超高效液相色谱泊联质谱测定动物肌肉组织中32种β激动剂β阻滞剂和糖肽类抗生素药物残留.docx
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超高效液相色谱泊联质谱测定动物肌肉组织中32种β激动剂β阻滞剂和糖肽类抗生素药物残留
超高效液相色谱泊联质谱测定动物肌肉组织中32种β激动剂、β阻滞剂和糖肽类抗生素药物残留
摘要建立了同时测定动物肌肉组织中27种β激动剂、3种β阻滞剂和2种糖肽类抗生素的超高效液相色谱串联质谱(UPLCMS/MS)方法。
样品经酶解、蛋白沉淀后,以乙酸乙酯异丙醇(6∶4,V/V)提取,StarataXC固相萃取净化,BEHC18色谱柱分离,乙腈0.1%甲酸梯度洗脱,串联质谱ESI+电离,多反应监测模式检测,外标法定量。
结果表明,32种目标物在线性范围内相关性良好(R2>0.995),多巴胺、瑞普特罗、万古霉素和去甲万古霉素的方法检出限为5μg/kg,其它目标物的检出限为3μg/kg;平均加标回收率为83.6%~103%,相对标准偏差(n=6)为3.9%~10.4%,日间精密度为4.5%~9.8%。
结果表明,本方法准确、灵敏,适用于动物肌肉组织中β激动剂、β阻滞剂,以及糖肽类抗生素的高通量测定。
关键词β激动剂;β阻滞剂;糖肽类抗生素;动物肌肉;超高效液相色谱串联质谱法
1引言
β激动剂俗称“瘦肉精”,主要作为促生长剂被添加到动物饲料中,长期食用含此类药物残留的畜禽产品可能会引起肌肉振颤、心悸、紧张等症状[1,2],多个国家和地区已禁止将β激动剂用于畜禽生产[3~5]。
β阻滞剂是一类能拮抗神经递质和儿茶酚胺对β受体激动作用的药物,常在动物运输或屠宰前数小时内使用,以降低动物因应激而造成的突然死亡率及对动物肉质的影响,残留风险较大,欧盟和国际食品安全法典委员会已对动物组织中β阻滞剂卡拉洛尔的残留做了限量规定[6,7](猪肌肉为5μg/kg,猪肝、肾为25μg/kg)。
万古霉素和去甲万古霉素属于糖肽类抗生素,用于治疗细菌感染,我国农业部第560号公告规定万古霉素为禁用兽药[8]。
虽然目前已有动物尿液、血液和肌肉组织中β激动剂[9~13]、β阻滞剂[14]和糖肽类抗生素[15]残留的检测方法研究,但检测对象多为单一的一类药物,没有同时检测这3类药物的研究。
因此,建立了同时检测动物肌肉中β激动剂、β阻滞剂和糖肽类抗生素的高通量方法,有利于提高检测效率,降低检测成本。
本研究以动物肌肉组织为基质,经酶解和蛋白沉淀后,以乙酸乙酯异丙醇混合溶剂提取,固相萃取技术净化,超高效液相色谱串联质谱检测,建立同时测定动物肌肉组织中27种β激动剂、3种β阻滞剂和2种糖肽类抗生素的高通量方法。
本方法具有较高的灵敏度和选择性,不易受基质干扰,能实现准确的定性和定量分析,可满足对肉类食品中β激动剂、β阻滞剂和糖肽类抗生素监管[3~8]的要求。
2实验部分
2.1仪器与试剂
ACQUITYTM超高效液相色谱和WatersXevoTMTQMS三重四极杆串联质谱仪(UPLCMS/MS,美国Waters公司);5418高速离心机(德国Eppendorf公司);T18均质器(德国IKA公司,);MS3basic漩涡混合器(德国IKA公司);NEVAP112水浴氮吹仪(美国OA公司);MilliQ去离子水发生器(美国Millipore公司);20pos固相萃取装置(美国Waters公司,);StrataXC固相萃取柱(200mg/3mL,美国Phenomenex公司)。
β激动剂(多巴胺、奥西那林、卡布特罗、齐帕特罗、特布他林、沙丁胺醇、西马特罗、丙卡特罗、瑞普特罗、非诺特罗、赛布特罗、克伦塞罗、莱克多巴胺、氯丙那林、克伦普罗、福莫特罗、妥布特罗、克伦特罗、溴代克伦特罗、班布特罗、溴布特罗、苯氧丙酚胺、马布特罗、马喷特罗、苯乙醇胺A、沙美特罗、喷布特罗),β阻滞剂(美托洛尔、卡拉洛尔、普萘洛尔),糖肽类抗生素(万古霉素、去甲万古霉素),纯度均大于98.0%(德国Dr.Ehrenstorfer公司)。
β葡糖醛酸苷肽酶(98000unit/mL,美国Sigma公司);甲醇、乙腈、乙酸乙酯、异丙醇、甲酸(色谱纯,ThermoFisher公司);HClO4,NaOH,NaCl(分析纯,广州化学试剂厂)。
