乳糖微生物限度检查法分析方法验证.docx
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乳糖微生物限度检查法分析方法验证.docx
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乳糖微生物限度检查法分析方法验证
乳糖微生物限度检查分析方法验证方案
2006年XX月
验证方案起草审批表
部门
姓名
签名
日期
起草人
质量控制部
审
批
人
质量控制部
质量保证部
副总
验证方案目录
1、目的
2、适用范围
3、接受标准
4、所需仪器校验情况
5、验证方法
6、人员和职责
乳糖微生物限度检查分析方法验证方案
1目的:
建立乳糖微生物限度分析方法,包括细菌数、霉菌数及酵母菌数的检查以及控制菌的检查,并对分析方法进行验证,以证明所采用的方法适合于乳糖微生物限度的检查,为日常的检测工作提供依据。
2适用范围:
适用于进厂的辅料乳糖微生物限度检查。
3可接受的标准:
3.1细菌、霉菌数及酵母菌计数方法的验证可接受的标准
3.1.1在3次独立的平行试验中,稀释剂对照组的菌回收率(稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率)应均不低于70%。
3.1.2在3次独立的平行试验中,试验组的菌回收率(试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率)应均不低于70%。
3.2控制菌检查验证可接受的标准
3.2.1阴性菌对照组不得检出阴性对照菌,试验组检出试验菌。
3.2.2阴性对照应无菌生产,供试品应无菌生长。
4所需仪器校验情况:
应有所需仪器检定时间、检定部门及有效期。
5验证方法:
5.1细菌、霉菌数及酵母菌计数方法的验证(直接接种法)
5.1.1试验用的菌种:
(1)金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B)26003]
(2)大肠埃希菌(Escherichiacoli)[CMCC(B)44102]
(3)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B)63501]
(4)白色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC(F)98001]
(5)黑曲霉(Aspergillusniger)[CMCC(F)98003]
5.1.2培养基及稀释液
培养基:
改良马丁琼脂培养基、营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基。
稀释液:
0.9%氯化钠溶液、PH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液
5.1.3试验步骤
5.1.3.1培养基的配制和灭菌
将改良马丁琼脂培养基、营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基按照购买厂家的使用说明书进行配制,在121℃的温度条件下灭菌20min冷却后备用。
5.1.3.2滤器及滤膜
将试验所用的培养皿,研钵及其他所需用具和溶液用牛皮纸包好,把试验用的滤器、手术镊洗净、擦干,放于带盖的容器内(瓷盒或铝制饭盒),盖严,用牛皮纸包裹好,将滤膜用纯化水漂洗后放入带盖的培养皿中,用牛皮纸包裹好放在高效灭菌器中,在121℃的温度条件下灭菌20分钟冷却后备用。
5.1.3.3菌液制备
接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养琼脂培养基中,在30~35℃培养18~24小时;接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基中,在23~28℃培养24~48小时。
上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50~100cfu的菌悬液。
接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中,在23~28℃培养5~7天,加入3~5ml0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱。
然后,吸出孢子悬液(用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管)至无菌试管内,用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50~100cfu的孢子悬液。
5.1.3.4供试液的制备
取乳糖10g,加入90mlPH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中溶解,混匀,作为1:
10的供试液。
5.1.3.5具体操作
a试验组
用吸管分别取上述1:
10供试液1ml和含试验菌50-100CFU的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌悬液,每种试验菌平行测定两份。
前3种菌加入平皿中并加入营养琼脂培养基,后2种菌加入平皿中并加入玫瑰红钠琼脂培养基。
