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山东大学细胞生物学大纲
细胞生物学教学大纲
第一章绪论
第一节细胞生物学的研究对象和范围
细胞生物学是从细胞整体、超微结构和分子水平上研究细胞的结构和生命活动规律的学科。
细胞生物学研究对象
细胞——是一切生物的基本结构单位,它是由膜围成的能独立进行繁殖的最小原生质团。
细胞生物学研究范围
⏹细胞的结构
⏹显微结构:
在光学显微镜下细胞的结构
⏹亚显微结构:
超微结构,电子显微镜下细胞的结构
⏹细胞的功能
⏹物质的吸收与分泌、合成与分解、增殖与分化、衰老与死亡、信息传递与转导以及遗传与变异等等
第二节细胞生物学的发展简史
⏹细胞的发现
⏹细胞学说的创立和细胞学的形成
⏹电镜下的细胞和细胞生物学的兴起
⏹分子细胞生物学的出现
细胞的发现
⏹最早发现细胞的是RobertHooke
⏹1665年从木栓中发现蜂巢状小室──细胞。
⏹创造了第一架有科研价值的显微镜,放大倍数40~140倍
细胞的发现
⏹第一次(1674年)观察到活细胞的是发现了池塘中的原生动物
⏹观察到了哺乳动物的精子
⏹自制显微镜,放大倍数达500倍
细胞学说的创立和细胞学的形成
⏹1838年,德国植物学家Schleidon提出:
所有的植物体都是由细胞组合而成的
细胞学说的创立和细胞学的形成
⏹1839年,德国动物学家认为:
动物体也是由细胞组成的,并肯定一切生物体都是由细胞组成的
细胞学说的创立和细胞学的形成
⏹二人的观点就是著名的“细胞学说”(celltheory),和同时成为细胞学说创始人。
⏹1855年,德国病理学家提出:
“细胞来自细胞”,对细胞学说做了重要补充。
“细胞学说”主要内容
⏹细胞是多细胞生物的最小结构单位,对单细胞生物来说,一个细胞就是一个个体;
⏹多细胞生物的每一个细胞即是一个活动单位,执行特定的功能;
⏹细胞只能由细胞分裂而来。
原生质理论
⏹1835年,发现了动物细胞中的粘液质,将其称为“肉样质”(sarcode);
⏹1840年,Purkinje发现了植物细胞中的物质,将其称为“原生质”(protoplasm);
⏹原生质学说——细胞是有膜包围的原生质团
细胞学的经典时期
⏹细胞结构的重要发现
⏹1880年,发现中心体
⏹1898年,发现线粒体
⏹1898年,发现高尔基体
⏹细胞功能的重要发现
⏹1885年,发现并提出有丝分裂
⏹1905年,等发现并提出减数分裂
细胞学的形成
⏹于1892年发表了《细胞与组织》的著名著作,这一著作标志着细胞学(Cytology)作为一门独立的生物学科的建立。
⏹Wilson,.于1896年发表了名为《发育和遗传中的细胞》一书,成为细胞学史上第一部有系统的细胞学。
电镜下的细胞和细胞生物学的兴起
⏹1933年,德国科学家Ruska(鲁斯卡)在西门子公司(Siemens)设计制造出世界上第一台电子显微镜,大大提高了显微镜的放大倍数。
分子细胞生物学的出现
⏹20世纪60年代,人们发现基质中有微管、微丝的存在,并构成纵横交错的骨架,总称细胞骨架(cytoskeleton);
⏹细胞骨架的发现是细胞超微结构研究方面的重大进展。
同时由于分子生物学的发展,将细胞生物学带入分子时代。
第三节细胞生物学的研究进展
⏹对生物膜、线粒体、核糖体、细胞骨架以及染色体等的分子结构和功能研究方面取得了深入进展。
⏹在基因组结构和基因表达与蛋白质合成方面取得了大量成果。
⏹细胞工程领域硕果累累
⏹单克隆抗体制备
⏹转基因动物、转基因植物的开发与利用
⏹克隆技术的研究
⏹胚胎与组织干细胞研究的广泛开展
第二章细胞生物学研究方法
第一节形态结构
一、光学显微镜
(一)普通光学显微镜
影响显微镜成像清晰度最关键的因素是显微镜的分辨率
分辨率是指显微镜能将相近的两个质点分辨清楚的能力
分辨率(resolution)公式:
D=λ/.
