黄酒降脂功效的研究.docx
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黄酒降脂功效的研究
摘要…………………………………………………………………………………………2
1前言………………………………………………………………………………………3
1.1黄酒简介……………………………………………………………………………3
1.2黄酒的营养成分及功能……………………………………………………………3
1.3国内外研究状况……………………………………………………………………4
2实验材料…………………………………………………………………………………6
2.1实验动物……………………………………………………………………………6
2.2实验试样……………………………………………………………………………6
2.3试剂…………………………………………………………………………………6
2.4主要试剂配制………………………………………………………………………6
2.5主要仪器……………………………………………………………………………6
3方法………………………………………………………………………………………7
3.1黄酒的制备…………………………………………………………………………7
3.1.1黄酒浓缩物的制备……………………………………………………………7
3.1.2黄酒组分分离流程……………………………………………………………7
3.2动物实验方法………………………………………………………………………8
3.2.1动物分组………………………………………………………………………8
3.2.2大白兔饲养方法………………………………………………………………9
3.2.3实验方法………………………………………………………………………9
4结果……………………………………………………………………………………12
4.1黄酒对大白兔体重的影响…………………………………………………………12
4.2黄酒对大白兔血液中胆固醇(TC)含量的影响……………………………………12
4.3黄酒对大白兔血液中甘油三酯(TG)含量的影响…………………………………13
5分析与讨论……………………………………………………………………………14
谢辞………………………………………………………………………………………16
参考文献…………………………………………………………………………………17
黄酒降脂功效的研究
学生:
王念
指导教师:
刘志国
(武汉工业学院生物与制药工程系武汉430023)
摘要:
研究黄酒和黄酒的浓缩物对新西兰兔降低血清胆固醇和甘油三脂的含量,预防动脉粥样硬化等功能的作用。
以新西兰兔为实验对象,将8只新西兰兔随机分为4组:
基础组,高脂组,黄酒预防组,黄酒浓缩物组,分别灌喂黄酒和黄酒二倍的浓缩物,喂食高脂饲料构造高脂模型。
实验步骤:
每隔2周称体重并记录,喂养一个月后抽血,采用化学比色法检验血液中胆固醇的含量,用甘油三酯试剂盒的甘油氧化酶法检测甘油三酯含量。
得出结论:
黄酒有降低新西兰兔血液总胆固醇和甘油三酯的功能。
关键词:
黄酒降低血脂胆固醇甘油三酯动脉粥样硬化抗氧化
RiceWineeffectofloweringbloodlipid
NianWang,ZhiguoLiu
(DepartmentofBiologicalandPharmaceuticalEngineering,wuhanpolytechnicuniversity,
wuhan430023)
Abstract:
Onthericewineandricewineconcentratesonrabbitslowerserumcholesterolandtriglycerideinthepreventionofatherosclerosisandotherfunction.NewZealandrabbitfortheexperiment,eightrabbitswererandomlydividedintofourgroups:
Groupbased,highfatgroup,preventiongroupricewine,ricewineconcentratesgroups,feedingirrigationofricewineandricewinetwiceconcentrates,feedinghighfatdietEffectofstructuralmodel.Experimentalsteps:
ChenTizhongeverytwoweeksandrecord,onemonthafterbloodfeeding,achemicalmethodoftestingbloodcholesterollevels,andtriglyceridekitglycerolenzymaticoxidationtesttriglyceridelevelsAndthenexecuted,forobservationoftheliver,usingopticalmicroscopycrosssectionoftheaorticwalllipidplaque.Concluded:
yellowricewinehasreducedthefunctionofbloodlipidrabbits,rabbitsricewineontheatherosclerosispreventionrole.
