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黄帆1105052
湖北中医药大学本科生毕业论文
题目:
高效液相色谱法测定不同工艺的抗感颗粒中
绿原酸的含量
姓名:
黄帆
学号:
20061105052
专业:
中药学
年级:
2006级
实习单位:
湖北中医药大学
指导老师:
江汉美
完成日期:
2010年5月18日
高效液相色谱法测定不同工艺的抗感颗粒中绿原酸的含量
学生:
黄帆指导老师:
江汉美
摘要:
目的:
建立高效液相色谱法测定不同工艺的抗感颗粒中绿原酸的含量的方法。
方法:
采用ODSC18分析柱(4.6nm×250mm,10μm),流动相:
乙腈-0.4%磷酸(15:
85),检测波长:
327nm,流速:
1.5ml/min。
结果:
绿原酸在0.24μg~1.22μg范围内进样量与峰面积呈现良好的线性关系(r=0.9998),平均回收率为98.88%,RSD=1.40%。
结论:
本方法测定结果准确,重现性好。
关键词:
高效液相色谱法抗感颗粒绿原酸含量测定
DeterminationofcontentofchlorogenicinthedifferentprocessesKanggangranulesbyHPLC
Abstract:
Objective:
TheestablishmentthedeterminationmethodforchlorogenicinthedifferentprocessesKanggangranulesbyHPLC。
Methods:
TheHPLCsystemconsistedofODSC18column(4.6nm×250mm,10μm),Acetonitrile-0.4%phosphoricacid(15:
85)mixtureasmobilephase,detectionwavelengthat327nm,flowrateof1.5ml/min.Results:
Therewasagoodlinearrelationshipbetweentheconcentrationofchlorogenicandabsorptionareavaluewithrangeof0.24μgto1.22μg(r=0.9998).Theaveragerecoveryratewas98.88%withRSD=1.40%.Conclusion:
Themethodishighlyrepeatableandaccurate.
KeywordsHPLC;Kanggangranules;chlorogenic;Contentdetermination
2005版中国药典[1]记载抗感颗粒是由金银花、赤芍、绵马贯众3味中药组成,具有清热解毒之功效。
临床常用于外感风热引起的发热,头痛,鼻塞,喷嚏,咽痛,全身乏力,酸痛等症。
在处方组成中,金银花为君药,而绿原酸是金银花主要的有效成分。
本文采用高效液相测定法对不同工艺的抗感颗粒中的绿原酸进行含量测定,该方法重现性好,灵敏度高。
1.仪器与试药
1.1仪器
Agilent1100系列高效液相色谱仪
1.2试药
绿原酸对照品(中国药品生物制品检定所,批号:
110753-200413);抗感颗粒(自制);甲醇色谱纯;其余试剂均为分析纯;水为双重蒸馏水。
2.方法与结果
2.1制备方法
取金银花、赤芍、绵马贯众分别加水煎煮两次,第一次加8倍量水煎煮1.5h,第二次加5倍量水煎煮1h,合并两次煎液,滤过,适量浓缩,将浓缩后的三种药液分别平分为6份。
工艺一:
分别取一份金银花液、赤芍液、绵马贯众液,按中国药典方法,合并煎液,滤过,滤液浓缩至适宜,加乙醇至含醇量达50%,搅拌,过滤,回收乙醇,并浓缩至适量,加入适量蔗糖粉和糊精,混匀制成颗粒,烘干即得样品1。
