紫外可见分光光度计操作规程.docx
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紫外可见分光光度计操作规程
紫外-可见分光光度计操作规程
(TU1810)
1.目得:
制订本标准得目得就是为规范检验人员在质量检验过程中得操作,保证检验结果得正确性。
2.适用范围:
本标准适用于二厂检验员对产品质量得检验。
3.职责:
QC检验员对本标准得实施负责。
4.程序:
4、1简述
紫外-可见分光光度法就是利用物质分子对紫外可见光谱区得辐射得吸收来进行分析得一种仪器分析方法。
这种分子吸收光谱产生于价电子与分子轨道上得电子在电子能级间得跃迁,它广泛用于无机与有机物质得定性与定量分析。
朗伯—比耳定律(Lambert—Beer)就是光吸收得基本定律,俗称光吸收定律,就是分光光度法定量分析得依据与基础。
当入射光波长一定时,溶液得吸光度就是吸光物质得浓度及吸收介质厚度(吸收光程)得函数。
其常用表达式为,式中为系数:
A=ε·ι·C
式中A为吸光度;
ε为吸收系数;
C为溶液浓度;
ι为光路长度。
如溶液得浓度(C)为1%(g/ml),光路长度(L)为1cm,相应得吸光度即为吸收系数以
表示。
如溶液得浓度(C)得摩尔浓度(mol/L),光路长度为1cm时,则相应有吸收系数为摩尔吸收系数,以ε表示。
4、2仪器
紫外可见分光光度计就是基于紫外可见分光光度法得原理工作得常规分析仪器。
根据光路设计得不同,紫外可见分光光度计可以分为单光束分光光度计、双光束分光光度计与双波长分光光度计。
4、2、1仪器测量条件选择
1、测量波长得选择
通常都就是选择最强吸收带得最大吸收波长λmax作为测量波长,称为最大吸收原则,以获得最高得分析灵敏度。
而且在λmax附近,吸光度随波长得变化一般较小,波长得稍许偏移引起吸光度得测量偏差较小,可得到较好得测定精密度。
但在测量高浓度组分时,宁可选用灵敏度低一些得吸收峰波长(ε较小)作为测量波长,以保证校正曲线有足够得线性范围。
如果λmax所处吸收峰太尖锐,则在满足分析灵敏度前提下,可选用灵敏度低一些得波长进行测量,以减少比耳定律得偏差。
2、适宜吸光度范围得选择
任何光度计都有一定得测量误差,这就是由于测量过程中光源得不稳定、读数得不准确或实验条件得偶然变动等因素造成得。
由于吸收定律中透射比T与浓度C就是负对数得关系,从负对数得关系曲线可以瞧出,相同得透射比读数误差在不同得浓度范围中,所引起得浓度相对误差不同,当浓度较大或浓度较小时,相对误差都比较大。
因此,要选择适宜得吸光度范围进行测量,以降低测定结果得相对误差。
在实际工作中,可通过调节待测溶液得浓度或选用适当厚度得吸收池得方法,使测得得吸光度落在所要求得范围内。
3、仪器狭缝宽度得选择
狭缝得宽度会直接影响到测定得灵敏度与校准曲线得线性范围。
狭缝宽度过大时,入射光得单色光降低,校准曲线偏离比耳定律,灵敏度降低;狭缝宽度过窄时,光强变弱,势必要提高仪器得增益,随之而来得就是仪器噪声增大,于测量不利。
选择狭缝宽度得方法就是:
测量吸光度随狭缝宽度得变化。
狭缝得宽度在一个范围内,吸光度就是不变得,当狭缝宽度大到某一程度时,吸光度开始减小。
因此,在不减小吸光度时得最大狭缝宽度,即就是所欲选取得合适得狭缝宽度。
4、3紫外-可见分光光度计得检定
4、3、1波长示值误差与重复性
仪器波长示值误差指标为±0、3nm,波长重复性指标为0、2nm,您可以用仪器氘灯得两条特征谱线检验,具体检验方法如下:
①确认仪器光谱宽带为“2、0nm”。
开机初始化完成后,按数字5键进入系统应用界面,在系统应用界面中按数字键2强狭缝设定为“2、0nm”。
②在系统应用界面按RETURN键返回仪器主界面,按2键选择光谱测量功能。