Keywords:
ricewineLowerbloodlipidcholesteroltriglycerideAtherosclerosisAntioxidant
1前言
1.1黄酒简介
黄酒(Chinesericewine)是以稻米、黍米、玉米、小麦等谷物为原料,经蒸煮、加曲、糖化、发酵、压榨、过滤、煎酒、储存、勾兑而成的酿造酒。
黄酒是我国的民族特产,也称为米酒,属于酿造酒,在世界三大酿造酒(黄酒、葡萄酒和啤酒)中占有重要的一席。
酿酒技术独树一帜,成为东方酿造界的典型代表和楷模。
其中以浙江绍兴黄酒为代表的麦曲稻米酒是黄酒历史最悠久、最有代表性的产品;山东即墨老酒是北方粟米黄酒的典型代表;福建龙岩沉缸酒、福建老酒是红曲稻米黄酒的典型代表[1]。
在最新的国家标准中,按黄酒的含糖量将黄酒分为以下4类[2]:
干黄酒:
“干”表示酒中的含糖量少,糖份都发酵变成了酒精,故酒中的糖份含量最低,最新的国家标准中,其含糖量小于1.00g/100mL(以葡萄糖计),含酒精16~19%,总酸0.45g/100mL以下。
这种酒属稀醪发酵,总加水量为原料米的三倍左右。
发酵温度控制得较低,开耙搅拌的时间间隔较短。
酵母生长较为旺盛,故发酵彻底,残糖很低。
半干黄酒:
“半干”表示酒中的糖份还未全部发酵成酒精,还保留了一些糖份。
酒的含糖量在1.00~3.00%之间,含酒精17.5~19.5%,总酸0.45g/100mL以下。
在发酵过程中,要求较高。
酒质厚浓,风味优良。
可以长久贮藏。
半甜黄酒:
这种酒含糖份3.00~10.00%之间,含酒精13.5~16.5%,总酸0.5~0.55g/100mL。
这种酒采用的工艺独特,是用成品黄酒代水,加入到发酵醪中,使糖化发酵的开始之际,发酵醪中的酒精浓度就达到较高的水平,在一定程度上抑制了酵母菌的生长速度,由于酵母菌数量较少,对发酵醪中的产生的糖份不能转化成酒精,故成品酒中的糖份较高。
甜黄酒:
这种酒,一般是采用淋饭操作法,拌入酒药,搭窝先酿成甜酒娘,当糖化至一定程度时,加入40~50%浓度的米白酒或糟烧酒,以抑制微生物的糖化发酵作用,酒中的糖份含量达到10.00~20.00g/100mL之间,含酒精17.5~19.5g/100mL,总酸0.4g/100mL以下由于加入了米白酒,酒度也较高。
1.2黄酒的营养成分及功能
黄酒有丰富的内涵,其中不仅含有大量的蛋白质、碳水化合物及维生素,还含有多种有机酸、酯类物质及矿物质,完全具备了“含多种氨基酸,发热量高,易被人体消化吸收”这3项认定营养食品的必要条件,被形象地誉为“液体蛋糕”。
黄酒经长时间的糖化发酵,原料中的淀粉和蛋白质被酶分解为低分子糖类、肽和氨基酸等浸出物,最易被人体吸收,故黄酒被列为营养食品[3]。
黄酒中含有的多肽、维生素、酚类物质和功能性多聚糖具有抗氧化,清除自由基,降低血脂功效,预防动脉粥样硬化,抗衰老以及提高记忆力等功能。
黄酒有很高的营养价值,最新研究发现,黄酒含丰富的蛋白质,每升绍兴酒的蛋白质为16g,是啤酒的4倍。
黄酒中的蛋白质经微生物酶的降解,绝大部分以肽和氨基酸的形式存在,极易为人体吸收利用。
黄酒含21种氨基酸,其中8种是人体不能合成或合成的速度远不适应机体需要,必须由食物供给的。
每1L绍兴酒中的必需氨基酸达3400mg,半必需氨基酸达2960mg。
黄酒中还含有较高的功能性低聚糖,仅已检测出的异麦芽低聚糖,每1L绍兴酒就高达6g。
