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禽流感病毒研究
《春季传染病防治》研究报告
——禽流感病毒
陈静
化工与制药专业化药1103班学号110150094
指导老师刘雪凌讲师
摘要
禽流感病毒属于正黏病毒科,RNA病毒。
自从1997年发现可以感染人类致死以来,引起世界极大的关注。
禽流感病毒的基因组由8条独立的单股负链组成,分别编码不同的蛋白质,具有高度的重组性。
其中NA和HA变异性最强,也是划分病毒不同亚型的依据。
很多研究表明,H5N1型高致病性禽流感病毒基因与1918年的流感病毒有很大的相似性,也暗示了流感病毒进化的一个途径:
禽流感——猪流感——人流感。
现阶段预防和治疗的主要方法是抗病毒药物和疫苗,其中,疫苗比较有效而且几乎没有副作用。
本文概述了禽流感的概念及生物学分类,感染的临床症状、防治措施,及其历史发展与近年来的现状。
还从高致病性禽流感病毒的基因组研究,H5N1型禽流感病毒可能的起源及其与人的关系,以及针对高致病性禽流感的疫苗研究方面进行了阐述。
关键词:
禽流感感染进化人流感
前言...................................................1
第1章课题研究价值.......................................
第1.1节选题背景.....................................
第1.2节研究目的与研究方法..........................
第2章禽流感病毒........................................
第2.1节禽流感病毒的基本概念........................
第2.2节禽流感病毒特征.............................
第3章培养基的制备.......................................
第3.1节禽流感病毒的采集分离纯培养...................
第3.2节禽流感病毒分离...............................
第4章禽流感病毒的显微镜下形态............................
第5章禽流感病毒的生长繁殖方式...........................
第6章禽流感病毒的鉴别方式................................
第7章禽流感病毒是怎么传染到人的
第7.1节禽流感诊断技术.................................
第7.2节禽流感病毒是如何传染到人的.....................
第8章禽流感药物研发...................................
第8.1节药物研发理由...................................
第8.2节新药研发初现曙光...............................
第9章基因工程制药
第9.1节现代生物技术基因工程...........................
第9.2节我国基因工程制药产业现状分析...................
第10章微生物对中药发酵的作用..........................第10章微生物对中药发酵的作用..........................
第10.1节微生物类群为中药发酵提供了充足的选择余地......
第10.2节发酵制药的意义...............................
结论
前言
禽流感是禽流行性感冒(AvianInfluenza,AI)的简称,这是一种由甲型流感病毒的一种亚型引起的传染性疾病综合征,被国际兽疫局定为A类传染病,又称真性鸡瘟或欧洲鸡瘟。