♦D——分辨率λ——光波波长N.A.——镜口率(数字孔径)N.A.=N∙Sinα/2
(二)特殊显微镜暗场显微镜
◆原理:
显微镜加装特殊装置,使直射光不能进入物镜,只允许被标本反射、衍射的光线进入物镜
◆特点:
视野的背景是暗的,样品是的边缘是亮的。
特殊装置:
在聚光器中加装中央遮光板或者使用暗视野聚光器
相差显微镜(phasecontrastmicroscope)
二、电子显微镜
⏹电子显微镜以电子束代替了可见光,大大提高了显微镜的分辨率,可以观察细胞的亚显微结构
⏹电子束的波长与电压成反比,波长极短
◆例如,电压为6万伏,则λ=埃
◆比最短的可见光4000埃约小10万倍
电镜的基本构造:
电镜与光镜的主要区别:
光学显微镜电子显微镜
光源可见光电子束
介质空气(香柏油)真空
聚光镜光学透镜电磁透镜
分辨力
放大倍数1000倍百万倍
电子显微镜主要种类:
⏹透射式电子显微镜(TEM)主要用于观察标本内部细微结构
⏹扫描式电子显微镜(SEM)主要用于观察标本表面形态结构
⏹扫描隧道显微镜(STM)
⏹电镜技术:
冰冻断裂和冰冻蚀刻
冰冻断裂和冰冻蚀刻电镜技术:
(freeze—fracture;freeze—etching)
⏹目的:
主要用于研究生物膜结构
⏹主要步骤:
⏹冰冻标本(-1000C干冰或-1960C液氮),冷刀断开标本(冰冻断裂),升温,冰升华,断裂面结构暴露(蚀刻),表面喷一层蒸汽碳和铂,将组织溶掉,碳和铂的膜称复膜(replica),电镜下观察复膜,复膜构造=标本构造
扫描隧道显微镜(STM)(scanningtunnelingmicroscope)
⏹可观察晶体表面原子图像
⏹主要部件扫描探针由钨丝或白金丝制成,直径几个埃
⏹原理:
电子在样品与探针之间(距离几个埃)转移可形成隧道电流,当
⏹优点:
分辨力高;三维图像;电压低(2mV—2V);不用真空(常压、液态);速度快。
第二节生物化学分析
一、组织化学法
*利用染色的方法进行原位分析
*福尔根(Feulgen)反应:
鉴定DNA
*PAS反应(高碘酸席夫反应):
鉴定多糖类物质
⏹二者皆有醛基与Schiff试剂反应,生成红色化合物
二、免疫细胞化学
⏹特异蛋白抗原的定性与定位
⏹方法:
原位分析;体外蛋白质分析★
(一)原位分析:
免疫反应:
◆直接法:
Ag+Ab*→镜检;间接法:
Ag+Ab1+Ab2*→镜检。
*代表标记物
标记物可以为多种:
⏹荧光素─免疫荧光技术或称荧光抗体法,酶─酶标抗体法,放射性同位素标记—放射自显影,铁蛋白标记,免疫胶体金技术
(二)体外蛋白质分析
⏹蛋白质印迹法(Westernblotting)
⏹技术路线:
(图)
◆样品制备—样品分离—样品转移—免疫反应——检测
⏹蛋白质由SDS聚丙烯凝胶→硝酸纤维素膜转移的过程即为印迹(blotting)
三、显微光谱分析技术
⏹定量细胞化学分析技术
◆细胞显微分光光度术(Microspectrophotometry)
⏹流式细胞术(FlowCytometry)★
流式细胞术
*仪器:
流式细胞计—flowcytometer
*特点:
细胞是高速运动的
*主要应用:
用于定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量;测定细胞群体中不同时相细胞的数量;从细胞群体中分离某些特异染色的细胞;分离DNA含量不同的中期染色体;混合细胞分离。
五、超离心技术(ultracentrifugation)
⏹高速离心:
10000—25000r/min;超速离心:
转速大于25000r/min
⏹沉降系数(“S”—Svedbergunit):
单位离心场中溶质分子的沉降速度。
1S相当于1⨯10-13s
⏹离心目的:
分离细胞器与生物大分子及其复合物
离心种类:
⏹分析离心:
用于分析和测定制剂中的大分子的种类和性质等
⏹制备离心
◆差速离心:
分离密度不同的细胞组分
◆密度剃度离心:
精细组分或生物大分子的分离(介质蔗糖、氯化铯)
六、分子杂交技术
⏹细胞内特异核酸的定性定位
◆原位杂交
♦光镜水平的原位杂交技术——同位素标记或荧光素标记的探针
♦电镜水平的原位杂交技术—生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金标记结合
⏹体外分析核酸的主要方法:
Southernblotting又称DNA印迹法;Northernblotting又称RNA印迹法
原位杂交(insituhybridization)
⏹分子杂交(molecularhybridization)是利用DNA高温变性、低温复性原理形成杂交分子的过程
⏹杂交分子形式:
DNA—DNA;DNA—RNA;RNA—RNA
⏹原位杂交是在分子杂交基础上建立起来的
七、PCR技术
⏹聚合酶链式反应;引物:
寡核苷酸链;原料:
dNTP;酶:
DNA聚合酶(耐高温)
第三节细胞生理学技术
1、膜电位检测技术
细胞内外存在电位差(20~100mV)称为膜电位,膜电位的变化反应了细胞的生理变化
2、膜片钳位记录技术
主要用于检测单个特定离子通道性质及变化
3、细胞电泳
细胞表面带有许多电荷,因而可以在外加电场的作用下移动
第四节实验操作技术
一、细胞培养(cellculture)
⏹动物细胞培养
⏹植物细胞培养
(一)动物细胞培养
细胞培养主要方式
⏹克隆培养(clonalculture):
克隆又称无性繁殖系或无性系
⏹群体培养(massculture)
◆体外培养细胞生长特点:
单层细胞培养
贴壁生长;接触抑制现象
⏹转鼓培养法
◆为了大量获取细胞而使细胞始终悬浮不贴壁的培养方法
细胞培养相关概念:
⏹原代培养(primaryculture):
从机体中取出细胞后直接培养,得到原代细胞(一般指分裂10代以内的细胞)。
◆分离细胞的主要方法★
⏹传代培养(sub—culture):
适合在体外进行的持续性培养,传代培养的细胞称传代细胞。
⏹细胞株(cellstrain)在培养过程中仍然保持其特征(二倍体)及接触抑制的传代细胞。
⏹细胞系(cellline)在培养条件下发生突变后可以无限增殖的细胞群,接触抑制丧失。
◆例:
HeLa细胞系;CHO细胞系
⏹动物细胞的无血清培养:
在培养液当中不加血清,从而去除因血清成分复杂对实验结果的影响。
⏹细胞培养常需要从组织中分离细胞
⏹分离细胞的主要方法
◆酶法:
动物组织—胰蛋白酶;植物组织—果胶酶
◆非酶法:
EDTA与Ca2+螯合
(二)植物细胞培养
⏹植物细胞—再生植株
⏹植物细胞培养分为:
花药或花粉培养;胚和胚株培养;颈顶端培养;叶肉细胞培养;原生质体培养
1、花药或花粉培养
⏹花粉培养液愈伤组织分化培养基长出茎叶另一分化培养基根形成花盆植株
5、原生质体培养
⏹植物细胞纤维素酶、果胶酶去壁原生质体高渗培养基生成细胞壁分化培养基愈伤组织……
二、显微操作术:
micromanipulation显微操作仪
三、细胞融合
⏹细胞杂交技术(cellhybridization)
⏹单克隆抗体技术(monoclonalantibody)
⏹细胞拆和
◆1、物理法:
针、管、光;2、化学法:
细胞松弛素B
核体(小细胞);胞质体
四、核型与染色体显带
⏹核型
⏹染色体显带Q带:
喹丫因染色;G带:
吉姆萨(Giemsa)染色;C带:
染着丝粒R带:
“反带”;T带:
丫啶橙,“端粒带”;N带:
Ag染法
第三章细胞的基本概念
第一节细胞的基本特征
*细胞的基本概念
•细胞:
有膜包围的能独立进行繁殖的最小原生
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