异麦芽低聚糖又称为分支低聚糖,具有显著的双歧杆菌增殖功能,能改善肠道的微生态环境,促进B族维生素的合成和钙、镁、铁等矿物质的吸收,提高免疫力和抗病力,预防各种慢性病及癌症。
每天只需摄入几克功能性低聚糖,就能起到显著的双歧杆菌增殖效果[4]。
绍兴黄酒含活性很强的降血压生物活性物质和降胆固醇生物活性物质,特别是已检测出的无机盐有18种之多,包括钙、镁、钾、磷等常量元素和铁、铜、硒等微量元素。
镁既是人体内糖、脂肪、蛋白质代谢和细胞呼吸酶系统不可缺少的辅助因子,也是维持肌肉神经兴奋性和心脏正常功能,保护心血管系统所必需的。
黄酒含镁200至300mg/L。
锌具有多种生理功能,是人体100多种酶的组成成分,对多种代谢及免疫调节过程起着重要的作用,锌能保护心肌细胞,促进溃疡修复,并与多种慢性病的发生和康复相关。
绍兴元红酒含锌8.5mg/L,健康成人每日约需12.5mg/L锌,喝300mL黄酒相当于20%以上的需要量。
硒是谷胱甘肽过氧化酶的组成成分,能消除体内产生的过多活性氧自由基,因而具有提高机体免疫力、抗衰老、保护心血管和心肌健康的作用。
每1L绍兴元红酒及加饭酒含10至12µg硒。
研究发现,黄酒中含有的多肽、维生素、酚类物质、类黑精、谷胱甘肽等生理活性成分和功能性多聚糖具有抗氧化,清除自由基,降低血脂功效,预防动脉粥样硬化,抗衰老以及提高记忆力等功能[5]。
1.3国内外研究状况
目前对黄酒的研究尚停留在蛋白质、氨基酸、维生素、矿物质微量元素等常规营养物质的层次上,且缺乏较为系统全面地检测与研究。
对黄酒生物活性肽、多酚类物质的检测与研究至今尚未开展。
日本对清酒及清酒槽中具有抑制脯氨酰肽链内切酶活性的肽进行了研究,脯氨酰肽链内切酶能分解抗利尿激素,该激素有保持记忆的作用。
在各种酿造酒中,对功能性成分研究最多最为深入的是葡萄酒。
对葡萄酒保健功能的研究是从Richard在1981年提出“法国悖论”之后[6]。
经过对葡萄酒成分的研究和分析,发现葡萄酒中含有大量的酚类物质。
现在已经分离鉴定的酚类物质主要有白黎芦醇、儿茶酚、表儿茶酚、檞皮酮、芸香苷、杨梅酮和没食子酸等。
这些酚类物质具有抗氧化功能,抑制低密度脂蛋白(LDL)的氧化,预防心血管病,抗癌,抗炎症和血小板凝聚的功能。
对葡萄酒中酚类物质的研究除了生物活性外,还有代谢途径和作用机制等多方面的深入研究,特别是对特殊酚类物质白藜芦醇进行了大量研究,提出了白藜芦醇的含量、功能作用、分子结构、前驱体、形成机制和作用机制[7]。
在过去的几十年中,随着对葡萄酒中酚类物质研究的深入,“法国悖论”及大量病理学研究报告的葡萄酒保健功能得到了科学的解释,从而使喝葡萄酒有益健康的宣传令人信服,据有关统计,美国70%的民众认为喝葡萄酒以及其中的酚类物质的保健功能的研究仍在深入进行[8]。
黄酒保留了发酵过程中产生的营养和活性物质,其保健养生功能历来倍受行家推崇,但是对黄酒保健的科学研究甚少。
为此,开展了“黄酒的保健功能研究”项目的研究工作,取得了初步的成果。
通过动物实验等科学手段证实,黄酒具有降低血脂、增强记忆能力、预防动脉粥样硬化、延缓衰老、抗氧化能力、调节肠道菌群等多种保健功能[13]。
黄酒中的碳水化合物、蛋白质、矿物质、微量元素和维生素等相互协调和相互补充作用构成了黄酒较高的营养价值及保健作用,这些成分对人体有着重要的生理功能。
目前对黄酒的研究尚停留在蛋白质、氨基酸等常规营养物质上,由于蛋白质、氨基酸也存在其它酒中,只是量的差别而已,无法从机理上阐明黄酒的保健养生功能,使宣传缺乏深度,与当今科技发展极不相称。