禽流感是A型流感病毒引起的,对于鸟类的一种感染性疾病[1]。
由于它可能对所有的鸟类都有感染作用,有些鸟类即使携带了这种病毒也不会产生特定的表状。
现阶段科学界讨论最多的是高致病性禽流感,高致病性的病毒最初是1878年在意大利发现,具有突然发作,传染迅速的特点,感染的鸟类一般在48小时内死亡率达到近100%,被称为埃博拉病毒。
禽流感病毒基因组由8个负链的单链RNA片段组成。
这8个片段编码10个病毒蛋白,其中8个是病毒粒子的组成成分(HA、NA、NP、M1、M2、PB1、PB2和PA),另两个是分子质量最小的RNA片段,编码两个非结构蛋白——NS1和NS2。
NS1与胞浆包含体有关,但对NS1和NS2的功能目前尚不清楚。
现在已经获得了包括H3、H5和H7在内的几个禽流感病毒亚型HA基因的全部序列以及所有14个血凝素基因的部分序列。
禽流感病毒一般为球形,直径为80~120纳米,但也常有同样直径的丝状形态,长短不一。
病毒表面有10~12纳米的密集钉状物或纤突覆盖,病毒囊膜内有螺旋形核衣壳。
两种不同形状的表面钉状物是HA(棒状三聚体)和NA(蘑菇形四聚体)。
禽流感病毒粒子大约由0.8%~1.1%的RNA,70%~75%的蛋白质,20%~24%的脂质和5%~8%的碳水化合物组成。
脂质位于病毒的膜内,大部分为磷脂,还有少量的胆固醇和糖脂。
几种碳水化合物包括核糖(在RNA中)、半乳糖、甘露糖、墨角藻糖和氨基葡糖,在病毒粒子中主要以糖蛋白或糖脂的形式存在。
病毒蛋白及潜在的糖基化位点是病毒基因组特异的,但病毒膜的糖蛋白或糖类链的脂质和碳水化合物链的成分,是由宿主细胞确定的。
感染人的禽流感病毒亚型主要为H5N1、H9N2、H7N7,其中感染H5N1的患者病情重,病死率高。
研究表明,原本为低致病性禽流感病毒株(H5N2、H7N7、H9N2),可经6~9个月禽间流行的迅速变异而成为高致病性毒株(H5N1)。
第一章课题研究价值
第1.1节选题背景
近年来,禽流感(AvianInfluenza)先后在亚洲等一些国家局部爆发,逐渐由东南亚向欧洲扩散,日趋严重,引起了世界各国的高度重视。
世界卫生组织(WHO)2005年10月24日公布最新人类感染H5N1禽流感病例,自2003年底以来,共有121件病例,62未死亡。
到现在为止,约有1.5亿只禽鸟因病死亡,造成的直接经济损失高达30亿关元。
当前,禽流感的发生和流行,不但造成了巨大的经济损失,而且危及到人类身体健康,禽流感的防控已经成为全球瞩目的焦点之一。
本文通过对禽流感病毒的病原治病的分子基础、流行病学、临床特征及防治措施等方面的研究现状进行综述,旨在了解感染禽流感的研究进展,为人感染禽流感的有效防控提供科学依据。
第1.2节研究目的与研究方法
1.2.1研究目的
禽流感(AvianInfluenza,AI),是由禽流感病毒(AvianInfluenzaVirus,AIV)引起的禽类的一种烈性传染病.由于AI具有临床症状复杂,病死率高,病原体亚型多以及容易发生抗原漂移和转换等特点,使其防治难度加大,相应地造成了严重的经济损失,影响畜禽业的发展。
1997年在香港发生的AIV感染人的事件,突出了其公共卫生意义。
本文就AI的病原学,流行病学,发病机制,临床表现与诊断,防治等方面进行综述,目的是在丰富专业数据库的同时,增加公众对AI的大体了解,便于普及AI的预防知识和应急处理。
1.2.2研究方法
1.2.2.1宿主中流感病毒受体的研究
通过对多种动物中H5N1毒株的分离及对多种动物血清中抗H5N1的研究,已发现除禽以外,多种哺乳类动物也可感染,其中包括虎、豹、猪、犬等。
日本学者Kida认为被AIV感染者中在其咽喉部的细胞具有一种多糖受体〔a一2,3相连的唾液酸(SA)受体糖链〕。
这一种受体与多数人的主要受体a一2,3相连的SA不同,a一2,6糖链与AIV结合,导致病毒人侵并复制,而a一2,6受体仅与人流感病毒结合。
