第13章 RNA加工.docx
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第13章RNA加工
第13章RNA加工
基本概念和定义
RNA加工(RNAprocessing)描述了新合成的RNA分子在结构和化学组成方面的成熟过程。
这些修饰过程发生在转录过程中(共转录修饰,cotranscriptionalmodification)和转录后(转录后修饰,posttranscriptional);RNA加工对RNA的功能极其重要,同时RNA加工代表了基因调控的一类机制。
RNA加工反应分成10类,见表13.1。
从DNA模板复制的RNA分子称为转录本(transcript)。
在转录过程中产生的RNA是新生转录本(nascenttranscript),当转录完成后的RNA为初级转录本(primarytranscript)——它是被转录DNA的一个精确拷贝。
经过一些修饰后的RNA为成熟转录本(maturetranscript),不再与DNA完全一样。
并不是所有的RNA都要经过修饰:
细菌mRNA很少加工(实际上往往在转录完成之前蛋白合成就开始了),真核生物的5SrRNA转录完成后就有成熟的末端。
完全加工和有功能RNA分子的前体称为前体RNA(pro-RNA)。
真核生物的前体mRNA又称为核内不均一RNA(heterogeneousnuclearRNA,hnRNA)。
它不同于其他形式的核内RNA,其分子大小变化很大,反映了基因大小的差异和部分加工的分子的存在。
在真核生物核内,转录和RNA加工不是在核中自由发生的,而是在核基质中固定的位置进行。
特定的mRNA加工因子(特别是剪接体和多腺苷酸化酶)与延伸复合物中RNA聚合酶Ⅱ的C末端作用,所以转录和加工是相关联的。
mRNA加工复合物在核基质中的定位可能有利于产物的输出。
在核内和细胞质中RNA和蛋白质相结合,形成核糖核蛋白颗粒。
表13.1RNA加工反应的分类
加工反应举例
剪切使rRNA和tRNA从多顺反子转录本中释放
真核生物mRNA转录的终止
内切降解加工rRNA和tRNA产生成熟末端
核苷酸转移转移CCA到某些tRNA的3’末端
碱基化学修饰mRNA和rRNA中偶发的甲基化
tRNA和snRNA中的普遍碱基修饰
核苷酸切除和替换tRNA鸟嘌呤的过度修饰产生二氢尿嘧啶(Q)和假尿嘧啶(W)
加帽在真核生物mRNA5’末端加上7—甲基鸟嘌呤
多腺苷酸化在大多数真核生物和少数细菌mRNA3’末端加上多腺苷酸尾巴
剪接去除大多数内含子(经常是顺式,偶尔反式)
剪接(连接)去除tRNA内含子
编辑通过碱基修饰改变mRNA所携带信息,在编码区中插人或缺失碱基
13.1非翻译RNA的加工
13.1.1tRNA剪切和成熟
有些tRNA基因是被单独转录的,另一些则作为多顺反子的一部分转录,如在大肠杆菌中,一些tRNA与rRNA基因在共同的操纵子中一起转录。
根据其来源不同,前体tRNA可能要经过七种不同的加工反应。
多顺反子tRNA或tRNA和rRNA混合转录本中,单个的tRNA通过在成熟的5’端(经常是鸟嘌呤)切除而释放。
在大肠杆菌中,这个功能由核糖核酸酶P完成。
未成熟的3’末端由外切酶(可能涉及核糖核酸酶D)降解,直到出现三核苷酸基序CCA。
如果没有CCA的模体,那么就通过tRNA核苷酸转移酶(tRNAnucleotidyltransferase)在分子的3’末端加上三核苷酸。
所有成熟的tRNA末端都有CGA。
在真核生物和古细菌中,有些tRNA基因含有需要切除的内含子,这就涉及剪切、末端修饰和RNA连接(见tRNA核内含子)。
前体tRNA还需要碱基修饰加工过程:
tRNA中的碱基大多数是主要碱基,但大约10%在tRNA合成中被修饰,通常在原位通过转录后化学修饰完成。
鸟嘌呤高度修饰的衍生物产生二尿嘧啶和假尿嘧啶,通过类似与DNA中切除修复的核酸切除和置换反应而插入。
