薄层色谱法培训讲义.docx
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薄层色谱法培训讲义
薄层色谱法
薄层色谱法是将供试品溶液点于薄层板上,在展开容器内用展开剂展开,使供试品所含成分分离,所得色谱图与适宜的对照物按同法所得的色谱图对比,并可用薄层扫描仪进行扫描,用于鉴别、检查或含量测定。
注意事项
⏹样品的预处理。
⏹样品及对照药材和供试品及对照药材溶液制备应量化操作,目的是使样品的色谱与对照药材的色谱更有可比性。
⏹定量点样(除了鉴别有无,还可粗略进行量化评价)
⏹在有条件的情况下,设化学对照品的同时设对照药材。
⏹注意环境条件对样品色谱行为的影响。
一、薄层板
普通薄层板:
硅胶G、H,硅胶GF254,聚酰胺薄膜等
市售薄层板
(商品预制板)高效薄层板
自制薄层板:
铺板用的匀浆不宜过稠或过稀:
过稠,板容易出现拖动或停顿造成的层纹;过稀,水蒸发后,板表面较粗糙。
匀浆配比一般是硅胶G:
水=1:
2~3,硅胶G:
羧甲基纤维素钠:
水=1:
2。
研磨匀浆的时间,根据经验来定,与空气湿度有关,一般通过拿起研棒时匀浆下滴的情况来判断,越稠越难下滴。
匀浆的稀稠除影响板的平滑外,也影响板涂层的厚度,进一步影响上样量。
涂层薄,点样易过载;涂层厚,显色不那么明显。
目前实验室使用的薄层板规格:
10cm×10cm,10cm×20cm或20cm×20cm
✡注意事项
1、薄层板临用前一般应在110℃活化30分钟后,置干燥器中备用。
最好随用随制,放入干燥器中保存仅作为使用前的一种过渡。
2、聚酰胺薄膜不需活化。
3、如在存放期间被空气中杂质污染,使用前可用三氯甲烷、甲醇或二者的混合溶剂在展开缸中上行展开预洗,110℃活化30分钟后,置干燥器中备用。
4、使用前检查其均匀度,在反射光及透射光下检视,表面应均匀、平整、光滑、无麻点、无气泡、无破损及污染。
二、点样
1、点样器:
专用毛细管、半自动或自动点样器械、薄层用微升注射器等。
2、点样:
10~15mmmm
要求在洁净干燥的环境下点样。
尽量用小的点样管。
如果有足够的耐性,最好只用1微升的点样管。
这样,点的斑点较小,展开的色谱图分离度好,颜色分明。
样品溶液的含水量越小越好,样品溶液含水量大,点样斑点扩散大。
样品溶液的溶剂一般是无水乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯。
点好样的薄层板用电吹风的热风吹干或放入干燥器里晾干。
除另有规定外,用点样器点样于薄层板上,一般为圆点状或窄细的条带状。
点样基线距底边10~15mm,高效板一般基线距底边8~10mm;圆点状直径一般不大于3mm,高效板一般不大于2mm;条带状宽度一般为5~10mm,高效板条带状宽度一般为4~8mm;点间距离可视斑点扩散情况以相邻斑点互不干扰为宜,一般为10~20mm(不少于8mm),高效板不少于5mm。
✡注意事项
1、薄层板上样品容积的负荷极为有限,普通薄层板的点样量最好在10ul以下,高效薄层板在5ul以下。
点样量过多,可造成原点“超载”,展开剂产生绕行现象,使斑点拖尾。
2、供试品溶剂在原点的残留,也会改变展开的选择性。
因此上样时同步干燥或上样后继后干燥以除去原点残存的溶剂是需要的,但应尽可能避免高温加热。
3、上样装置对薄层表面的机械损伤也影响色谱质量。
点样时必须注意勿损伤薄层表面。
4、温湿度不同程度地影响色谱的质量。
实验室一般要求相对湿度在65%以下为宜。
如在空气中点样,一般以不超过10分钟为宜,以免吸附剂在空气中吸湿而降低活性。
5、展开剂所用的溶剂质量不好,也直接影响薄层色谱的分离能力。
