双水相体系萃取纤维素酶的研究.docx
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双水相体系萃取纤维素酶的研究
FOODSCIENCEANDTECHNOLOGY
食品科技
2010年第35卷第12
期
纤维素酶是具有纤维素降解能力酶的总称,其应用非常广泛,如蔬菜加工,果汁及粮食加工、天然有效成分的提取、饲料、造纸、纺织工业、采油工程、废水处理以及能源制造等方面[1-3]。
目前纤维素酶的分离纯化多采用盐析、凝胶色谱等方法。
双水相体系萃取具有条件温和,产品活性损失少,处理量大,设备投资小,操作简单,易于放大及连续操作等优点,广泛应用于蛋白质、酶、核酸及多糖等生物大分子的分离纯化[4]。
本课题以商业粗酶制剂为酶源,研究PEG浓度、硫酸铵浓度
及pH对PEG4000/(NH42SO4双水相体系萃取纤维素酶的影响,以确定合适的萃取条件。
1材料与方法1.1
材料
纤维素酶:
杭州绿柔生物科技有限公司;羧甲基纤维素钠:
上海精析化工科技有限公司;聚乙二醇4000:
天津科密欧化学试剂开发中心。
1.2方法1.2.1
纤维素酶活力测定
以柠檬酸-硫酸氢二钠
Extractionofcellulasebyaqueoustwo-phasesystem
SHUGuo-wei,WANGChang-feng,CHENHe,YANGZhi-wei
(CollegeofLifeScienceandEngineering,ShaanxiUniversityofScienceand
Technology,Xi'an710021
Abstract:
Theeffectsofconcentrationofpolyethyleneglycol,ammoniumsulfateandpHonextractionof
cellulasefromindustrialcellulaseinaqueoustwo-phasesystemofPEG-4000andammoniumsulfatewerestudied.Theresultsshowthat:
Theconditionsofaqueoustwo-phasesystemsextractionareasfolows:
concentrationof(NH42SO4is8%,concentrationofPEG400026%,pH4.8,ThepartitioncoefficientKandtherecoveryratewere5.21and79.4%respectively.
Keywords:
cellulase;aqueoustwo-phasesystems;partitioncoefficient
舒国伟,王长凤,陈
合,杨志伟
(陕西科技大学生命科学与工程学院,西安710021
摘要:
研究了聚乙二醇4000-硫酸铵(PEG4000/(NH42SO4双水相体系中,PEG浓度、硫酸铵浓度
及pH对从商品纤维素酶样品中萃取纤维素酶的影响。
结果表明:
双水相体系的质量组成为(NH42SO48%,PEG400026%,pH4.8时,分配系数K为5.21,萃取率为79.4%。
关键词:
纤维素酶;双水相;分配系数中图分类号:
O658.2
文献标志码:
A
文章编号:
1005-9989(201012-0191-03
双水相体系萃取纤维素酶的
研究
收稿日期:
2010-04-15
基金项目:
陕西省科技攻关项目(2007JK01-13-2;咸阳市科技攻关项目资助(K0311-2。
作者简介:
舒国伟(1977—,男,四川内江人,硕士,讲师,研究方向为功能性食品及酶工程。
提取物与应用
·191
·
FOODSCIENCEANDTECHNOLOGY
食品科技
2010年第35卷第12
期
(0.2mol/L,pH4.4缓冲液配制0.625%CMC-Na底物溶液。
取0.5mL酶液与2.5mL底物溶液50℃水浴保温30min,测定反应后还原糖含量,同时做空白对照。
酶活定义为在上述条件下,1h产生1mg葡萄糖的酶量为1个酶活力单位(U[5]。
1.2.2双水相萃取参考文献[6]。
1.2.3萃取率的计算[7]
y=RK/(1+RK
式中:
y为萃取率;
R为相比,R=Vt/Vb,Vt和Vb分别是上相和下相的体积;
K为纤维素酶的分配系数,K=Ct/Cb,Ct和Cb表示上下相的酶活。
2
结果与分析
分别取不同体积的标准葡萄糖液于25mL比色管中,加水至1.0mL,再加入3mLDNS溶液。
在沸水浴中蒸煮5min,立即冷却,定容后摇匀,以不加葡萄糖的溶液作对照,在500nm测定其测吸光度,以葡萄糖浓度对吸光度作图,结果见图1。
由图1可知,标准曲线方程为:
y=0.2447x-0.1367,相关系数R2=0.9972,即在1~3.5mg/mL
范围内葡萄糖浓度和吸光度有着良好的线性关系。
2.1盐浓度对相比R(Vt/Vb影响
在聚乙二醇PEG4000/(NH42SO4双水相体系中,当PEG浓度为18%,pH4.8,T=20℃条件下进行,不同浓度(NH42SO4下相比R变化见图2。
由图2可知,在聚乙二醇PEG4000/(NH42SO4
双水相体系中。
当聚乙二醇PEG浓度保持一定条件下,相比R(上相体积/下相体积随硫酸铵盐用量增加而减小。
2.2PEG浓度对相比R的影响
在聚乙二醇PEG4000/(NH42SO4双水相体系中,当(NH42SO4浓度为16%,pH4.8,T=20℃条件下进行,不同浓度PEG下相比R变化见图3。
由图3可知,在聚乙二醇PEG2000/(NH42SO4
双水相体系中。
当(NH42SO4浓度保持一定条件下,相比R(上相体积/下相体积随聚乙二醇用量增加而增大。
由萃取率y=RK/(1+RK可知,为了提高萃取率,需要同时考虑分配系数K和相比R这2个参数。