核内小分子核RNA中的尿嘧啶也被广泛修饰,所以也称为U—RNA。
13.1.2rRNA的剪切和成熟
细菌和真核生物都合成多顺反子rRNA转录本。
在细菌中有七个rRNA操纵子(rrn),包含编码所有三种rRNA的基因以及某些tRNA基因。
16S和23S前体rRNA通过碱基配对形成茎环结构。
这可能是核酸酶Ⅲ的底物,核酸酶Ⅲ对茎部剪切后释放单个前体。
成熟的末端是通过外切酶的加工完成的。
在哺乳动物中,5SrRNA由RNA聚合酶Ⅲ转录单顺反子转录得到一成熟分子,不需要加工。
RNA聚合酶I合成的45S的pre—rRNA,包含5.8S,18S和28S的rRNAs。
偶尔在多顺反子的转录本中核糖部分被甲基化,其中大多数在成熟rRNA中保留,说明它们的功能可能是决定转录本的哪部分保留,哪些部分需要去除。
在合成过程中,45SrRNA在核内与核糖核蛋白复合物缔合,加工也在此处发生。
这样的复合物称为加工体或核内小分子核糖核酸蛋白(snoRNP)(后者是smallnucleolarribonucleoprotein的缩写,并包含U3snRNA)。
加工中间体的大小表明外切剪切产生了成熟的终点和必须进一步加工的初步片段。
在剪切的同时,一些低等的真核生物rRNAs含有自身剪接的内含子,要产生有功能的rRNA这些内含子所必须被去除。
13.2mRNA的末端修饰和甲基化
细菌和真核生物mRNA的加工细菌的mRNA一般不稳定,很少被修饰——它经常在几分钟内完成合成、翻译和降解的过程。
相反,真核生物的mRNA较稳定,转运前它在核内被广泛地加工。
真核生物的pre—mRNA可以进行几种类型的加工反应:
末端的加帽和多腺苷酸化;内部的剪接和编辑等修饰;内部腺嘌呤甲基化的化学修饰(这种加工的功能还不清楚)。
真核生物的mRNA前体在核中并不是以裸露的核酸形式存在,而是与很多的高丰度蛋白结合形成不均一的核糖核酸蛋白体(heterogenousribonucleoproteins,hnRNPs)。
这些蛋白有RNA结合的基序(参见核酸结合蛋白),但以不同的专一性与RNA结合,反映了对不同碱基组成结合的倾向性。
蛋白可能以像单链DNA结合蛋白相同的方式作用,消除RNA的二级结构,使其与剪接装置的成分相互作用。
它们也可以作为特殊的RNA加工因子如剪接蛋白的特殊停泊位点等。
13.2.1加帽
一旦转录起始,真核生物新生mRNA通过在5’端加上倒转的鸟苷酸三磷酸而加帽。
这个快速反应由鸟苷酸转移酶(mRNAguanyltransferase)催化,产生一特殊的5’→5’磷酸酯键。
这个酶与RNA聚合酶Ⅱ起始复合物中的成分结合,因为不仅mRNA,RNAPⅡ转录的snRNA也要被加帽(RNA聚合酶Ⅲ转录的snRNA如U6snRNA不加帽)。
5’帽子结构是通过鸟嘌呤甲基转移酶(guaninemethyltransferase)在G7位甲基化,产生0型帽子(typezerocap),这在酵母中占绝对优势。
在更高等的真核生物中,在下一碱基的核糖O2’位置加上甲基(转录本中第一个残基,对应位置为+1),产生1型帽子(typelcap)。
如果这个位置是腺嘌呤,N6位的碱基也可能被甲基化。
在有些物种中,+2位的碱基也被甲基化,产生2型帽子(type2cap),同样也是在核糖的02’位置上。
真核生物中5’端的帽子对几种RNA的功能是很重要的。
5’端的帽子是运出核孔所必需的;对于核糖体结合,防止RNA5’端降解也很重要,这可以解释为什么几乎所有真核生物的mRNA都是单顺反子。
加帽反应可以用来调节蛋白合成,如一些动物中卵细胞成熟过程那样。
大多数RNA病毒对它们的基因组和mRNA上加帽,但是细小核糖核酸病毒,它的感染策略是避开缺乏加帽的能力,在它们的基因组的5’末端加上病毒蛋白。
正粘病毒也不能在基因组中加帽,但可以从宿主mRNA中偷取帽子,这样的过程称为抢帽(capsnatching)。
13.2.2多腺苷酸化