准确称取10.0mg标准物质,用甲醇溶解并定容至10.0mL,配成单标标准储备液(1.0mg/mL),
Symbolm@@18℃恒温避光保存。
分别吸取适量的单标标准储备液,用甲醇逐级稀释成1.0mg/L的混合标准溶液,置于4℃恒温避光保存,临用时,用甲醇稀释成所需浓度的混合标准工作液。
2.2样品提取[16]
称取已均质的试样2.0g于50mL塑料离心管中,加入8mL乙酸乙酸钠缓冲液(pH=5.2)和50μLβ葡糖醛酸苷肽酶,涡旋混匀,37℃振荡酶解16h。
取出冷却至室温,8000r/min离心5min,转移上清液并加入5mL0.1mol/LHClO4,用HClO4调节至pH1.0±0.2,8000r/min离心5min后转移上清液,并用10mol/LNaOH溶液调节pH至9.5±0.5,加入2gNaCl和10mL乙酸乙酯异丙醇(6∶4,V/V),涡旋振荡10min,8000r/min离心5min,收集上清液,40℃水浴氮吹至近干,用5mL2%甲酸复溶残渣,待净化。
2.3样品净化
依次用3mL甲醇、水、2%甲酸溶液活化StrataXC固相萃取柱,待净化液过柱后,依次用3mL2%甲酸溶液、甲醇淋洗柱子,负压抽干,用6mL3%氨水甲醇溶液洗脱,收集洗脱液,40℃水浴氮吹至近干,0.1%甲酸甲醇溶液复溶残渣并定容至1mL,过0.22μm滤膜,供UPLCMS/MS测定。
2.4测定条件
BEHC18色谱柱(100mm×2.1mm,1.7μm);流动相:
A.0.1%甲酸(体积分数),B.乙腈,梯度洗脱程序:
0.0~1.0min,95%A;1.0~2.5min,95%~75%A;2.5~6.0min,75%~10A;6.0~7.0min,10%A;7.0~7.1min,10%~95%A;7.1~10min,95%A。
流速:
0.25mL/min;进样量:
2μL;柱温:
35℃。
32种待测物的保留时间见表1。
质谱条件:
ESI正模式分段扫描,毛细管电压1.0kV;离子源温度150℃;去溶剂气温度400℃;去溶剂气:
氮气,13.3L/min;锥孔气:
氮气,0.83L/min;碰撞气:
高纯氩气,0.15mL/min;检测模式:
多反应监测(MRM);其它质谱参数见表1,离子对驻留时间0.01s。
3结果与讨论
3.1质谱条件的优化
根据目标物的化学结构,选择ESI(+)的电离模式,对目标物进行一级质谱扫描,β激动剂和β阻滞剂可获得较高响应的母离子[M+H]+,糖肽类抗生素则产生双电荷离子[M+2H]2+。
对确定的母离子进行二级质谱扫描,通过优化碰撞电压,使选定的特征碎片离子强度达到最大,经优化的质谱条件见表1。
根据目标物的保留时间设定分段扫描,以增加采集点数。
分析目标物的二级离子碎片可见,β激动剂和β阻滞剂产生包括与羟基、叔丁基、异丙基、异丙氨基基团相关的中性丢失碎片,产生[M+H-18]+、[M+H-56]+、[M+H-74]+等碎片离子;β阻滞剂结构中均含有-CH2-CH(OH)-CH2-NH-CH-(CH3)2,因此都有m/z=116离子峰。
3.2液相条件的优化
β激动剂和β阻滞剂为碱性化合物,万古霉素和去甲万古霉素为两性化合物,实验比较了BEHC18(100mm×2.1mm,1.7μm)、BEHHILIC(100mm×2.1mm,1.7μm)和PhenomenexPFP(50mm×3mm,2.6μm)色谱柱的分离效果。
HILIC柱对含有酚羟基的苯酚型β激动剂分离效果较好,但其它目标物的峰型较差,部分目标物出现严重的拖尾现象,且万古霉素和去甲万古霉素的响应较低;PFP柱虽能满足目标物的分离,但沙丁胺醇、苯氧丙酚胺和莱克多巴胺出现色谱峰分裂现象;BEHC18柱以桥式亚乙基杂化硅胶为基质,可避免硅醇残基与目标物的叔胺基发生氢键相互作用而导致色谱峰拖尾、保留时间不为定量离子对(Quantitativeionpair)。
[BG)W][HT5][HJ]
稳定等现象。
因此,本实验采用BEHC18色谱柱,各目标物的峰型和响应都较理想。
流动相的有机相选择乙腈,各目标物的响应和分离效果比甲醇更理想。
水相中加入适当浓度的甲酸(0.1%,V/V),可提高离子化效率。
通过优化梯度洗脱程序使各目标物的峰型和响应值满足检测要求。