b菌液组(测定所加的试验菌数)
取和试验组一样多的试验菌加入平皿后培养。
c供试品对照组
取和试验组一样稀释级别的供试液1ml,加入平皿中,平行操作4份,2份加入营养琼脂培养基并培养,另2份加入玫瑰红钠琼脂培养基并培养。
d稀释剂对照组
用吸管分别取稀释液1ml和含试验菌50-100CFU的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌悬液,置平皿中,每种试验菌平行测定两份。
前3种菌营养琼脂培养基,后2种菌加入平皿中并加入玫瑰红钠琼脂培养基。
e阴性对照
用吸管分别取PH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1ml置平皿中,分别加入营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基并培养。
5.1.3.6按5.1.3.5独立平行操作3份。
5.1.3.7培养及计数
分别将玫瑰红钠琼脂培养基在23~28℃培养72小时,逐日计数,以72小时的菌落数报告,营养琼脂培养基在30~35℃培养48小时逐日计数,以48小时的菌落数报告。
5.2控制菌检查的验证
5.2.1试验用的菌种
(1)金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B)26003]
(2)大肠埃希菌(Escherichiacoli)[CMCC(B)44102]
5.2.2培养基及稀释液
培养基:
营养琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、营养肉汤培养基。
稀释液:
0.9%氯化钠溶液、PH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液
5.2.3试验步骤
5.2.3.1培养基的配制和灭菌
将营养琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、营养肉汤培养基按照购买厂家的使用说明书进行配制,在121℃的条件下灭菌20min冷却后备用。
5.2.3.2试验用具
将试验所用的培养皿用不锈钢培养皿消毒桶盛放,其他所需用具和溶液用牛皮纸包好,在121℃的温度条件下灭菌20分钟冷却后备用。
5.2.3.3菌液制备
接种大肠埃希菌新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中,培养18~24小时。
用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10~100cfu的菌悬液。
5.2.3.4供试液的制备
见5.1.3.4供试液的制备
5.2.3.5具体操作
a试验组
分别取上述5.1.3.4中1:
10供试液10ml和含试验菌50~100cfu大肠埃希菌的菌悬液,置于盛放有90ml胆盐乳糖培养基中。
b阴性菌对照组
分别取上述5.1.3.4中1:
10供试液10ml和含试验菌50~100cfu金黄色葡萄球菌的菌悬液,置于100ml的胆盐乳糖培养基中。
c阴性对照
取PH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10ml,置于100ml的胆盐乳糖培养基中。
D供试品的测试
取上述5.1.3.4中1:
10供试液10ml,置于100ml的胆盐乳糖培养基中。
5.2.3.6培养及计数
将胆盐乳糖培养基放入培养箱中,在35-37℃培养18-24小时,必要时延长至48小时计数。
6人员和职责:
XXX:
负责审核验证方案和报告,组织实施验证。
XXX:
负责验证过程中的具体操作及验证记录的完成。
XXX:
负责验证方案和报告的起草以及原始记录的复核。
XXX:
负责验证草案和验证报告的审批、验证过程的管理。
XX:
负责验证草案和验证报告的批准。
验证报告起草审批表
部门
姓名
签名
日期
起草人
质量控制部
审
批
人
质量控制部
质量保证部
副总
验证报告目录
1目的
2适用范围
3接受标准
4所需仪器校验情况
5验证方法
6验证结果与评价
7附录
乳糖微生物限度检查法分析方法的验证报告
1目的:
乳糖微生物限度检查法分析方法的验证已经完成,具体的验证结果和试验批号见下列报告。
在以后的微生物限度检查中,乳糖微生物限度检查法按照验证的方法和实验条件进行操作。
2适用范围:
适用于进厂的辅料乳糖微生物限度检查。
3可接受的标准:
3.1细菌、霉菌数及酵母菌计数方法的验证可接受的标准
3.1.1在3次独立的平行试验中,稀释剂对照组的菌回收率(稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率)应均不低于70%。
3.1.2在3次独立的平行试验中,试验组的菌回收率(试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率)应均不低于70%。
3.2控制菌检查验证可接受的标准
3.2.1阴性菌对照组不得检出阴性对照菌,试验组检出试验菌。
3.2.2阴性对照应无菌生产,供试品应无菌生长。
4所需仪器校验情况。
仪器
型号
校正时间
有效期至
生化培养箱
LRH-250
生化培养箱
LRH-250
超净工作台