目前正在越南寻找经感染后的存活者进行受体研究,希望发现不同比例a一2,3与a一2,6,以证实这一推断是合理的。
Ibricevic等对小鼠及人肺细胞受体进行了模拟试验。
通过将呼吸道上皮细胞进行培养,并实施鼠体内感染,他们发现在人、鼠中,a一2,3连接的SA受体在肺上皮细胞及纤毛呼吸道细胞中均存在。
但是a一2,6相连的受体在鼠中并不表达,因此有些流感病毒株不会感染鼠。
在人呼吸道上皮细胞,a—2,6相连的SA不仅表达而且在纤毛细胞及杯状细胞中都具有功能,可以与相应的病毒相结合。
因此,鼠动物模型可用于研究仅与a一2,3SA结合的毒株,而分化的人呼吸道上细胞培养可用于评估一些毒株是否容易感染人的一种工具。
1.2.2.2诊断AIV技术
为建立可靠又准确的诊断的方法,Das等建立了一个内参阳性对照设计是应用AIV的基质基因为靶,可用于实时聚合酶链反应或反转录一聚合酶链反应。
应用后一方法在血、肾、肺、脾、肝中发现有对这一技术的抑制物。
应用冻干珠子则可提高检测的敏感性。
应用这一方法对禽类AIV分离的阳性符合率可达97%—100%,对泄殖腔病毒分离阳性符合率可达81%。
Di等则报道了在禽中除用RRT_PCR外,用1个阴探针进一步排除假阳性结果,可用于现场标本的检测。
图1.1禽流感病毒
第二章禽流感病毒
第2.1节禽流感的基本概念
2.1.1禽流感病毒概念
甲型流感病毒呈多形性,其中球形直径80~120nm,有囊膜。
基因组为分节段单股负链RNA。
依据其外膜血凝素(H)/和神经氨酸酶(N)蛋白抗原性的不同,可分为16个H亚型(H1~H16)和9个N亚型(N1~N9)。
感染人的禽流感病毒亚型主要为H5N1、H9N2、H7N7,其中感染H5N1的患者病情重,病死率高。
研究表明,原本为低致病性禽流感病毒株(H5N2、H7N7、H9N2),可经6~9个月禽间流行的迅速变异而成为高致病性毒株(H5N1)。
不仅是鸡,其它一些家禽和野鸟都能感染禽流感。
按病原体的类型,禽流感可分为高致病性、低致病性和非致病性三大类。
非致病性禽流感不会引起明显症状,仅使染病的禽鸟体内产生病毒抗体。
低致病性禽流感可使禽类出现轻度呼吸道症状,食量减少、产蛋量下降,出现零星死亡。
高致病性禽流感最为严重,发病率和死亡率高,感染的鸡群常常“全军覆没”。
2.1.2禽流感病毒分类
禽流感病毒为A型禽流感病毒,属于正粘病毒科,外观形态为直径80-120nm的球状或长达数千纳米的丝状。
流感病毒依据其核蛋白(NP)抗原性的差异分为A、B、C三型,而依其外膜血凝素(hemagglutinin,HA)抗原和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)的不同,目前可分为15个H亚型(H1-H15)和9个N亚型(N1-N9),不同型别和亚型分别在基因组结构、多肽构成、感染性和致病性等方面存在差别。
禽流感病毒种类是根据HA和NA的不同来划分的,现已发现病毒有16种HA和9种NA[1],因此,理论上应该有144种病毒。
但HA和NA都具有很高的变异性,随着病毒的不断进化,新的种类有可能还会产生。
到目前为止,所有禽流感的爆发都是由H5和H7亚型引起的。
正常情况下禽流感病毒是具有种属特异性的[1,2],但近年来,感染人类的报道越来越多,极大地引起人们的恐慌。
在众多种的禽流感病毒中,只有四种亚型可以感染人类:
H5N1,H7N3,H7N7和H9N2。
这其中,除了H5N1型具有较高的致病性,能导致大规模流行以外,其它三种对人群危害不大,只能产生微弱的效应。
本文着重介绍了高致病性禽流感病毒的分子进化机制及其与人流感的关系,病毒疫苗和药物的研究进展等。
第2.2节禽流感的特征
2.2.1禽流感的生物学特征
禽流感病毒属于正黏病毒科,RNA病毒[3,4]。
形态近似球形,直径80~120nm,病毒的外面有包膜,包膜内部为螺旋对称的核衣壳。
其基因组由八条独立的单链负股RNA组成:
PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS。
其中,PB2、PB1、PA分别编码病毒的RNA聚合酶的亚基,三者共同组成RNA聚合酶;HA编码血凝素蛋白,参与受体的识别,是基因组中变异率最大的一个片段;NP编码病毒的核衣壳蛋白,与基因组RNA、病毒RNA聚合酶一起构成核酸核蛋白体RNP;NA编码神经氨酸酶,包膜糖蛋白,可裂解唾液酸和附近的糖间的糖苷键,协助子代的释放,还有协助HA切割的功能;M编码基质蛋白,一种多功能因子,可以作为病毒的结构蛋白和调节蛋白;NS编码NS1、NS2两个非结构蛋白,具有控制有关基因表达的功能[5,6]。
高致病性病毒存在于被感染的鸟类的整个身体中及周围环境中,呼吸道和肠胃中含量最大,并可以垂直遗传。
一般说来,在4℃时病毒可以在禽类粪便中存活至少35天,37℃时仅能存活6天。
在有机物中,如动物的粪便,肌肉等受到保护,可以存活更久。
禽流感病毒低温下适应能力比较强,而对高温敏感,正常的烧煮70℃左右即可灭活[7]。
同时,和其他有囊膜的病毒一样,其对乙醚、丙酮等有机溶剂抵抗力较弱,可迅速失活;在直射阳光下,经40-48小时即失去活性[8]。
2.2.2感染机制
病毒进入体内后,由HA识别特异的受体(一般是唾液酸),进行结合吸附。
然后经过内吞作用进入细胞浆,形成吞噬小泡。
吞噬小泡与溶酶体的融合可能使细胞内pH值下降,HA的构象发生改变,经过宿主细胞蛋白水解酶的作用,裂解成HA1和HA2两部分。
HA2的氨基端插入小泡脂膜,促使病毒囊膜与吞噬泡膜融合,这样病毒RNA释放到胞浆,开始下一代复制过程[9]。
2.2.3分子进化机制
从最早的200多年前的爆发,到今天,高致病性禽流感病毒发生了极大的进化变异,并开始跨越种属界限,感染哺乳动物。
其主要的分子进化途径有两条:
2.2.4禽流感与人流感
很多专家指出,禽流感很可能是1918年西班牙流感的变种。
或者,更确切地说,人类和鸟类的H1N1型病毒源自同一个祖先种。
JefferyK.Taubenberger等在对1918年在哺乳动物分离病毒的HA,NA,NP基因分析表明[15]:
很可能早在1918年以前,就已经有一个祖先种感染过了哺乳动物。
而且1918的西班牙流感病毒本身就是一个重组体[16],它的HA蛋白的球形头部由部分猪流感病毒的基因编码,而柄由人类流感病毒的部分基因编码。
第3章培养基的制备
近年来,国家对家禽禽流感强制免疫和养殖业相关人员对禽流感防控的高度重视,我国禽流感疫情总体上呈逐年下降的趋势。
但目前,无论是高致病性禽流感还是低致病性禽流感,仍然是严重威胁养禽业的大敌。
自2004年以来,中国内地相继暴发高致病性禽流感,不仅沉重打击了国内的养禽业,而且对我国的经济和贸易发展也造成了严重的影响。
自1933年利用鸡胚培养流感病毒获得成功以来,鸡胚就成为人们大量获得流感病毒的主要来源。
但是用鸡胚分离流感病毒或传代易引起病毒变异,而且鸡胚残留物还可能引起过敏性反应。
鸡胚作为疫苗生产基质,还存在大规模生产时供给困难和潜在的外源病毒污染问题。
近年来,随着禽流感的频繁暴发以及跨种属传播,人们认识到需要研究一种可在流感大规模流行时能够替代鸡胚快速、大量生产流感病毒的细胞培养系统。
应用MDCK细胞系培养流感病毒不仅解决了鸡胚蛋白遗留物和外源病毒污染的问题,而且培养的病毒免疫原性更为稳定。
利用低血清培养基或者无血清培养基培养流感病毒的研究可以进一步解决病毒抗原制备后的血清处理问题,国外已有很多学者对此进行了探讨。
笔者探讨3株H9亚型禽流感病毒在3种培养基中的增值效果,旨在确定H9亚型禽流感病毒的培养条件。
病毒不具备细胞结构,不能独立生存要借助寄主细胞才能完成繁殖等生命活动。
所以培养甲流病毒不能用普通培育基(普通培养基一般指含有细胞或生物生存所需全部营养物质的培养基,不包含活细胞)一般用鸡蛋,活鸡胚等。