相同的方法取赤芍液、绵马贯众液制成阴性品1。
工艺二:
分别取一份金银花液、赤芍液、绵马贯众液,在三种药液中分别加入乙醇至含醇量达50%,过滤,回收乙醇,再浓缩为适宜密度的清膏。
将清膏合并加入适量蔗糖粉和糊精,混匀制成颗粒,烘干得样品2。
相同方法取赤芍液、绵马贯众液制成阴性品2。
工艺三:
分别取一份金银花液、赤芍液、绵马贯众液,在三种药液中分别加入乙醇至含醇量达70%,过滤,回收乙醇,再浓缩成适宜密度的清膏。
将清膏合并加入适量蔗糖粉和糊精,混匀制成颗粒,烘干得样品3。
相同方法取赤芍液、绵马贯众液制成阴性品3。
2.2色谱条件
色谱柱:
ODSC18(4.6nm×250mm,10μm)
流动相:
乙腈-0.4%磷酸(15:
85)
流速:
1.5ml/min
柱温:
30℃
检测波长:
327nm
进样量:
10μl
按上述色谱条件分析,标准品、样品及阴性样品的HPLC分离谱图,见下图
图1绿原酸对照品的HPLC图谱
Picture1ChlorogenicacidHPLCpatternofthereferencesubstance
图2供试品1的HPLC图谱
Picture21forHPLCsamplemap
图3阴性对照品1的HPLC图谱
Picture3Negativereferencesubstance1oftheHPLCmap
图4供试品2的HPLC图谱
Picture42forHPLCsamplemap
图5阴性对照品2的HPLC图谱
Picture5Negativereferencesubstance2oftheHPLCmap
图6供试品3的HPLC图谱
Picture63forHPLCsamplemap
图7阴性对照品3的HPLC图谱
Picture7Negativereferencesubstance3HPLCpatterns
2.3对照品与供试品溶液的制备
2.3.1精密称取绿原酸对照品,加50%甲醇制成每1ml含306μg的备用溶液。
取备用溶液2ml,置10ml的容量瓶中,加50%乙醇至刻度线,摇匀,作为对照品溶液(每1ml含绿原酸61.2μg)。
2.3.2取抗感颗粒(样品)5g,研细,精密称取1.00g,置100ml容量瓶中,加50%甲醇50ml,超声处理30min,放置至室温,加50%甲醇至刻度线,摇匀,过滤,取滤液作为供试品溶液。
2.3.3取制备的阴性品适量,按供试品的方法制备金银花阴性品溶液。
2.4标准曲线的制备
分别精密吸取对照品溶液4、8、12、16、20μl注入高效液相色谱仪,在上述色谱条件下测定,记录色谱峰及峰面积值。
以绿原酸峰面积值对进样量(μg)进行线性回归,绘制标准曲线,得回归方程Y=942.49X+38.26,r=0.9998,绿原酸其峰面积与浓度呈良好的线性关系。
测定结果见表3-1。
表3-1标准曲线的测定结果
Table3-1ThemeasuredresultsofStandardcurve
进样量(μg)峰面积值
0.24256
0.49505
0.73735.8
0.98962
1.221182
2.5精密度试验
精密吸取同一对照品溶液10μl,连续重复进样5次,记录色谱图及峰面积值,结果RSD=0.40%<3%(n=5),表明仪器精密度良好,测定结果见表3-2。
表3-2精密度试验结果
Table3–2ThetestresultsofPrecision
进样次数峰面积值RSD(%)
1714.3
2716.7
37140.40
4709.3
5711.6
2.6重现性试验
取同一批颗粒,按供试品溶液制备方法制备,制成5份,平行进样5次,依法测定含量结果见表3-3。
含量的相对标准偏差为1.26%<3%(n=5)。
表明该方法重现性良好。
表3-3重现性试验结果