真核生物中RNA聚合酶Ⅱ转录终止发生在成熟转录本的3’端下游几千碱基之后,其精确机制目前还不是很清楚。
3’端通过内切,接着进行多腺苷酸化(polyadenylation),加上不同数量(经常为200个左右)的腺嘌呤,形成多腺嘌呤的尾巴(polyadenylateorpolyAtail)。
在高等真核生物中,多腺苷酸化发生在高度保守的多腺苷酸化位点(AAUAAA)后10~30个碱基。
酵母中的多腺苷酸化位点变化较大。
剪切和多腺苷酸化是由多亚基的复合物进行,复合物中三聚的剪切多腺苷酸化专一性因子(cleavagepo1yadenylationspecificityfactor,CPSF)识别多腺苷酸化位点,由两个剪切因子(cleavagefactor)组成的内切酶,进行剪切反应,多腺嘌呤聚合酶(polyadenylatepo1ymeerase,PAP)催化加腺嘌呤复合物中还有其他一些未知成分。
这些成分中,被认为包含聚合酶Ⅱ的延伸成分,并与其磷酸化的羧端相作用。
多腺苷酸化起始时进行较慢,因为PAP每加上一个腺嘌呤后都要解离。
但当形成一小段多腺嘌呤后,另一成分多腺嘌呤结合蛋白(polyadenylatebindingprotein,PABP)与尾巴结合并加快了PAP的进度。
PABP通过一未知的机制,控制多腺嘌呤尾巴的最大长度。
多腺苷酸化具体的功能还不清楚。
它可能影响转录本的稳定性,在一些例子中,它在翻译过程起重要作用。
例如果蝇的bicoidmRNNA直到受精后,三种蛋白促进多腺嘌呤尾巴延伸后才开始翻译。
很少真核生物的转录本不进行多腺苷酸化,最值得一提的是组蛋白的mRNA和一些植物病毒的基因组。
组蛋白的转录本的二级结构负责3’端的成熟,这涉及U7snRNA和相关蛋白。
大多数细菌没有多腺嘌呤尾巴,但在一些物种中也发现了短的和相对不稳定的寡聚腺嘌呤尾巴。
利用多腺苷酸化,与其配对的合成多聚胸腺嘧啶可在体外扩增或纯化RNA。
用这种纯化方法,得到的大部分是mRNA,称为多腺嘌呤RNA组份[poly(A)+RNAfraction],其余成分为不含多腺膘吟成分,如rRNA、tRNA等。
因为mRNA在总RNA中比例很小(<5%),所以这一技术在纯化mRNA中很有用(如转录分析,cDNA克隆,反转录PCR)。
13.3RNA剪接
13.3.1内含子和剪接反应
内含子是高等真核生物基因中主要的非编码元件,在低等真核生物和有些细菌中也发现有内含子,RNA剪接(RNAsplicing)就是指精确去除内含子的过程。
内含子根据剪接方式的不同,分为四种类型(表13.2)。
除了tRNA前体内含子,所有的剪接机制都涉及一对按顺序进行的转酯反应。
在第一个反应中,一带有自由羟基的核苷酸进攻连接内含子和外显子的磷酸二酯键。
这样释放了外显子带其本身羟基的3’端。
在第二个反应中,自由羟基进攻连接内含子和下一个外显子的磷酸二酯键。
第二个反应将外显子连接在一起,并释放内含子。
三类转酯内含子有不同结构,起始羟经基供体不同,形成中间体性质不同,在反应是否是自身催化或需要有反式剪接体提供等方面也存在差异。
自身催化内含子称为自我剪接内含子,可以被认为是核酶(ribozyme)。
表13.2不同类型内含子和它们剪接方式的总结
内含子类型内含子性质和剪接机制
转酯内含子——内含子中的剪接识别位点
核pre-mRNA内含子结构变化
自由羟基的起始供体是内部分支位点腺嘌呤提供
形成套索结构的中间体
需要装配大的反式作用的剪接体
Ⅰ型自我剪接内含子保守的二级结构
鸟嘌呤核苷酸辅因子是自由羟基供体
没有套索结构形成
自我剪接
Ⅱ型自我剪接内含子保守的二级结构
内部腺嘌呤是自由羟基供体
形成套索结构的中间体
自身催化剪接
Ⅲ型自我剪接内含子与Ⅱ型内含子类似,但较小(100~200bp)包含数量有限的结构域
孪生内含子多嵌合自我剪接内含子,常为Ⅱ型
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