第3.1节禽流感病毒的采集分离纯培养
3.1.1标本的采集与处理
3.1.1.1标本的采集
病毒分离成功与否很大程度上取决于采集标本的质量,及其保存、运输等环节。
多数标本取自患者上呼吸道鼻咽腔,其次为气管和支气管分泌物,有时也采用肺活检材料等。
标本采集后应立即放入适当的采样液中低温保存,常用的采样液为:
普通肉汤,pH7.4-7.6的Hank's、Eagle's或水解乳蛋白液。
为防止细菌和真菌生长,在采样液中需加入抗菌素,以往抗菌素多用青、链霉素,近来发现不少种类细菌对它们具有耐药性,故近来多用庆大霉素(其终浓度为每ml采样液中加入0.1ml的10mg/ml)和抗真菌药物(终浓度为每毫升采样液中加入0.008ml的250ug/ml)。
主要的采集方法有以下几种:
1)鼻拭子:
将棉签轻轻插入鼻道内鼻腭处,停留片刻后缓慢转动退出。
以同一拭子拭两侧鼻孔。
将棉签浸入4-5ml采样液中,尾部弃去。
2)咽拭子:
用棉签擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁,同样将棉签头浸入4-5ml采样液中,尾部弃去。
注:
亦可将鼻、咽拭子收集于同一采样管中,以便提高分离率,减少工作量。
3)鼻咽抽取物:
用与负压泵相连的收集器(国外有售)从鼻咽部抽取粘液。
先将收集器头部插入鼻腔,接通负压,旋转收集器头部并缓慢退出。
收集抽取的粘液,并用采样液涮洗收集器3次。
由于该收集器国内难买到,也可采用国内一种设计装置(见郭元吉、程小雯著,流行性感冒病毒及其实验技术。
中国三峡出版社P186,1997)。
4)鼻洗液:
患者取坐姿,头微后仰,用移液管将1-1.5ml洗液注入一侧鼻孔,嘱患者同时发K音以关闭咽腔。
然后让患者低头使洗液流出,用平皿或烧杯收集洗液。
重复此过程数次。
洗两侧鼻孔最多可用10-15ml洗液。
5)漱口液:
用10ml洗液漱口。
漱时让患者头部微后仰,发“噢声”,让洗液在咽部转动。
然后,用平皿或烧杯收集洗液。
注:
取鼻洗液和漱口液时,需预先了解患者是否对抗菌素有过敏史,如有则洗液和含漱液中不应含有抗菌素。
3.1.1.2血清标本采集
血清标本应包括急性期和恢复期双份血清。
急性期血样应尽早采集,最迟不超过发病后7天。
恢复期血样应在发病后2-4周采集。
单份血清一般不能用作诊断。
血液标本2000-2500rpm离心15min。
收集血清,弃血凝块。
血清可在4℃存放一周,长期保存置-20℃。
3.1.2标本运送
标本应在低温下,24小时内运送至实验室。
标本至实验室后,病毒分离标本应尽快进行接种分离,48h内能进行接种的可置于4℃保存,如未能接种应置-70℃或以下保存。
血清标本可在4℃存放一周,长期保存置-20℃或以下。
3.1.3标本处理
标本至实验室后,含棉拭子的标本,先将棉拭子在管壁反复挤压后取出。
鼻腔或咽部洗液,用手将装标本的管充分振荡,将粘液打碎。
置4℃待其自然沉淀5-10min,取上清5ml。
上清液可直接接种或低温保存。
鼻咽漱液或抽取液:
用无菌毛细吸管,在无菌条件下反复吹打收集的溶液,以便打碎粘液,同样置4℃待其自然沉淀5-10min,取上清5ml。
上清液可直接接种或低温保存。
注:
如采样液中尚未加抗菌素,应在接种前补加,用量同前,混匀后置4℃1-2h后方可接种。
第3.2节禽流感病毒分离
病毒分离是流感诊断最常用和最可靠的方法之一。
多用鸡胚来分离流感病毒。
近来随着分子生物学技术的发展,发现通过鸡胚所分离到的流感病毒,其抗原性与原始标本的有所不同,而通过MDCK细胞分离出的,其抗原性与原始标本的相似。
另外由于“O”相毒株的重现,MDCK等一些细胞对“O”相毒株的敏感性大大超出鸡胚的敏感性。
因此,MDCK等一些细胞已成为流感病毒分离不可缺少的一种宿主系统。
MDCK分离的病毒在很多国家尚未批准用于疫苗生产,因此在病毒分离时同时采用鸡胚和MDCK细胞两套系统。