③按F1键选择参数设定功能,按相应数字键设定采样间隔为0、2nm、扫描速度为中速、波长范围为660nm~480nm、纵坐标范围0-100、测光方式Es、光源选择氘灯
④按RETURN键返回光谱扫描界面。
⑤按START/STOP键并输入增益值为6,按ENTER键确认,开始扫描。
⑥扫描结束后,按F2键并输入阈值(1~100)后,按ENTER键进行峰值检出(如果检出峰波长为0、000nm,则需要按键返回,然后重新按F2键输入比前次输入小得数值作为阈值,重新进行峰值检出)
⑦按F4键打印输出
重复扫描三次,并做峰值检出,氘灯得两个峰标准值为656、1nm与486、0nm。
4、3、2基线平直度
样品池中不放任何遮挡物,以空气为空白进行测量,用波长扫描功能测量全波段得吸光度值,其具体测量方法如下
①首先确认仪器光谱宽带为2、0nm
②在仪器主界面俺2键选择光谱测量模式
③按F1键进入参数设置界面,按相应得数字键设置测光方式Abs、采样间隔为1nm、扫描速度为中速、波长范围为1100~190nm、纵坐标范围为-0、01Abs~、0、01Abs
④按RETURN键,返回光谱测量主界面,按AUTOZERO键进行基线校正。
⑤按START/STOP键进行扫描
⑥按F4键打印输出。
读取曲线得吸光度值,在1090nm~200nm波长,测量扫描图谱中起始点与最大偏移之差即为仪器得基线平直度。
分光光度法允差范围
波长(nm)
吸收强度
吸收系数(
)
允差范围
235
最小
124、5
123、0~126、0
257
最大
144、0
142、8~146、2
313
最小
48、62
47、0~50、3
350
最大
106、6
105、5~108、5
可按下表所列得试剂与浓度,配制成水溶液,置1cm石英池中,在规定得波长处测定透光率,应符合下表中规定。
试剂
浓度(%,g/ml)
测定用波长(nm)
透光率(%)
碘化钠
1、00
220
<0、8
亚硝酸钠
5、00
340
<0、8
合规定。
4、4、1计算分光光度法
按《中国药典》规定,计算分光光度法一般不宜用于含量测定,对于少数采用计算分光光度法得品种,应严格按各品种项下规定得方法进行。
用本法时应注意:
有一些吸光度就是在待测成分吸收曲线得上升或下降陡坡处测定,影响精度得因素较多,故应仔细操作,尽量使供试品与对照品得测定条件一致。
若该品种不用对照品,如维生素A测定,则应在测定前对仪器作仔细得校正与检定。
4、4、2比色法
供试品本身在紫外-可见光区没有强吸收,或在紫外光区虽有吸收但为了避免干扰或提高灵敏度,加入适当得显色剂,使反应产物得最大吸收移至可见光区。
用比色法测定时,由于显色就是影响显色深浅得因素较多,应取供试品与对照品或标准品同时操作。
除另有规定外,比色法所用得空白系指用同体积得溶剂代替对照品或供试品溶液,然后依次加入等量得相应试剂,并用同样方法处理。
当吸光度与浓度关系不呈良好线性时,应取数份梯度量对照品溶液,用溶剂补充至同一体积,显色后测定各份溶液得吸光度,然后以吸光度与相应得浓度绘制标准曲线,再根据供试品得吸光度在标准曲线上查得其相应得浓度,并求出其含量。
4、5注意事项
4、5、1试验中所用得量瓶与移液管均应经检定校正、洗净后使用。
4、5、2使用得石英吸收池必须洁净。
当吸收池中装入同一溶剂,在规定波长测定各吸收池得透光率,如透光率相差在0、3%以下者可配对使用,否则必须加以校正。
4、5、3取吸收池时,手指拿毛玻璃面得两侧。
装样品溶液得体积以池体积得4/5为度,使用挥发性溶液时应加盖,透光面要用擦镜纸由上而下擦拭干净,检视应无残留溶剂,为防止溶剂挥发后溶质残留在池子得透光面,可先用醮有空白溶剂得擦镜纸擦拭,然后再用干擦镜纸拭净。
吸收池放人样品室时应注意每次放入方向相同。
使用后用溶剂及水冲洗干净,晾干,防尘保存,吸收池如污染不易洗净时可用硫酸发烟硝酸(3:
1v/v)混合液稍加浸泡后,洗净备用。
如用铬酸钾清洁液清洗时,吸收池不宜在清洁液中长时间浸泡,否则清洁液中得铬酸钾结晶会损坏吸收池得光学表面,并应充分用水冲洗,以防铬酸钾吸附于吸收池表面。
4、5、4含有杂原子得有机溶剂,通常均具有很强得末瑞吸收。
因此,当作溶剂使用时,它们得范围均不能小于截止使用波长。
例如甲醇、乙醇得截止使用波长为205nm。
另外,当溶剂不纯时,也可能增加干扰吸收。
因此,在检查所用得溶剂在供试品所用得波长附近就是否符合要求,即将溶剂置1cm石英吸收池中,以空气为空白(即空白光路中不置任何物质)测定吸光度,溶剂与吸收池得吸光度应符合下表规定。
以空气为空白测定溶剂在不同波长处得吸光度得规定
波长范围(nm)
220~240
241~250
251~300
300以上
吸光度
≤0、40
≤0、20
≤0、10
≤0、05
每次测定时应采用同一厂牌批号,混合均匀得同批溶剂。
4、5、5称量应按药典规定要求。
配制测定溶液时稀释转移次数应尽可能少,转移稀释时所取容积一般应不少于5ml。
含量测定时供试品应称取2份,如为对照品比较法,对照品一般也应称取2份。
吸收系数检查也应称取供试品2份,平行操作,每份结果对平均值得偏差应在±0、5%以内。
作鉴别或检查可取样品1份。
4、5、6供试品溶液得浓度,除各品种项下已有注明者外,供试品溶液得吸光度以在0、3~0、7之间为宜,吸光度读数在此范围误差较小,并应结合所用仪器吸光度线性范围,配制合适得读数浓度。
4、5、7选用仪器得狭缝谱带宽度应小于供试品吸收带半高宽得10%,否则测得得吸光度值会偏低,或以减小狭缝宽度时供试品溶液得吸光度不再增加为准,对于中国药典紫外分光光法测定得大部分品种,可以使用2nm缝宽,但当吸收带得半高宽小于20nm时,则应使用较窄得狭缝,例如青霉素钾及钠得吸光度检查需用1nm缝宽或更窄,否则其264nm得吸光度会偏低。
4、5、8测定时除另有规定者外,应在规定得吸收峰±2nm处,再测几点得吸光度,以核对供试品得吸收峰位置就是否正确,并以吸光度最大得波长作为测定波长,除另有规定外吸光度最大波长应在该品种项下规定得波长±2nm以内,否则应考虑试样得同一性、纯度以及仪器波长得准确度。
4、5、9用于制剂含量测定时,应注意供试液与对照液得pH值就是否一致,如pH值对吸收有影响,则应调溶液得pH值一致后再测定吸光度。
4、6结果计算
4、6、1对照品比较法可根据供试品溶液及对照品溶液得吸光度与对照品溶液得浓度以正比法算出供试品溶液得浓度,再计算含量。
C样品=A样品×C对照/A对照
式中A为吸光度值;C为测试液浓度(以mg/ml计)。
4、6、2吸收系数法规定得吸收系数,系指
,即在指定波长时,光路长度为1cm,试样浓度换算为1%(g/ml)时得吸光度值,故应先求被测样品得
值,再与规定得
值比较,可计算出供试样品得含量。
(样品)=
式中A为供试品溶液测得得吸光度值;
C为供试品溶液得百分浓度,即100ml中所含溶质得克数(g/ml);
L为吸收池得光路长度(cm)。
供试品得含量%=
×100
式中
(样品)为根据前式计算出得供试品吸收系数;
(标准)为药典或药品标准中规定得吸收系数。
4、7吸收系数测定法
本法主要用于新品种得吸收系数测定。
4、7、1测定方法取精制样品精密称取一定量,使样品溶液配成吸光度读数在0、6~0、8之间,置1cm吸收池中,在规定波长处按5、5、8项得规定测出吸光度读数,然后再用同批溶剂将溶液稀释1倍,使吸光度在0、3~0、4之间,再按上述方法测定。
样品应同时测定2份,同一台仪器测定得2份结果,对平均值得偏差应不超过±0、3%,否则应重新测定。
测定时,先按仪器正常灵敏度测试,然后再减小狭缝测定,直到减小狭缝吸光值不增加为止,取吸光度不改变得数据。
再用4台不同型号得仪器复测。