在大力研究葡萄酒和宣传其保健养生功能的今天,黄酒的保健养生功能被忽视[9]。
因此,若能通过应用先进仪器设备和实验方法,对黄酒功能性成分进行深入研究与检测,提出几个特异的功能性成分,必将大大促进黄酒的发展。
2实验材料
2.1实验动物
雄性新西兰大白兔8只(东西湖养殖场提供),5~6月龄,体重1.5~2.0kg。
2.2实验试样
黄酒由中粮绍兴酒有限公司生产的花雕酒(黄中皇),酒精度>16.5%vol,总糖:
15.1~40.0(g/L),酒龄:
2~3年。
2.3试剂
胆固醇(分析纯)天津市凯通化学试剂有限公司
猪油自制,为新鲜炼制常用食用油
油红O染料北京试剂二厂
甘油三酯(TG)试剂盒长春汇力生物技术有限公司
三羟基甲基氨基甲烷(Tris)武汉市华顺生物技术有限公司
10%FeCl3溶液
磷硫铁试剂(P-S-Fe)
2.4主要试剂配制
(1)Tris-HCl(pH=8.6)缓冲液配制
将50mL、0.1mol/L的Tris溶液与12.4mL、0.1mol/L的盐酸混合后,加水稀释至100mL。
0.1mol/L的相对分子量为121.12。
0.1mol/L的溶液中含12.114g/L。
Tris溶液可以从空中吸收二氧化碳,使用时应注意将瓶盖严。
(2)Tris-HCl(pH=8.1)缓冲液配制
将50mL、0.1mol/L的Tris溶液与26.2mL、0.1mol/L的盐酸混合后,加水稀释至100mL。
0.1mol/l的相对分子量为121.12。
0.1mol/L的溶液中含12.114g/L。
Tris溶液可以从空中吸收二氧化碳,使用时应注意将瓶盖严。
(3)10%的三氯化铁溶液
将10gFeCl3·6H2O溶于磷酸中,定容至100mL,储于棕色瓶中冷藏。
(4)磷硫铁试剂(P-S-Fe)
取10%的三氯化铁溶液1.5mL于100mL棕色瓶内,加浓硫酸定容至刻度。
(5)胆固醇标准储液
准确称取胆固醇80mg,溶于无水乙醇中,定容至100mL。
(6)胆固醇标准溶液
将储液用无水乙醇准确稀释10倍。
此标准液每毫升含0.08mg胆固醇。
2.5主要仪器
5ml注射器武汉恒康医疗器械有限公司
电子天平上海民桥精密仪器有限公司SL302N型
离心机(TDL-5型)CENTRIFUGE
紫外可见分光光度计(VW8500型)天美科技
石英比色皿
PHS-3C数字酸度计杭州东量仪器设备厂
D101大孔吸附树脂上海树脂厂
二乙氨基乙基纤维素(DEAE)交换树脂上海恒信化学试剂公司
层析柱:
直径1.6×40cm1.6×60cm上海厦美生化科技有限公司
R-201旋转蒸发仪上海申科机械研究所
水循环真空泵
3方法
3.1黄酒的制备
3.1.1黄酒浓缩物的制备
取200mL黄酒装入圆底烧瓶中,装好收集烧瓶,打开冷凝水,打开水循环真空泵(0.08Mpa),水浴温度为65℃至70℃,时间1h~2h,旋转蒸发至冷凝管上没有液体滴下为止,得到黄酒浓缩物,测收集的液体和黄酒浓缩物的体积,并用酒精计测出收集瓶的酒精度。
3.1.2黄酒组分分离流程
黄酒经过减压蒸馏后除去90%的酒精,得到黄酒浓缩物。
用1.6×40cm的玻璃层析柱装上用乙醇浸泡24h后的D101大孔吸附树脂,分别用95%的乙醇和纯水洗柱,洗至无乙醇味。
将去除酒精的黄酒浓缩物样品上柱40mL,待样品流出离柱床5cm时小心加入蒸馏水100mL洗涤,滤出液每3mL收集一管,依次编号,用分光光度计(280nm)检测后分组合并,主要为去脂溶性物质。