三、展开
(一)展开剂配制
选择合适的量器把各组成溶剂移入分液漏斗,强烈振摇使混合液充分混匀,放置,如果分层,取用体积大的一层作为展开剂。
绝对不应该把各组成溶液倒入展开缸,振摇展开缸来配制展开剂。
混合不均匀和没有分液的展开剂,会造成层析的完全失败。
各组成溶剂的比例准确度对不同的分析任务有不同的要求,尽量达到实验室仪器的最高精确度,比如:
取1ml的溶剂,应使用1ml的单标移液管,移液管应符合计量认证要求,尽管多数时候这不是必须的。
(二)展开系统的饱和
一般使用的是双槽的展开缸,一槽用来放展开剂,另一槽可加入氨水或硫酸。
把待展开的板放入两槽间的平台,斜架着,盖上展开缸的盖子。
让展开剂的蒸气充满展开缸,并使薄层板吸附蒸气达到饱和,防止边沿效应,饱和时间在半个小时左右。
展开时难免要打开盖子把薄层板放入展开剂中,不过对薄层板与蒸气的吸附平衡影响不大,当然动作应该尽量轻、快。
(三)温湿度的控制
温湿度对薄层影响都很大。
不冻结的前提下,通常温度越低分离越好,较难的分离需在低温下分离,例如人参皂苷。
湿度的影响,主要是影响薄层板的吸附能力,导致选择性(容量因子)的变化,湿度应根据实际情况确定。
温度控制使用空调器或冰柜,湿度控制是通过在另一展开槽放置相应浓度的硫酸。
对温、湿度敏感的品种必须按品种项下的规定,严格控制实验环境的温、湿度。
(四)展开
平底展开缸
直立式
1、展开缸双槽展开缸(常用)
(层析缸)水平式
2、展开缸应保证密闭(可适量涂上凡士林)。
3、薄层板浸入展开剂中的深度一般要求溶剂的液面据原点约5~10mm。
4、如规定在展开前需要溶剂蒸气预平衡,可在展开缸中加入适量展开剂,密闭,一般保持15~30分钟。
如规定薄层板需同时预平衡,则将点样后的薄层板放在双槽展开缸中没有溶剂的一侧槽中,展开前与展开缸同时预平衡后再将展开剂移入此槽中,展开至规定距离(一般为10~15mm),取出薄层板,晾干,按各品种项下的规定检测。
5、如需使展开缸达到溶剂蒸气饱和的状态,则须在展开缸的内侧放置与之等宽等高的用溶剂湿润的滤纸,密闭一定时间,使达到饱和再如法展开。
6、组分Rf值的最佳范围是0.3~0.5,可用范围是0.2~0.8。
相邻两组分的Rf值应相差0.05以上。
四、显色与检视
理想的显色希望灵敏度高、斑点颜色稳定、斑点与背景间的对比度好、斑点的大小及颜色的深度与物质的量成正比。
在样品组成并不完全已知的情况下,通用显色方法显得成尤为重要。
通用显色及检视法主要有:
1、色谱斑点本身有颜色者可直接在日光灯下观察可见光谱。
2、紫外照射法:
方便,不破坏样品。
斑点在紫外光激发下可发射荧光者,可直接在紫外光灯下观察荧光色谱。
3、需加试剂方能显色者,则需将试剂均匀喷洒于薄层板上,直接观察或加热显色后观察。
4、有的品种可熏以试剂或试液的蒸气(如碘蒸气、氨蒸气)显色。
碘蒸气法:
通用性强,与紫外法结合灵敏度高于该两法单独使用。
✡注意事项:
加热显色者须注意加热时间和温度,尤其含羧甲基纤维素钠的薄层板,加热温度过高或加热时间过长,容易引起板面的焦化,如用硫酸等显色剂,更易造成板面的炭化而影响显色效果。
有的成分加试剂后,如挥发油成分经香草醛硫酸显色,加热温度和时间长短不同或放置时间不同均可能使斑点的显色有所改变。
五、异常斑点的现象及处理方法
(一)边缘效应:
点于同一薄层上同一物质的斑点,在色谱展开过程中,靠近薄层边缘处斑点的Rf值与中心区域斑点的Rf值有所不同,此种现象称为边缘效应。
Ø为减少边缘效应,可用以下处理方法:
1、选单一展开剂。
2、用共沸展开剂。
如氯仿-甲醇(92:
8))时为共沸。
3、用较小体积的层析槽,或将薄层在槽内放置一定时间,待溶剂蒸气达到饱和后再作层析展开。