3.3提取条件的优化
3.3.1水解方式的选择动物组织中β激动剂以游离和轭合物两种形式存在,其中苯胺型β激动剂极性中等,轭合反应率较低,可直接用溶剂提取;而苯酚型β激动剂由于含有胺基和酚羟基,极性高,主要以轭合物形式存在,难以被有机溶剂提取,样品需先水解,使待测物游离。
本实验比较了葡萄糖醛酸酶和5%三氯乙酸的水解效果,结果表明,酶解和酸解对β激动剂和β阻滞剂的加标回收率没有明显影响;但对于糖肽类抗生素,酶解的加标回收率更好(酶解为75%~86%,酸解为23%~34%),因此本实验选择酶解。
3.3.2提取溶剂的选择体系用HClO4沉淀蛋白后,β激动剂以盐形式存在,提取前需调节体系至碱性,使目标物游离[17]。
实验比较了pH7~13时,加标20μg/kg的阴性猪肉基质的提取效率(见图1)。
结果表明,对于苯胺型β激动剂(图1A),当pH=8~12时,提取效率均大于75%;对于苯酚型β激动剂(图1B),尤其是特布他林等二酚型药物,只有在pH9~10间提取效率才能高于80%;对于其它目标物(图1C),当pH<10时,提取效率受溶液pH值影响较小。
因此,为获得满意的提取效率,提取前先调节体系至pH9.5±0.5。
实验比较了10mL乙酸乙酯(EtAC)、乙酸乙酯异丙醇(EtACIPA,6∶4,V/V)和乙酸乙酯叔丁基
3.4净化条件的选择
比较了固相萃取柱OasisHLB(Waters,150mg/3mL)、StrataXC(Phenomenex,200mg/3mL)和AROMATICSULFONICACID(J.TBaker,200mg/3mL)对加标20μg/kg的阴性猪肉样品的净化回收率(见图3)。
结果表明,糖肽类抗生素在HLB柱的回收率最好,β激动剂和β阻滞剂经StrataXC净化后的总体回收率最理想。
StrataXC是混合型阳离子交换反相柱,在酸性条件下,具有苯乙醇胺母核结构的β激动剂和β阻滞剂能与H+结合形成阳离子,被StrataXC柱的填料吸附,从而具有较高的选择性,回收率都较好。
因此,综合考虑,本实验采用StrataXC柱进行净化。
3.5线性关系,方法检出限、回收率与精密度
本实验采用Matusewaki等建立的基质效应确认方法[18]显示存在基质增强效应,因此采用基质匹配校准曲线进行定量分析。
用阴性猪肉样品基质提取液配制系列基质匹配标准工作液,其中多巴胺、瑞普特罗、万古霉素和去甲万古霉素的浓度为10,20,50,100,200和500μg/L,其它目标物的浓度为5,10,20,50,100和200μg/L,按优化的仪器条件进行检测,以质量浓度为横坐标(x),目标物定量离子对峰面积为纵坐标(y)作标准曲线,得到各目标物的线性方程和相关系数(R2),并计算方法检出限(LOD,S/N=3)。
32种目标物的线性回归方程和相关系数见表2。
结果表明,各目标物线性相关系数大于0.995。
多巴胺、瑞普特罗、万古霉素和去甲万古霉素的线性范围为10~500μg/L,方法检出限为5μg/kg,其它目标物的线性范围为5~200μg/L,方法检出限为3μg/kg,能满足限量检测[6,7]要求。
取阴性猪肉样品进行2个水平的加标回收实验,6次平行实验的结果见表2。
各目标物的平均回收率为83.6%~103%;相对标准偏差(RSD,n=6)为3.9%~10.4%,日间精密度为4.5%~9.8%。
3.6实际样品的分析
采用本方法测定了当地市场销售的猪、牛、羊、鸡肌肉各5例,均未检出上述32种目标化合物。
4结论
本实验建立了超高效液相色谱串联质谱(UPLCMS/MS)同时测定动物肌肉中27种β激动剂、3种β阻滞剂和2种糖肽类抗生素残留的方法,样品经酶解、蛋白沉淀后,以乙酸乙酯异丙醇(6∶4,V/V)混合溶液提取,StrataXC固相萃取净化,通过优化色谱、质谱条件,获得较高的灵敏度和准确度,本方法回收率和精密度良好,适用于动物肌肉中β激动剂、β阻滞剂、糖肽类抗生素的同时测定。
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KeywordsβAgonist;βBlock
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