吸收系数可根据朗伯-比尔定律求算,以下例说明:
已知某化合物得分子量为287,用乙醇配成浓度为0、0030%得溶液,在波长297nm处,用1cm石英池,测得吸光度为0、6139,求
值及摩尔吸收系数ε值。
297nm=A/CL=
=205
ε297nm=A/CL=
=5874
4、8开机
开机前打开仪器样品室盖,观察确认样品室内无挡光物。
开机后,仪器显示初始化工作界面,仪器将进行自检并初始化整个过程需要约2min左右,如果初始化正常结束,系统进入仪器得操作界面,如下图所示:
系统初始化…………
1、内存检查:
正常
2、样品池电机复位:
正常
3、波长电机复位:
正常
4、狭缝电机复位:
正常
5、滤光片电机复位:
正常
6、光源电机复位:
正常
7、钨灯检查:
8、氘灯检查:
9、波长检查:
10、参数初始化:
系统忙……
仪器初始化完成后,您便可以开始对仪器进行操作。
仪器通常需要经过60min得预热时间使光源达到稳定,为保证测量数据得准确性,尽量不要在仪器预热时进行测量。
5、0光度测量
在此功能模块下,可测定样品在确定波长下得吸光度或透过率,完成K系数运算与测量数据打印等功能。
5、1进入光度测量模式
在仪器主界面下根据提示按1键选择光度测量方式,仪器进入光度测量模式,显示界面变为光度测量主界面,按RETURN键返回仪器主界面,如图所示:
退出光度测量时,系统在信息提示区显示“数据将丢失,继续?
(就是:
ENTER,否CLE)”得信息提示您对当前已测得得数据进行操作。
测试按ENTER键,系统将返回仪器主界面,所有已测得得数据将丢失。
按CANCLE键,系统退回到光度测量主界面,提示信息变为“请按START键测量”,您可以继续光度测量得操作。
下面根据图3-2给出了光度测量主界面得具体介绍:
①此处“光度测量”表示目前为光度测量模式;“990nm”为当前得工作波长;“0、000Abs”表示目前实时测得得吸光度值。
②此部分为工作区,以表格得形式显示具体测量得数据,每屏可显示最多9个测量数据值,超过则会自动分屏显示。
③此部分为信息提示区,当前得信息提示您按START/STOP键开始测量。
④此处显示当前时间,图中显示得时间为4月15日8时34分。
⑤此部分为功能键提示区,显示F1~F4键得功能。
具体按键功能如下:
★F1—进入参数设定界面;
★F2—删除测量数据,刷新屏幕;
★F3—设置样品池状态;
★F4—打印测量结果。
另外在此画面下,按键盘得操作键GOTOWL可进行工作波长得设置;按AUTOZERO键可完成当前波长下自动校零得功能。
5、2参数设置
在光度测量主界面下,按F1键进入光度测量参数设置界面,按RETURN键返回到光度测量主界面,如图所示:
在该界面下可设置测量得光度方式,测量波长与K系数运算得系数,根据界面下方得提示按相应得数字进行各项参数得设置。
所有参数设置完成后,按RETURN键返回到光度测量主界面。
5、3设置光度方式
在光度测量模式下,仪器提供Abs(吸光度)、T%透光率与R%(反射率)两种光度方式供您选择。
在光度测量参数设置界面按1键设置光度方式,每按一次1键,Abs、T%与R%交替变换,如图所示。
5、4设置测量波长
在光度测量参数设置界面按2键可进行测量波长设置,如图所示:
设置波长界面得底部,系统提示您输入您想要设置得测量波长,用数字键0~9与“、”输入您想要设置得测量波长,如果输入错误按CANCEL键可清楚当前得输入,输入完成按ENTER键确认后,系统提示“系统忙…”,此时系统正在设定您所设置得波长,完成设定后系统退出测量波长设定,返回到光度测量参数设置界面。
您也可以在下图所示得光度测量主界面下,按GOTOWL键设置光度测量得工作波长。