YJ-900
超净工作台
YJ-1450
检查人:
日期:
5验证方法:
5.1细菌、霉菌数及酵母菌计数方法的验证(平皿法)
5.1.1试验用的菌种:
(1)金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B)26003]
(2)大肠埃希菌(Escherichiacoli)[CMCC(B)44102]
(3)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B)63501]
(4)白色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC(F)98001]
(5)黑曲霉(Aspergillusniger)[CMCC(F)98003]
5.1.2培养基及稀释液
培养基:
改良马丁琼脂培养基、营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基。
稀释液:
0.9%氯化钠溶液,PH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液
5.1.3试验步骤
5.1.3.1培养基的配制和灭菌
将改良马丁琼脂培养基、营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基按照购买厂家的使用说明书进行配制,在121℃的条件下灭菌20min冷却后备用。
5.1.3.2滤器及滤膜
将试验所用的培养皿用不锈钢培养皿消毒桶盛放,其他所需用具和溶液用牛皮纸包好,在121℃的温度条件下灭菌20分钟冷却后备用。
5.1.3.3菌液制备
接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养琼脂培养基中,在30~35℃培养18~24小时;接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基中,在23~28℃培养24~48小时。
上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50~100cfu的菌悬液。
接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中,在23~28℃培养5~7天,加入3~5ml0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱。
然后,吸出孢子悬液(用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管)至无菌试管内,用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50~100cfu的孢子悬液。
5.1.3.4供试液的制备
a取乳糖10g,加入90mlPH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中溶解,混匀,作为1:
10的供试液。
5.1.3.5具体操作
a试验组
用吸管分别取上述1:
10供试液1ml和含试验菌50-100CFU的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌悬液,每种试验菌平行测定两份。
前3种菌加入平皿中并加入营养琼脂培养基,后2种菌加入平皿中并加入玫瑰红钠琼脂培养基。
b菌液组(测定所加的试验菌数)
取和试验组一样多的试验菌过滤后培养。
c供试品对照组
取和试验组一样稀释级别的供试液1ml,加入平皿中,平行操作4份,2份加入营养琼脂培养基并培养,另2份加入玫瑰红钠琼脂培养基并培养。
d稀释剂对照组
用吸管分别取稀释液1ml和含试验菌50-100CFU的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌悬液,置平皿中,每种试验菌平行测定两份。
前3种菌营养琼脂培养基,后2种菌加入平皿中并加入玫瑰红钠琼脂培养基。
e阴性对照
用吸管分别取PH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1ml置平皿中,分别加入营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基并培养。
5.1.3.6按5.1.3.5独立平行操作3份。
5.1.3.7培养及计数
分别将玫瑰红钠琼脂培养基在23~28℃培养72小时,逐日计数,以72小时的菌落数报告,营养琼脂培养基在30~35℃培养48小时逐日计数,以48小时的菌落数报告。
5.2控制菌检查的验证
5.2.1试验用的菌种
(1)金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B)26003]
(2)大肠埃希菌(Escherichiacoli)[CMCC(B)44102]
5.2.2培养基及稀释液
培养基:
营养琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、营养肉汤培养基。
稀释液:
0.9%氯化钠溶液、PH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液