2.3(NH42SO4浓度对萃取的影响
在聚乙二醇PEG4000/(NH42SO4双水相体系中,当聚乙二醇PEG浓度为18%,pH4.8,T=20℃条件下进行,(NH42SO4浓度分配系数K和萃取率y的影响见图4。
由图4可知,在8%~12%(NH42SO4浓度范围内,分配系数K和萃取率y随(NH42SO4浓度升高而减小。
(NH42SO4浓度在12%~20%范围内,分配系数K和萃取率y随(NH42SO4浓度升高而升高,所以在(NH42SO4浓度为12%时,分配系数K和萃取率y最小。
由于(NH42SO4的加入,双水相体系中离子浓度也增大,离子在两相分配情况发生变化,当双水相达到平衡时,双水相必须保持电中性,因此在两相间会形成电位差,而电位差的大
0.80.60.40.201
1.5
22.53
3.5
y=0.244x-0.1367R2=0.9972
葡萄糖浓度/(mg/mL
A540nm
图1葡萄糖标准曲线
2.521.510.50
8
121620
(NH42SO4/(%,w/w
相比R图2盐浓度对相比R的影响
3.5
32.521.510.50
1216
1822
26
相比R
PEG4000浓度/%
图3EG4000浓度对相比R的影响
4.5
43.532.521.51分配系数K
8
121620
(NH42SO4浓度/%
0.770.760.750.740.730.720.710.7
萃取率y
分配系数K萃取率y
图4(NH42SO4浓度对萃取的影响
提取物与应用
·192
·
FOODSCIENCEANDTECHNOLOGY
食品科技
2010年第35卷第12
期
小直接影响到分配系数K和萃取率y。
但盐浓度不能过高,否则,会破坏纤维素酶表面的水化层,纤维素酶在下相发生盐析,使分配系数K和萃取率y下降。
2.4
PEG4000浓度对萃取的影响
在聚乙二醇PEG4000/(NH42SO4双水相体系
中,当(NH42SO4浓度为16%,pH4.8,T=20℃条件下进行,不同浓度PEG对分配系数K和萃取率y的影响见图5。
由图5可知,当在PEG浓度为26%时,分配系数K和萃取率y为最大。
出现这种原因主要是因为在(NH42SO4浓度一定下,WPEG较低时,接近临界点,不易形成双水相,所以分配系数K和萃取率y比较小。
随着PEG浓度的增大,系统远离临界点,两相差别较大,易于形成两相,分配系数K和萃取率y增大。
2.5
pH对萃取的影响
双水相体系萃取纤维素酶在PEG质量分数为
22%,(NH42SO418%,pH4.8,T=20℃条件下进行,pH对分配系数和萃取率的影响见图6。
从图6可知,在pH4.5~6.5范围内,pH对分配平衡系数K和萃取率y的影响均显著,说明此双水相系统萃取纤维素酶可在较宽的pH范围内进行。
3
结论
双水相体系萃取纤维素酶的条件为:
(NH42SO4
浓度为8%,PEG4000为26%,pH4.8,在此条件下,分配系数K为5.21,萃取率为79.4%。
参考文献:
[1]AMOinonen,JLondesborough,VJoutsjoki,etal.Vehmaanpera,PrimalcoLtd.Biotec,threecellulasesfromMelanocarpusalbomycesfortextiletreatmentatneutralpH[J].EnzymeMicrobTechnol,2004,34:
332-341
[2]王岩岩,陈东海,车烈权,等.纤维素酶提取枸杞多糖及工艺优化[J].食品科技,2007,28(3:
104-106
[3]丁长河,鲁慧芳,张建华,等.果胶酶与纤维素酶对马铃薯浆黏度的影响[J].食品科技,2006,27(2:
55-57
[4]
Chia-KaiSu,BeenHuangChiang.Partitioningandpurifi-cationoflysozymefromchickeneggwhiteusingaqueoustwo-phasesystem[J].ProcessBiochemistry,2006,41:
257-263
[5]中华人民共和国轻工行业标准QB2583-2003,纤维素酶
制剂[S][6]
MirjanaG.Antov.PartitioningofpectinaseproducedbyPolyporussquamosusinaqueoustwo-phasesystempol-yethyleneglycol4000/crudedextranatdifferentinitialpHvalues[J].CarbohydratePolymers,2004,56:
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PEG/fractionateddextranandPEG/industrialgradedex-tranaqueoustwo-phasesystemsfortheenzymichydroly-sisofstarch[J].JournalofFoodEngineering,2007,80:
1213-1217
分配系数K萃取率y
12
5.554.543.532.521.5
分配系数K
0.85
0.80.750.70.65
0.6
萃取率y
PEG4000浓度/%
图5PEG4000浓度对萃取的影响
分配系数K萃取率y
5.554.543.532.521.51
4.5
5.0
5.56.0
6.5
0.7750.770.765
0.760.7550.75
分配系数K
萃取率y
pH
图6pH对萃取的影响
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·193
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