4、在层析槽内壁贴上浸湿展开剂的滤纸条,饱和空间。
5、用窄薄层代替宽薄层,如采用3cm以下的狭小薄层板,只点2~3点时,也会减少边缘效应。
6、采用高效薄层板效果更佳。
(二)拖尾现象
在斑点后方呈现拖尾,严重者呈现倒火焰型。
Ø产生的原因及处理方法
1、点样量过多:
要摸索点样量。
2、展开剂的PH值偏高:
在展开剂中加酸。
3、展开剂的PH值偏低:
在展开剂中加碱。
4、吸附剂PH值的影响:
加酸或碱调PH值。
5、吸附剂或展开剂中痕量金属离子如钙、镁等的影响:
羧基、酚羟基常与金属离子成盐,极性改变。
可将吸附剂用酸洗,展开剂重蒸加以克服。
6、样品预处理时由于操作不当(提取、萃取等)未使待检成分得到初步分离:
严格按标准规定的步骤规范操作。
(三)同一薄层板上出现Rf值悬殊的斑点
即一部分斑点集中在前沿处,另部分斑点集中在原点附近。
Ø产生原因及处理方法:
供试品中含有极性大小相差悬殊的组分。
1、将样品萃取成两部分,将各部分分别进行层析。
1、展开剂极性增加或减小,分为前景和后景。
即先选用极性大的展开剂将前景展开至前沿,使后景均匀展开,然后再选用极性小的展开剂,将后景留在原点,前景均匀展开。
(四)Rf值不稳定
即图谱无重现性,每次Rf值不稳定。
Ø产生的原因及处理方法
1、温度不恒定:
层析过程中应控制恒定温度在±0.5℃。
2、层析时间不恒定:
用一规格薄层板,同一展开缸内,展开至恒定的时间,立即取出。
3、吸附剂规格不统一(不同厂家生产的薄层板)
4、展开剂的规格批号不一致
5、一些多组分展开剂,如配制后立即使用,常因相平衡的时间比较短,或某些化学反应(如醇化等)尚未测定进行,以致混合展开剂之组成尚未稳定,而致斑点Rf值不稳定。
必要的时候,展开剂在配制后应在层析温度下放置三天后使用。
6、展开缸的规格不一致,影响展开空间的蒸气饱和度。
7、展开剂过多次数重复使用:
新鲜配制的展开剂,最好只使用一次。
8、其它:
展开缸未清洗干净,未彻底干燥即加入展开剂,以及展开剂保存不当等。
六、问题讨论
七、参考书
1、《中国药典》一部附录ⅥB
2、《中国药品检验标准操作规范》P75~78
3、《医药企业检验员操作规范及岗位培训》P145~154
4、《中药化学》《分析化学》等
薄层色谱小知识
1、 怎样提高点样效率?
点样是造成TLC定量误差的主要来源。
实验证明:
定量毛细管更适合较小体积的点样;微量注射器更适合较大体积的点样。
这主要是因为微量注射器受小气泡、溶液回爬现象的影响较大。
为避免不同定量毛细管间的点样误差、建议一块薄层板上最好用同一只定量毛细管。
但应注意更换样品时,应将毛细管用超声波或不同极性溶剂清洗干净。
在制备样品时,溶样溶剂黏度不能过高,以便于点样;溶剂沸点过低则进样体积易变,过高则会改变展开剂组成;对样品溶解度过高会使样点发生空心现象;常用的溶剂为甲醇、乙醇、丙酮。
2、展开剂的选择
TLC与HPLC相比,一个突出的优点就是流动相的选择具有更大的灵活性。
流动相的选择的目的是使绝大部分样品的RF值位于0.1--0.7之间并达到较好的分离,与此对应的是流动相要有适当的强度和组成。
流动相强度越大,溶质RF值越大,但很可能降低分离能力;另外单一溶剂很难分离较复杂的混合物,根据相似相溶原理,要使用多元溶剂体系。
一般展开剂体系选择如下:
根据分离样品性质、薄层色谱板性质选择一个二元溶剂体系,通过调节溶剂比例以寻求适合RF值,适合的RF值找到后,再寻求极性参数相同的二元溶剂体系两个,以这三个组成为三点组成一个三角形,则可看到:
三角形顶点是二元体系,边是三元体系,三角形内是四元体系,并且极性一致,可根据几何原理得出任一点组成。