5.2.3试验步骤
5.2.3.1培养基的配制和灭菌
将营养琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、营养肉汤培养基按照购买厂家的使用说明书进行配制,在121℃的条件下灭菌20分钟冷却后备用。
5.2.3.2滤器及滤膜
将试验所用的培养皿用不锈钢培养皿消毒桶盛放,其他所需用具和溶液用牛皮纸包好,在121℃的温度条件下灭菌20分钟冷却后备用。
5.2.3.3菌液制备
接种大肠埃希菌新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中,培养18~24小时。
用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10~100cfu的菌悬液。
5.2.3.4供试液的制备
见5.1.3.4供试液的制备
5.2.3.5具体操作
a试验组
分别取上述5.1.3.4中1:
10供试液10ml和含试验菌50~100cfu大肠埃希菌的菌悬液,置于100ml的胆盐乳糖培养基中。
b阴性菌对照组
分别取上述5.1.3.4中1:
10供试液10ml和含试验菌50~100cfu金黄色葡萄球菌的菌悬液,置于100ml的胆盐乳糖培养基中。
c阴性对照
取PH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10ml,置于100ml的胆盐乳糖培养基中。
D供试品的测试
取上述5.1.3.4中1:
10供试液10ml,置于100ml的胆盐乳糖培养基中。
5.2.3.6培养及计数
将胆盐乳糖培养基放入培养箱中,在35-37℃培养18-24小时,必要时延长至48小时计数。
5.3测定结果
5.3.1细菌数、霉菌数及酵母菌数的验证结果
营养琼脂培养基培养温度:
培养时间:
培养箱编号:
玫瑰红钠琼脂培养基培养温度:
培养时间:
培养箱编号:
试验项目
菌落计数(CFU/皿)
第一次
第二次
第三次
平皿1
平皿2
平均值
平皿1
平皿2
平均值
平皿1
平皿2
平均值
阴性对照
供试品对照组
营养琼脂培养基
玫瑰红钠琼脂培养基
试验组
培养基名称:
营养琼脂培养基
菌种及批号
CMCC(B)44102
(大肠埃希菌)
CMCC(B)26003
(金黄色葡萄球菌)
CMCC(B)63501
(枯草芽孢杆菌)
培养基名称:
玫瑰红钠琼脂培养基
CMCC(F)98001
(白色念珠菌)
CMCC(F)98003
(黑曲霉)
菌液组
培养基名称:
营养琼脂培养基
CMCC(B)44102
(大肠埃希菌)
CMCC(B)26003
(金黄色葡萄球菌)
CMCC(B)63501
(枯草芽孢杆菌)
培养基名称:
玫瑰红钠琼脂培养基
CMCC(F)98001
(白色念珠菌)
CMCC(F)98003
(黑曲霉)
稀释剂对照组
培养基名称:
营养琼脂培养基
CMCC(B)44102
(大肠埃希菌)
CMCC(B)26003
(金黄色葡萄球菌)
CMCC(B)63501
(枯草芽孢杆菌)
培养基名称:
玫瑰红钠琼脂培养基
CMCC(F)98001
(白色念珠菌)
CMCC(F)98003
(黑曲霉)
5.3.2回收率
菌种
组名称
菌回收率
第1次
第2次
第3次
大肠埃希菌
稀释剂对照组
试验组
枯草芽孢杆菌
试验组
稀释剂对照组
金黄色葡萄球
试验组
稀释剂对照组
白色念珠菌
试验组
稀释剂对照组
黑曲霉
试验组
稀释剂对照组
结论:
试验人:
日期:
复核人:
日期:
5.3.3控制菌
培养箱编号:
培养温度:
培养时间:
培养基名称:
胆盐乳糖培养基
试验项目
培养结果
阴性对照
供试品组
试验组
菌种及批号
CMCC(B)44102(大肠埃希菌)
阴性菌对照组
CMCC(B)26003(金黄色葡萄球菌)
结论:
试验人:
日期:
复核人:
日期:
6、验证结果与评价
乳糖微生物限度检测法的测定方法,在细菌数、霉菌数及酵母菌数的验证中分别用大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌、黑曲霉、白色念珠菌五种菌种逐一进行了验证,在3次独立的平行试验中,稀释剂对照组的菌回收率均高于70%,试验组的菌回收率均高于70%。
阴性对照为阴性,供试品对照组的检验结果在标准内。
在控制菌的验证中分别用大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌两种菌种进行了验证,阴性菌对照组未检出阴性对照菌,试验组检出试验菌,阴性对照无菌生产,供试品无菌生长。
所以配制培养基和做样过程中要用到的用具的灭菌条件均可行,计数方法准确和控制菌方法专属性强,能满足乳糖微生物限度检查的需要,此分析方法是可行的。
在以后的微生物限度检测中,检验人员按照验证的分析方法进行乳糖微生物限度检查。
若药品组分或原检验条件发生了改变时,检查方法应重新验证。
7、附录
7.1无菌操作规程
7.2微生物及无菌检查方法的验证操作程序
7.3后附偏差处理报告。
偏差记录
日期报告人
允许偏差
参考
描述偏差的性质
偏差对性能确认的影响
纠正措施
偏差是否满意解决
备注
记录人日期
复核人日期
- 配套讲稿:
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- 乳糖 微生物 限度 检查法 分析 方法 验证