然后用250mL70%的乙醇洗脱,洗脱液每3mL收集一管,依次编号,用分光光度计(530nm)检测后分组合并,主要为脂类物质,包括多酚,萜类脂溶性物质[11]。
把DEAE-纤维素树脂先用0.5mol/LNaOH浸泡1h,再用0.5mol/LHCl浸泡1h,然后用Tris-HCl(pH=8.6)缓冲液平衡1h,将处理后的DEAE-纤维素树脂用1.6×60cm的玻璃层析柱装柱,并用Tris-HCl缓冲液平衡柱床15~20min。
加入用Tris-HCl缓冲液平衡1h的上述滤出液30mL样品,待样品流出离柱床5cm时小心加入Tris-HCl(pH=8.6)缓冲液100mL洗涤,滤出液每3mL收集一管,依次编号,用分光光度计(280nm)检测后分组合并,主要为多糖类物质。
然后用200mLTris-HCl(pH=8.1)缓冲液洗脱,洗脱液每3mL收集一管,依次编号,用分光光度计(280nm)检测后分组合并,主要为多肽类物质[12]。
分离步骤见图1。
图1黄酒分离流程图
3.2动物实验方法
动物采用如下所示流程:
3.2.1动物分组
实验动物为雄性健康新西兰大白兔8只,5~6月龄,体重1.5~2.0kg。
随机分为四组[14]。
其分组(表1)如下:
(1)正常对照组2只(基础组),喂养基础颗粒饲料100g/只/d。
分别于饲养第2周、第4周、第6周、第8周时检测并处死观察。
(2)高脂模型组2只(高脂组),喂养高脂饲料(96%基础颗粒饲料+3%猪油+1%胆固醇)100g/只/d。
分别于饲养第2周、第4周、第6周、第8周时检测并处死观察。
(3)黄酒预防组2只(预防组),高脂饲料100g/只/d+黄酒20mL/只/d每日待兔饮完黄酒后再自由饮水,分别于饲养第2周、第4周、第6周、第8周时检测并处死观察。
(4)黄酒浓缩物组2只(浓缩组),高脂饲料100g/只/d+黄酒浓缩物16mL/只/d每日待兔饮完黄酒后再自由饮水,分别于饲养第2周、第4周、第6周、第8周时检测并处死观察。
表1动物饲料配比
组分
高脂饲料(g/只/d)
黄酒(mL/只/d)
黄酒浓缩物(mL/只/d)
基础饲料
猪油
胆固醇
基础组(A)
100
—
—
—
—
高脂组(B)
96
3
1
—
—
预防组(C)
96
3
1
20
—
浓缩组(D)
96
3
1
—
16
3.2.2大白兔饲养方法
3.2.2.1饲料配比
标准棒状基础饲料购自东西湖养殖厂.主要是由麦皮、玉米、黄豆粉、稻谷、多种维生素、添加剂混合而成。
4种饲料配制方法如下:
基础组(A):
基础饲料100g/只/d+水;
高脂组(B):
高脂饲料100g/只/d(96%基础饲料+3%猪油+1%胆固醇)+水;
预防组(C):
高脂饲料100g/只/d(96%基础饲料+3%猪油+1%胆固醇)+黄酒20ml/只/d
浓缩组(D):
高脂饲料100g/只/d(96%基础饲料+3%猪油+1%胆固醇)+黄酒浓缩物16ml/只/d
3.2.2.2喂养方法
各组兔子分笼饲养,饲养温度为28℃,湿度为70%~80%,自然光照,自由取食、饮水。
每天对兔笼进行清扫,消毒。
每天记录每只兔子的进食量、饮用液体量及体重,每只兔子1日平均取食量为100±10g。
在进行实验前对其做记号,称体重,并记录。
饲养每隔2周,耳缘静脉取血测定各项血脂指标,取血前空腹12小时。
上午9:
00喂养对应饲料30g/只,预防组灌喂黄酒20ml/只,浓缩组灌喂黄酒浓缩物16ml/只,灌喂后再自由饮水。