这种方法较为直观,也较简单。
3、TLC的通用显色方法
理想的显色希望灵敏度高、斑点颜色稳定、斑点与背景间的对比度好、斑点的大小及颜色的深度与物质的量成正比。
在样品组成并不完全已知的情况下,通用显色方法显得成尤为重要。
通用显色法主要有:
(1)、紫外照射法:
方便,不破坏样品;
(2)、碘蒸气法:
通用性强,与紫外法结合灵敏度高于该两法单独使用;
(3)、荧光试剂:
制造荧光背景,使原来紫外下无荧光物质被鉴别,有荧光物质更明显;
(4)、硫酸溶液:
对绝大多数有机物有效,但有破坏性。
薄层色谱法的作用
薄层色谱是化学的一种分离和分析方法
(1)、定性鉴别化学上经典的定性鉴别,例如经典的有机定性分析或经典的毒物分析,是利用各种化合物的溶解度不同和所含功能基的不同,用溶剂提取或用试剂处理,把它们分组或分为单一组分,然后作试管反应或点滴反应(颜色反应),或根据它们衍生物的理化性质进行定性鉴别.这种方法的缺点是样品用量叫大,分离手续麻烦,分析时间较长(几小时或几时个小时),并可能有杂质干扰.,现采用合适的展开剂和现色剂在薄层上作为分离和鉴别,根据样品中组分的值和现色情况,同时用标准作对照,一般即能却证为某一化合物.用薄层色谱法定性,样品用量小,分离方便,分离时间短(几分钟或几时分钟),检出灵敏度高.例如,再毒物分析中检验是否巴比妥安眠药中毒时,取胃内容物或尿样品,先用盐酸酸化后,用乙醚提取,乙醚提取液脱水,过滤蒸干,溶于无水乙醇中,点在硅胶版上用氯仿无水乙醇(361)展开,用硫酸汞二苯偶碳酰肼试剂显色,并用标准品对照,意见出巴比妥,苯巴比妥,戊巴比妥和异巴比妥。
鉴别速度快(1小时),这对于抢救中毒患者和及时为医生提供治疗方案极为重要
(2)、药品的质量控制和杂质检查药品的纯度,通常用熔点,吸光值等物理常数作为鉴定的指标。
但是薄层检查也是药品质量控制和杂质检查的一种有效方法,有时甚至比一般方法更有效。
一些国家的药典和药品规范已经采用。
方法是把一定量得样品溶液(例如,相当于样品)电在薄层上,用展开剂展开并显色,同时用纯品作对照,如果样品只显示出纯品值一致的一个斑点,则表示含有杂质.进一步可用薄层作杂质的限量检查.再上例中,如果已经知道显色剂对杂质的最小检出量为,在薄层上点样后不显出杂质斑点,则杂质的量低于,或低于,也就是样品的纯度不低于.例如镏体药物的合成和精致工作中,常含结构类似的杂质,即按上述方法控制其质量和杂质的限量.
(3)、化学反应进程的控制,反应副产物的检出以及中间体的分析,在化学反应进行到一定时间或反应终了时,把反应液取出作薄层分析,可以知道还剩下多少原料药未起作用.方法是把反应液或其有机溶剂提取液点在薄层上,同时点原料作参比对照,看薄层上是否出现原料药斑点.还可以用薄层检查反应副产物.如果化学反应分步进行,则每一步反应的中间体的质量和产率也都可用薄层进行定性和定量.例如在合成强力霉素的过程中,需要中间地甲烯土霉素氢化物为脱氧土霉素.氢化反应是否完全,可用薄层检查,如果反应完全,则反应釜中几乎没有或只有极少量的甲烯土霉素存在,薄层板上只显示出一个脱氧土霉素,如果薄层板上有上下二个明显的斑点,表示反应还没有完全,尚需继续还原,直到只显示出脱氧土霉素的一个斑点为止才能出料.
(4)、柱色谱法分离条件的探索柱色谱法的实验条件,例如选用什么吸附剂和洗脱剂较好各个组分按什么顺序从柱中洗脱出来,每一分洗脱液中是含单一组分或就含几种没有分开的组分等,都可以在薄层上进行探索和检验。
薄层上所有的展开剂虽不完全照搬柱色谱法上,但仍有参考价值。
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