Table3-3ThetestresultsofReproducibility
实验号峰面积值含量(mg/ml)RSD(%)
1690.36.92
26856.86
3670.36.711.26
46776.78
5687.36.89
2.7稳定性试验
取同一供试品溶液在制备后分别放置0、2、4、8、12小时,分别精密吸取10μl,注入液相色谱仪中,测定其峰面积值,结果见表3-4。
抗感颗粒中绿原酸在制备12小时内基本稳定,RSD=1.04%<2%(n=5),满足实验分析的条件。
表3-4稳定性试验结果
Table3-4Thetestresultsofstability
放置时间峰面积值RSD(%)
0689.4
2685.8
4686.31.04
8683
12671.1
2.8加样回收率试验
精密称取已知含量(0.85mg/g)的样品0.5g,分别精密加入绿原酸对照品溶液(61.2μg/ml)10ml(即0.612mg),然后按供试品溶液制备方法制备回收试验液,按样品测定的方法测定含量,计算回收率,结果平均回收率为98.88%,RSD=1.40%<2%(n=6),结果见表3-5。
表3-5加样回收率试验结果
Table3-5Thetestresultsofaveragerecovery
取样量绿原酸含量对照品加入量实测值回收率平均含量RSD
(g)(mg)(mg)(mg)(%)(%)(%)
0.50983.49210.6124.100299.36
0.50133.43390.6124.039798.99
0.51013.49420.6124.083496.2798.881.40
0.50643.46880.6124.074598.97
0.50353.44900.6124.0637100.44
0.50423.45380.6124.061199.23
回收率=
实测值-原样品含量
×100%
对照品加入量
2.9样品测定
取制备的三种抗感颗粒各三份,每份取1g按供试品制备方法制备,各进样10μl,照色谱条件测定,读取峰面积值,按外标法计算含量,结果见表3-6。
表3-6样品中绿原酸的含量测定结果
Table3-6Thetestresultsofchlorogenicacidofsample
实验号n含量(mg/g)RSD(%)
样品136.301.72
样品236.840.83
样品336.110.75
3.结果讨论
3.1通过含量测定结果及方法学研究发现,高效液相色谱法测定不同工艺抗感颗粒中的绿原酸含量,方法简单,重现性好,可以用于控制抗感颗粒的含量。
3.2通过对各种流动相[2-4]的实验发现甲醇-0.4%磷酸为流动相效果较好。
3.3水提醇沉淀法系指先以水为溶剂提取药材有效成分,同时也提出一些水溶性杂质,往水煎液中加入适量乙醇,可以改变其溶解性能而将部分或全部杂质除去。
以上三种工艺,工艺二中绿原酸的含量最高,因此工艺二较其它两种工艺好。
3.4实验发现,绿原酸不太稳定,易于分解。
绿原酸放置稍久后,色谱图中除绿原酸外,其后会出现一个小峰。
因此,测定中应注意绿原酸最好现配现用,或者将绿原酸低温避光保存。
参考文献
1.中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典.(一部).北京:
化学工业出版社,2005;471.
2.高丽欣,高玉琼,代泽琴等.抗感颗粒质量研究标准.贵阳医学院学报,2006,31(6):
557-558.
3.寿文虹,吴韶铭,施芬.高效液相色谱法测定抗感颗粒中绿原酸的含量.中国现代应用药学杂志,2005,22
(1):
71-72.
4.张彩霞,王艳华,尉佳明.HPLC法测定抗感颗粒中绿原酸的含量.中国中医药科技,2005,12(3):
171.
文献综述
金银花中绿原酸的提取研究