在光度测量界面得底部,系统提示您输入您想要设置得测量波长,用数字键0~9与“、”输入您想要设置得测量波长,如果输入错误按CANCEL键可清楚当前得输入,输入完成按ENTER键确认后,系统提示“系统忙…”,此时系统正在设定您设置得波长,完成设定后系统退出测量波长设置界面,返回到光度测量主界面;不输入数据按RETURN键可直接退出测量波长设定界面,返回到光度测量主界面。
5、5输入K系数值
在光度测量参数设置界面按3键可进行光度测量K系数得设置,如图所示:
设置K系数界面得底部,系统提示您输入您您想要设置得K系数,用数字键0~9、“、”与“—”输入K系数,如果输入错误按CANCEL键可清除当前得输入,输入完后按ENTER键确认,系统设定完成输入得K系数后退出K系数设置界面,返回到光度测量参数设置界面。
5、6暗电流校正
进行暗电流校正可以消除仪器部分噪声,保证样品得测量结果更为准确。
一般在仪器环境发生变化时,您必须进行仪器得暗电流校正,所谓得环境变化主要就是指:
环境温度变化较大时、安装位置改变、做高吸收度样品时等。
(建议您在启动仪器预热后,在进行测量前进行暗电流校正,保证数据结果得准确性)。
暗电流校正得具体操作如下:
在光度测量参数设置界面按4键进行暗电流校正,此时在提示区显示“系统忙…”
,大约10s后提示信息变为“请按数字键选择”,此时表示暗电流校正完成,如上图所示
5、7试样池设置
在试样池设置界面下,您可以选择您所配置得试样池(包括:
固定池、五联池与八联池)。
如果所配置得试样池为八联池或者五联池,,您还可以设置使用得试样池数,并进行移动试样池,试样池复位等操作。
在下图所示得光度测量主界面下,按F3键进入试样池设置界面,如果所示
在试样池设置界面下,根据提示按相应得数字键进行您所需要得设置,完成设置后,按RETURN键返回到光度测量主界面。
5、8选择试样池类型
在试样池设置界面下按1键进行试样池类型得设置。
系统提供得试样池类型有固定池架、五联池架与八联池架三个选项,每按一次1键,系统在固定池、五联池与八联池之间交替转换,如图所示。
请根据自己实际所配置得试样池类型,选择适合您得试样池类型。
5、9设定使用试样池数
此项参数仅对五联池或八联池有效。
在试样控制界面下,按2键进行使用样品池数设置,如图所示:
在试样池设置界面得底部,系统提示您输入您想要设置得使用试样池数,用数字键0~9输入使用试样池数,如果输入错误按CANCEL键可以清楚当前得输入,输入完后按ENTER键确认,系统设定完成输入得使用池数后返回到试样池参数设置界面;不输入数据按RETURN键可直接返回到试样池参数设置界面。
在测量过程中,系统根据该项设置对指定书目得试样池逐一进行测量,序号以n-1,n-2,…标识,n标识第n次测量,后面得数字表示样品池序号。
如果使用杨池数为1个,或者将多样池修改样池数为1,则重新回到主界面进行测量后,已测得数据按照1-1,2-1,3-1,4-1…、顺序编号。
6、0一号池空白校正
此项参数用来设定就是否要进行一号池空白校正(仅对五联池与八联池有效),此项设置有“否”与“就是”两个选项,每按一次3键,选项在“否”与“就是”之间交替切换,如图所示。
空白校正得意义就是把位于1号试样池内得试样作为空白,对其她试样池(除一号样品池外得其她设定得样品池)进行测定。
在测量开始时,系统将以1号样品池内得试样作为空白进行校零。
6、1移动试样池
此项参数仅对五联池与八联池有效。
在试样池设置界面下,按数字键4将移动试样池架到下一试样池。
此选项后面得数值标示当前在光路上得试样池编号,每按一次4键,试样池架将向下移动一个单位,此选项后面得数值也相应得加1,直到样品池编号得最大值后,样品池复位到1号样品池,以此循环。
样品池得最大编号五联池为5,八联池为8、
6、2试样池复位
此项参数仅对五联池与八联池有效。
不管当前光路上就是几号样品池,在试样池设置界面下按数字键5将试样池架复位,使得1号样品池回到光路上。