流感病毒“O”相毒株不凝集鸡红细胞,故近来在流感病毒鉴定中常用豚鼠或人红细胞来代替。
然而,该两种细胞无细胞核,沉积慢,一般在红细胞凝集及凝集抑制测定中需60分钟才能观察结果,同时在“U”型孔板中,很难沉积成像眼泪样的点即当中常有小空洞。
3.2.1MDCK细胞分离
3.2.1.1实验材料
MDCK细胞、Eagle氏培养液、Hank's溶液、0.25%胰酶和Versene消化液、双抗(青、链霉素)或庆大霉素和抗真菌素、胎牛或小牛血清、5.6%或7.5%的NaHCO3。
细胞培养液配制
每500mlEagle's液加:
终浓度双抗5100U/ml青霉100ug/ml链霉素胎牛或小牛清0.1-0.15ml/ml使用前用NaHCO3将pH调至7.4-7.6。
细胞维持液配制同培养液,但不含胎牛或小牛血清,而含终浓度为2-3ug/ml胰酶,用前用NaHCO3将pH调至7.6-7.7。
注:
目前市场上出售已配好的Eagle's试剂有两种:
一种已含有谷氨酰胺,另一种不含。
如不含,配工作液时需补加。
3.2.1.2病毒接种和收获
1)在低倍光学显微镜下检查MDCK细胞生长状态。
2)成片的细胞弃生长液,用Hank's液洗两遍,将残余的牛血清洗净,因牛血清中含有流感病毒非特异性抑制素,会影响流感病毒的复制。
3)每瓶加入接种标本0.5-1.0ml,轻摇细胞瓶,使标本完全覆盖细胞,置35℃吸附1-2h。
4)倒掉感染液,再用Hank's液洗1-2遍,每瓶加入3ml维持液,置35℃培养。
5)次日起每天检查有无细胞病变(CPE)。
CPE特征为:
细胞肿胀圆化,细胞间隙增大,细胞核固缩或碎裂,严重时细胞部分或全部脱落。
6)收获及红细胞凝集活性(HA)检查
当CPE出现+++~++++号时进行收获,收获之前也可将细胞冻融1-2次来提高收获标本的病毒滴度。
由于无法证实CPE就是流感病毒所造成。
最后还得看维持液中是否有红细胞凝集活性(HA)。
用毛细吸管取维持液3-4滴,放入血凝板孔中,而后加入等容量的1%豚鼠或人红细胞,轻摇混之,置室温或4℃,1h后观察结果。
出现红细胞凝集的为阳性标本,收获所有维持液进行病毒鉴定,也可暂冰存之。
有时将收获的维持液,离心弃沉渣,上清中加适量无菌甘油或明胶或1%牛血清白蛋白冻存之。
由于维持液中无牛血清,同时含一定量的胰酶和NaHCO3,故不应在4℃保存,否则易造成HA活性丢失和pH变高。
如有清晰的CPE,但HA阴性应进行盲传。
注:
维持液中加适量胰酶的目的是为了提高流感病毒在细胞中的复制能力。
绝大多数流感病毒只有血凝素(H)是裂解型的才具有感染性。
细胞培养不像鸡胚,它的维持液中不含有蛋白水解酶,无法将病毒粒非裂解型的HA0变成裂解型的HA1+HA2。
故必须在维持液中加入适量的胰酶。
CPE出现时间随感染病毒的型别,甚至毒株的差异以及感染量的大小而异。
一般标本接种后7天还不出CPE,维持液中又查不出HA活性,可认为阴性标本,弃之。
7)传代及盲传
如收获的维持液HA滴度不高或量不够用于鉴定,需在MDCK细胞或鸡胚中传代,把HA滴度提高或量增多。
如HA可疑,细胞CPE清晰,此时应在MDCK细胞上盲传一代,如仍测不出HA,可认为是阴性。
如仍有清晰的CPE并能排除细菌所引起也可认为是非流感病毒。
3.2.1.3MDCK细胞传代
(1)把需用的溶液置室温或37℃水浴中预热。
(2)已成片的MDCK细胞,将其生长液倒掉。
(3)把Versene与0.25%胰酶按7:
1比例配成消化液,每小瓶加入消化液3ml(加入量应根据瓶大小不同而异)。
(4)置37℃恒温箱5-10min,在此期间应在光学显微镜下观察1-2次,当细胞变圆,细胞与细胞间互不相联,表明消化时间已到。
如细胞仍连成片,表明消化时间未到。
但千万不可消化时间过长,造成大量细胞
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