金银花又名二花、银花、忍冬花等,花入药,性寒,味甘,归肺、胃、心经。
具有清热解毒,疏散风热,凉血止痢等功效。
经研究发现金银花花提取物尤其是绿原酸和黄酮类化合物具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、解热镇痛和治疗肝病疾病等作用。
绿原酸(C16H18O9)又名氯原酸,咖啡鞣酸。
绿原酸在25℃水中溶解度为4%。
易溶于热水、乙醇及丙酮等极性溶剂,极微溶于乙酸乙酯,所以目前的提取剂大多采用水、醇、酮类。
绿原酸的提取方法有很多,如浸提法、回流提取法、超声波提取法、微波提取法、大孔树脂吸附法、酶提取法等。
1.浸提法
浸提法是最常用的一种提取方法。
是用溶剂浸提原料,使绿原酸溶解到溶剂中去,再蒸去溶剂。
有以下相关报道。
林丹等[1]对金银花的多种提取方法进行了研究,作了绿原酸标准品的标准曲线,从而根据金银花中绿原酸的得率来进行方法的考察,尤以醇提法较好。
绿原酸的得率可达到15.28%;其次就是酶解法的得率为12.52%;而且随着乙醇浓度的增加绿原酸的得率先增加后减少,50%的醇提法最好,可达到15.28%。
董丽华[2]等在产品开发中发现,采用水提醇沉法提取金银花中的绿原酸,其含量较高,达到了满意的效果,故仍为中药制剂中制备金银花提取物的理想方法。
水提醇沉法此工艺成本低,与稀醇提取法比较绿原酸含量和得率无显著差异。
质量控制完全符合中国药典2000年版一部金银花项下要求。
传统的绿原酸提取工艺为水提或醇提,水提无需溶剂,但绿原酸产率低、粗浸膏杂质多;醇提产率高、杂质少。
但溶剂消耗量大。
赵忠兴[3]等对传统的工艺进行了改进。
首先用少量乙醇水溶液润湿金银花,然后加沸腾热水搅拌提取。
结果绿原酸得率为7.89%,浸膏中绿原酸含量为l6.7%,均高于传统醇提及水提,但乙醇用量仅为醇提的6%。
在提取时间方面新工艺只有水提的l/3,醇提的1/9,这是由于新工艺经过乙醇充分解吸后,提取速度明显加快,醇提法由于提取温度低,过程最慢;在乙醇用量方面,水提不需乙醇,而新工艺的乙醇消耗量不到醇提的6%(以无水乙醇计);在得率方面,新工艺最高,水提最低,主要原因是新工艺提取时间短,绿原酸分解少,而水提主要是绿原酸解吸不充分及提取温度高、时间长,因而得率低;在浸膏含量方面,新工艺最高。
水提最低,主要原因是新工艺提取时间短。
而醇提的粗浸膏中绿原酸含量也较高的原因是一些杂质如蛋白质及淀粉等在乙醇中的溶解度小。
因而杂质含量较低,综合比较结果说明改进后新工艺明显优于传统的水提或醇提工艺。
赵传贤等[4]认为从绿原酸的结构看,绿原酸属于多羟基有机酸,极性很大,较难溶于有机溶剂中,而易溶于极性较大的水和乙醇当中,根据这个性质他们确定用水直接提取,再经钙盐沉淀,使绿原酸与钙离子形成不溶于水的绿原酸钙盐沉淀,这样可使绿原酸与溶液中的可溶性成分分开,过滤,把沉淀收集起来,在乙醇中充分的分散,悬浮,用硫酸酸化悬浮液,产生交换反应,重新游离出绿原酸和出现硫酸钙沉淀,游离的绿原酸溶解于乙醇中,过滤,收集乙醇的溶液部分,再用氢氧化钠调节适当的pH,去掉杂质,真空浓缩,回收乙醇,得到绿原酸浸膏。
绿原酸的含量在10-20%之间,其效率达到60%以上。
进一步将绿原酸浸膏加浓盐酸调整pH=2,用乙酸乙醋多次萃取,合并乙酸乙酯萃取液真空浓缩至原来的三分之一,再加氢氧化钠中和至pH=6~7,以无水硫酸钠脱水一夜,分离之,加入活性炭脱色,过滤,除去活性炭,滤液中加入适量的氯仿,则出现淡黄色的沉淀,倾倒出液体,用氯仿洗几次,真空烘干,可得精制品,绿原酸含量可达90%以上。
逆流提取是指提取剂从第一级加入流向最后一级,而物料从最后一级加入流向第一级,即逆向流动的提取过程。
向智男等[5]以水为提取剂,对金银花中的绿原酸进行逆流提取。