下午3:
00喂养对应饲料40g/只,自由饮水。
晚上8:
00喂养对应饲料30g/只,自由饮水。
3.2.3实验方法
3.2.3.1体重的测定
对每只新西兰兔做记号,在实验前,第2周,第4周,第6周,第8周时称体重,并记录。
在称体重的前一天晚上8:
00喂食和水量需严格定量,在早晨8:
00称体重,并在同一时间称得,称体重前不能喂食。
3.2.3.2胆固醇(TC)的测定
检测每只大白兔的血液胆固醇(TC)含量。
在进行实验前检测一次,喂养到第4周、第5周、第6周、第7周、第8周时抽血检测胆固醇的含量并记录。
取血前12小时新西兰兔不能进食,用酒精将手术用剪刀消毒,准备200μl的移液枪和足够的枪头;无水小EP管;碘酒;干抹布和干纱布。
在兔子的耳缘静脉取血3mL,放入EP管中,静置一夜析出血清备用。
胆固醇的测定采用化学比色法[10]。
血清经无水乙醇处理后,蛋白质被沉淀,胆固醇则溶于其中。
在乙醇提取液中加磷硫铁试剂,胆固醇与试剂产生紫红色化合物,颜色的深浅与胆固醇总量成正比,可用分光光度法测定。
用5mL注射器抽兔血3mL于离心管中,室温下自然凝固3h,析出血清。
为使血清尽快析出可以采用离心的方法缩短分离时间。
吸取0.2mL血清置于干燥的离心管中,先加无水乙醇0.8mL,摇匀后再加无水乙醇4.0mL摇匀,10min后离心(3000r/min,5min),取上清液备用。
取三支干燥试管,编号,分别加入无水乙醇2.0mL(空白管)、胆固醇标准溶液2.0mL(标准管)、上述乙醇提取液2.0mL(样品管),样品中的TC含量较高,用无水乙醇稀释10倍。
各管皆加入磷硫铁试剂2.0mL,摇匀,10min后,以空白管为对照用分光光度计测定。
血清胆固醇(mg/100mL)=(A2/A1)×(0.08×100/0.04)×10=(A2/A1)×2000
A1为标准液的吸光度;A2为样品液的吸光度。
3.2.3.3甘油三酯(TG)的测定
检测每只大白兔的血液甘油三酯(TG)含量。
在进行实验前检测一次,喂养到第4周、第5周、第6周、第7周、第8周时抽血检测胆固醇的含量并记录。
用甘油三酯试剂盒进行测定,采用甘油氧化酶法[10],按试剂盒说明书的操作步骤进行检测[16]。
原理:
甘油三酯+H2O→(LPO)甘油+脂肪酸
甘油三酯+ATP→(GK)3-磷酸甘油+ADP
3-磷酸甘油+O2→(GPO)H2O2+磷酸羟基丙酮
H2O2+4-APP+DHBS→(POD)红色醌型化合物
规格:
R156mL×1R214mL×1
成分:
R1Tris-HCl缓冲液pH7.0
对氯酚3.0mmol/L
MgCl2·6H2O10mmol/L
R2Tris-HCl缓冲液pH7.6
LPO3000U/L
GK1000U/L
GPO5000U/L
POD1000U/L
4-AAP1.4mmol/L
ATP0.5mmol/L
标准液2.26mmol/L
检验方法:
1.试剂配制:
单一试剂R1和R2按4:
1体积混合后使用。
2.测定条件:
分析方法
波长(nm)
温度(℃
)
延迟时间(s)
测量时间(s)
试剂空白
标准值(mmol/L)
吸入量(μL)
终点法
492
37/-
2
2
要
2.26
800
3.测定步骤:
用酶标仪进行测定,波长为492nm。
试剂空白管
标准管
样
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