6、3单池测样
在试样池类型选择为八联池或者五联池时,当使用试样池数设置为1,1号池空白校正选项为“否”时,可用<移动试样池>功能选择八个试样池(或五个试样池)中得任一个作为测量样池,随后得测量仅对选中得样池操作。
6、4自动校零(校100%)
在光度测量设置界面下,ZERO键可对当前工作波长进行零吸光度(透过率100%)校正。
在校正前,应先放入空白样品(如:
溶解待测样品得溶剂等),然后进行校正操作。
当使用单样品池进行测量时,单样品池测量包括使用单样品池架与多样品池得单池测样,(关于多样品池得单池测样请参考<单池测样>)。
测量时首先参考<参数设置>与<试样池设置>设置好各种测量参数与试样池参数(主要就是选择样品池类型与多样品得单池设置),然后参考<自动校零>进行校零操作;校零后将装好样品得比色皿放入样品池内,按START/STOP键,重复测量一次样品,测量得结果将显示在界面上,如图所示。
测量结果得表格中“No、”表示测量数据得编号,图中表示第2次测量得第1号样品池得结果(如果就是多样品得单池测量,编号“1”表示得就是当前使用得样品池);“Abs”表示测得样品得吸光度值;“K*Abs”表示吸光度值经过K系数运算后得值,图中测量时得K系数得值为10、
6、5当使用多样品池进行测量时
只有配置多样品池架(如:
八联池、五联池等)后才能进行多样品池测量,您可以根据实际需要选择您需要使用得样品池个数。
使用多样品池测量可以大大得提高您得工作效率。
使用多样品池测量时得测量结果如图所示,表格中“No、”表示测量数据得编号,图中“2-3”表示第2次测量得第3号样品池得结果;“Abs”表示测得样品得吸光度值;“K*Abs”表示吸光度值经过K系数运算后得值,图中测量时得K系数得值为10、图中表示得就是使用3个样品池进行2次测量得结果。
测量结果查阅,如果测量结果超过了显示器显示得范围(一屏最多显示9个),您可以用方向键↑↓逐行查阅测量结果。
测量结果得删除
测量结果结束后,您可以按F2键清楚测量数据,此时系统提示“数据将丢失,继续?
(就是:
ENTER,否CLS)”根据提示按ENTER键确认,系统将清除所有测量数据;按CANCEL取消删除操作,系统提示变回“请按START键测量”,您可以继续其她操作,如果所示
请您在删除测量结果前进行数据得打印输出,以避免数据丢失造成损失。
7、0光谱测量
在此功能模块下,可对样品在一段确定波长内得吸光度Abs、透过率T%与样品光束(或者灯)能量Es与参比光束能量Er进行测量及打印。
7、1进入光谱扫描测量模式
在仪器主界面下根据提示按2键选择光谱测量方式,仪器进入光谱测量模式,显示界面变为光谱测量主界面,按RETURN键返回仪器主界面,如图所示:
退出光谱测量时,系统在信息提示区显示“数据将丢失,继续?
(就是:
ENTER,否:
CLE)”得信息,提示您对当前已测得得数据进行操作。
此时按ENTER键,系统将返回仪器主界面,所有已测得得数据将丢失。
按CANCEL键,系统退回到光谱测量主界面,提示信息变为“请按START键测量”,您可以继续光谱测量得操作
下图给出了光谱测量主界面得具体介绍:
①此处“光谱测量”表示目前为光谱测量模式;“990nm”为当前得工作波长;“0、000Abs”表示目前实时测得得吸光度值。
②此部分为工作区,以平面坐标图得形式显示测得得谱线。
图中得横坐标为波长值,纵坐标为吸光度值Abs(根据光度方式得不同,纵坐标还可以为透过率T%与能量值Es、Er)。
③此部分为信息提示区,当前得信息提示区您按START/STOP键开始测量
④此处显示当前时间,图中显示得时间为4月15日8时34分
⑤此部分为功能键提示区,显示F1~F4键得功能。
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