重点研究了该工艺中影响绿原酸提取率的主要因素,得出了合理的操作参数,即提取温度80℃,提取液pH3.5,最初料液比(g:
mL)1:
20,提取时间逐级为30、20、15和10min的4级逆流提取,此时绿原酸的提取率及原料、溶剂的利用率均最高。
该法简单易行,并可节约大量资源。
2.回流提取法
回流提取法是在浸提法的基础上。
利用易挥发溶剂加热回流进行提取。
该方法溶剂的消耗量比较大。
但由于溶剂反复利用,提高了提取效率近年来.运用此法的研究很多。
倍受众多研究学者的关注。
张来新等[6]从实验中总结了许多关于绿原酸的性质,从而设想用乙醇和水组成的混合溶剂作提取剂,用盐酸作电离抑制剂,水浴加热回流。
并利用绿原酸在热乙醇和冷乙醇中溶解度相差非常大的特点,使其在热乙醇中溶解而在冷乙醇中析出,从而达到分离的目的。
他们采用传统的正交设计法选取金银花中提取绿原酸的最佳条件,在提取过程中,固定回流次数为两次。
最后得出结论如下:
最佳提取条件为:
40%乙醇(体积分数)、溶剂用量为l2倍、水浴温度为80℃、回流时间为2.5h、pH值为6。
最佳提取流程为:
干金银花20g(粉碎成细末)→加240mL乙醇溶液(40%),用盐酸调节pH值至6→8O℃水浴加热回流2.5h→趁热抽滤→滤渣→加240mL乙醇溶液(40%),调节pH值至6→80℃水浴加热回流1h→趁热抽滤→合并二次滤液→减压浓缩至药材量的5倍→滤去不溶的杂质→减压浓缩至粘稠状→加50mL乙醇→水浴加热溶解→低温放置沉淀→抽滤→干燥至恒重→产品(并回收溶剂)。
武达等[7]研究金银花的不同提取工艺得知,用75%乙醇回流提取效果最好,传统水煎法与65%渗漉法提取效果相当。
结果表明金银花的优选提取工艺是用1O倍量的75%的乙醇回流提取2次,每次1.5h。
该提取工艺产品纯度高,收率高,可实现工业化。
减压内部沸腾法是用少量低沸点解吸剂润湿被提取物料粉末,使其中的有效成分充分解吸,然后加入一定温度的热提取溶剂并迅速减压,使渗透到植物组织内部的解吸剂首先沸腾,强化提取过程。
郝瑞然[8]等用减压内部沸腾法提取金银花中绿原酸,在7O℃下提取绿原酸的得率为9.0%,浸膏中绿原酸含量为18.5%,提取2次共需时间8min。
与传统方法相比,提取温度减少3O℃,提取速度仍然快11.5倍,杂质提出量减少12%。
3.超声波提取法
超声波提取是利用超声波特殊的机械效应、空化效应和热效应。
通过增大介质分子的运动速度、增大介质的穿透力以提取生物有效成分,超声波对物料有很强的破坏作用。
可以使细胞组织变形。
使细胞壁上的有效成分更好地溶解到溶剂之中。
府旗中等[9]应用超声波法提取金银花中的绿原酸。
采用紫外分光光度法测定不同提取工艺下制备的提取物中绿原酸的含量,并与传统的水提法、乙醇回流提取法比较,根据绿原酸的得率及抑菌效果确定金银花提取的优化工艺。
实验结果表明,超声波法的绿原酸提取率高于水提法、乙醇提取法,但超声波法、水提法及乙醇提取法制备的绿原酸提取物对大肠杆茵的抑菌效果没有明显差异,其最小抑菌浓度(MIC)均为250ug/g。
尹波等[10]取6.0g金银花于烧瓶中,用适量蒸馏水分两次提取,每次用超声波处理提取一定时间后,分离出提取液,合并两次提取液,使用薄层层析分离,再使用紫外分光光度计进行测定。
根据实验结果,综合各种影响因素,发现样品的预浸时间越长、超声波提取时间越长、超声波温度越高,提取收率也越高。
综合来说超声波法提取金银花中的绿原酸的最佳条件为:
室温下,先将样品浸泡24h,分两次提取,每次超声波处理30min。
曹渊等[11]以金银花中绿原酸的含量为指标,考察了水蒸气蒸馏法、超声波提取法和醇提法提取金银花中绿原酸优劣,确定超声法为最佳提取方法。
通过正交实验,以溶剂浓度、预浸时间、超声时间和pH值4个因素对超声法的提取工艺进行优选。
