PLGA-PLL聚合物的、包载PTX的纳米粒子(PTX-NPs-antiCA19-9),联合超声介导微泡摧毁(UMMD)技术用于胰腺癌的靶向治疗。
CCK-8实验结果显示,PTX-NPs-antiCA19-9对人胰腺癌Capan-1细胞具有较强的杀伤能力,孵育48h后,其IC50为6.408g/mL,而无靶向PTX-NPs为21.316/g/mL。
将细胞预先经过自由的抗体处理过之后,再加入PTX-NPs-antiCA19-9孵育,其IC50与无靶向组相当为26.581/g/mL。
此外,PTX-NPs-antiCA19-9联合UMMD对细胞产生最强的杀伤作用,其IC50为3.219/g/mL。
PTX-NPs-antiCA19-9和PTX-NPs都具有较长的循环时间分别为36.10和29.20h较自由PTX显著延长。
在胰腺癌小鼠移植瘤模型体内抗肿瘤实验中,PTX-NPs-antiCA19-9表现出较好的抑瘤效果,其抑瘤率为82.99%,高于PTX-NPs(62.24%)和自由PTX(16.02%)治疗组,并且显著延长了小鼠的生存时间,其中位生存期为63天,而PTX-NPs和自由PTX治疗组分别为51和43天。
另外,PTX-NPs-antiCA19-9联合UMMD具更好的体内抗肿瘤效果,其抑瘤率为90.51%,小鼠中位生存期为75天。
2.2多肽的介导的PLGA纳米药物与蛋白相比,多肽具有更多的优势,例如生产成本低、稳定性好、易于大规模生产、操作简便以及较低的免疫原反应。
而且,多肽与纳米粒子的偶联可以被精确地控制。
近年来,RGD、GE11、cNGQ、iRGD、A6、T7、Angiopep-2以及Tlyp-1肽等多肽被发现对多种肿瘤细胞具有靶向性,被用作靶向配体修饰在纳米药物的表面。
例如,Jiang设计制备了一种T7
修饰的、包载卡莫司汀(BCNU)的PEG-PLGA胶束用于脑胶质瘤的靶向治疗。
MTT结果显示,在U87细胞中孵育24h后,T7-PEG-PLGA/BCNU的IC50值为3.902mg/mL,相对于PEG-PLGA/BCNU和自由BCNU分别低了1.89和3.90倍。
体内分布实验结果显示,包载NIR染料(BODIPY)的T7-PEG-PLGA胶束,在脑肿瘤部位的荧光强度明显高于
PEG-PLGA胶束。
在荷U87原位脑胶质瘤模型的小鼠体内研究T7-PEG-PLGA/BCNU、PEG-PLGA/BCNU以及BCNU的治疗效果,通过生物发光成像实时监测肿瘤的大小。
Figure1.8显示,在给药治疗7天后
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