结果得到最佳的提取工艺条件为:
乙醇浓度为60%,pH值1,预浸12h,超声提取2次,45min/次;此条件下绿原酸提取率可达5.62%。
影响程度为:
pH值>预浸时间>超声时间>溶剂浓度。
结论工艺简单,提取条件温和,提取率高,可为提取绿原酸的大规模产业化所应用。
4.微波提取法
微波预处理的方法,该法在干或半干状态下,先用微波辐射破坏植物细胞结构,然后进行传统法提取,微波作用的是刚好被汽化剂湿润的物料,微波几乎全被物料吸收,处理时间只有几十秒,由于处理时间短,微波对目标产物的破坏轻,提取效果好。
黄旭初等[12]通过金银花提取工艺的正交试验研究以及对乙醇浓度、用量和微波处理时间的深人探讨,确定了此法提取绿原酸的最佳条件为:
选用7O%乙醇,每次用溶剂量为20mL,微波处理时间为70s。
由于微波作用的是刚好被汽化剂湿润的物料,微波几乎全被物料吸收,处理时间短,微波对目标产物的破坏轻,提取效果好。
郭振库等[13]应用MSP-100D专用微波制样系统。
通过正交实验设计考察了微波提取的条件,溶剂选择、溶剂体积对样品质量比、高的溶剂压力/温度和微波辐射时间对中药金银花中有效成分绿原酸类化合物提取产率的影响。
结果:
确定了35%乙醇作溶剂,溶剂倍量30,控制压力0.10MPa,加热时间1min,70%微波功率(微波炉的最大功率850W)为微波最佳提取条件。
在微波帮助提取和超声波提取方法的最佳提取条件下,微波法的提取率和重复性好于超声波。
微波法提取不仅所需时间短.而且提取率比超声波法高近2成.微波帮助提取方法可用于中药有效成分的快速分析并对中药工业应用微波提取技术具有指导意义。
韦藤幼等[14]通过对微波预处理过程以及热水洗涤过程的影响因素分析,得到最佳提取工艺参数。
方法:
用75%乙醇溶液湿润干金银花,然后在微波加热下快速汽化进行预处理,最后再用热水洗涤两次,每次10min。
并与传统的提取方法相比。
结果:
微波预处理提取法的提取时间缩短6倍、提取率提高1%。
结论:
该法提取率高,提取时间短。
余建平等[15]采用微波法提取了金银花中的绿原酸,所制得的绿原酸粗产品用石油醚脱色、薄层层析分离和紫外分光光度计测定含量,并与超声波法、水提法进行了比较。
实验结果表明。
微波法在提取金银花的绿原酸中具有非常好的效果,筛选的最佳微波工艺条件是:
微波功率260W,样品预浸时间24h,辐射时间15min。
在此条件下,与水提法相比总收率提高了10.59%,提取时间缩短75%;与超声波提法相比总收率也提高了2.60%,提取时间缩短了50%。
且该方法具有操作简单、快速高效、节能环保等优点。
5.大孔树脂吸附法
大孔吸附树脂对中草药化学成分如生物碱、黄酮、皂苷、香豆素及其他一些苷类成分都有一定的吸附作用。
对糖类的吸附能力很差。
对色素的吸附能力较强。
目前已较广泛应用于中药新药的开发和中成药的生产中。
主要用于分离和提纯过程。
雷万钧[16]用5种不同型号树脂对多倍体金银花绿原酸静态吸附和解吸的性能进行试验,筛选出一种对绿原酸吸附和解吸均有较好效果的树脂,即DPH-417型大孔吸附树脂。
在选择了DPH-417型树脂后,通过分析乙醇浓度对绿原酸解吸率的影响,得出60%的乙醇为最佳洗脱剂。
动态吸附和解吸试验表明,DPH-417型树脂对绿原酸的动态饱和吸附量为70.21mg/g,动态解吸率为91.2%;对洗脱液进行收集浓缩、冷冻干燥得多倍体金银花绿原酸粗品,绿原酸含量为56.2%。
寡聚环糊精键合凝胶柱能纯化金银花中的绿原酸,流动相、柱温、负载量及介质再生等因素对分离纯化效果有重要影响,张毅敏等[17]等研究得到如下结论:
(1)采用寡聚环糊
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