药分复习重点.docx
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药分复习重点
1.质谱分析法:
将化合物形成离子和碎片离子,按其质荷比(M/Z值)的不同进行分离测定,来进行成分和结构分析的一种分析方法。
2.蛋白质质谱:
是通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子,然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值(M/Z值)的蛋白质离子分离开来,经过离子检测器收集分离的离子,确定离子的M/Z值,分析鉴定已知或未知蛋白质。
3.质谱仪至少由以下四部分组成:
进样系统—按电离方式的需要,将样品送入离子源的适当部位;离子源——用来使样品分子电离生成离子,并使生成的离子会聚成有一定能量和几何形状的离子束;质量分析器——利用电磁场(包括磁场、磁场和电场的组合、高频电场和高频脉冲电场等)的作用将来自离子源的离子束中不同质荷比的离子按空间位置,时间先后或运动轨道稳定与否等形式进行分离;检测器——用来接受、检测和记录被分离后的离子信号。
4.离子源的功能:
是将进样系统引入的气态样品分子转化成离子。
由于离子化所需要的能量随分子不同差异很大,因此,对于不同的分子应选择不同的离解方法。
硬电离方法:
能给样品较大能量的电离方法,
软电离方法:
给样品较小能量的电离方法,该方法适用于不稳定或易电离的样品。
5.电喷雾离子化技术(ESI):
利用强静电场从溶液直接产生气态离子化分子的电离方式。
ESI可以与液相色谱、高效液相色谱、毛细管IEF以及毛细管电泳等多种进样器联用。
ESI-MS特点:
优点:
解决了极性大、热不稳定的蛋白质与多肽分子的离子化和大分子质量、一级结构和共价修饰位点的测定问题,并可用于研究DNA与药物、金属离子、蛋白质和抗原与抗体的相互作用。
缺点:
样品中的盐类对样品结果影响很大,而且单个分子带电荷不同可形成多种离子分子峰(重叠峰),所以对混合物的图谱解析比较困难。
6.基质辅助激光解析电离(MALDI):
待检样品与含有在特定波长下吸光的发光团的化学基质混合,此样品混合物随即滴于一平板或载玻片上进行挥发,样品混合物残余水份和溶剂的挥发使样品整合于格状晶体中,样品然后置于激光离子发生器(。
激光作用于样品混合物,使化学基质吸收光子而被激活。
此激活产生的能量作用于多肽,使之由固态样品混合物变气态。
MALDI-MS特点:
1对于一些分子量较大(>1000000Da)或疏水性强的蛋白质,MALDI比ESI更有效。
2.MALDI能有效地分析较复杂的肽混合物或物理化学性质相差较大的蛋白质混合物。
只要能与所选择的底物形成稳定的分散体系的样品都能用MALDI进行分析。
3.MALDI不受样品所含的添加物、缓冲液或盐的影响,且灵敏度也比别的离子化方式高。
7.核磁共振光谱学:
具有非零自旋量子数的原子核具有自旋角动量,因而也就具有磁矩,如象1H,31P,13C,15N等原子核.磁矩是一矢量.如果含有此类核的物质置放于磁场中,原来无规则的磁矩矢量会重新排列而平行于外加的磁场.与外磁场同向和反向的磁矢量符Boltzmann分布.在数量上同向与反向的差别很小,但正是这一微小的差别造就了核磁共振光谱学.
8.x-射线衍射技术和NMR技术在研究蛋白质空间结构中的优缺点?
x-射线衍射技术:
固体状态,可以测定中-大蛋白质结构,技术更成熟;需结晶,经常存在相位问题。
NMR技术:
溶液状态,接近生理状态,不需结晶,可研究蛋白质动力学过程,可以较方便地研究蛋白质-配体相互作用;只能测定小-中蛋白质结构,技术还在发展。
12.纸色谱的影响因素:
1滤纸的影响2展开剂的影响3物质极性的影响4pH的影响
5温度和时间的影响
13.薄层色谱选择吸附剂的原则:
(1)样品组分的性质
(2)吸附剂的性质①根据薄层色谱的分离机制,选择适宜活性的吸附剂。
②吸附剂对样品的作用:
③薄层的显色方法不同,所用的吸附剂也不同。
④吸附剂的规格
14.薄层色谱对展开剂的要求:
(1)能够溶解待测组分;
(2)能使待测组分与杂质分开;(3)使待测组分的Rf值在0.2-0.8之间;(4)不能与待测组分或吸附剂发生化学反应;(5)具有适中的沸点和比较小的粘度;(6)展开后组分的斑点圆且集中;(7)混合溶剂最好临用前新鲜配制。
15.薄层色谱法常见的问题和消除的方法:
(一)斑点拖尾现象
(二)边缘效应(三)S形及波浪形斑点(四)斑点呈念珠状(五)展速慢(六)Rf值不稳定
16.蒸发散射质量检测器的优缺点:
(1)与示差折光检测器相比:
灵敏度高;对流动相系统温度变化不敏感;可进行梯度洗脱
(2)与光吸收检测器相比:
能解决最困难的HPLC检测问题。
如磷脂、皂甙、糖类、聚合物、树脂等无紫外吸收或紫外吸收系数很小的化合物的检测;减低流动相溶剂的纯度要求;无需测定定量校正因子
17.高效液相色谱法:
液体样品由进样器注入后,被来自于高压泵的高压流动相带入装有固定相的色谱柱,在柱中样品组份得到分离,随后进入检测器,进行检测记录,数据处理。
22.分子筛优点:
(1)温和条件下进行,没有破坏性
(2)分离不依赖于流动相的组分
缺点:
洗脱下来的不同组分不存在于凝胶过滤分离中。
23.影响分子筛分辨率的因素:
(1)流动相与凝胶之间的分离的动力
(2)不规则条带的填料床不同载气路线长度的不同导致涡流扩散(3)柱纵向扩散导致了条带展宽
24.影响分子筛分辨率的参数:
流速;填充粒大小;温度;柱长;分子筛流动相的组分;样品的粘性;
26.色谱法的两个极限:
(1)低到中等选择性的长的有效柱用来分离多种组分峰和条带的复杂样品
(2)高选择性的短柱用来分离较少组份样品,是亲和色谱的基础。
27.操作亲和色谱的步骤:
(1)样品的应用;在这一步中,酶抑制剂被固定,或被柱吸收。
(2)洗脱步骤,这步中所有没有连接的组分都被洗脱
(3)洗提,这步必须需要一个反相酶抑制剂
(4)柱被加入开始的流动相组分来再生
28.亲和载体连接的步骤:
(1)连接头上的功能性基团可以是胺,硫醇,乙醇和羧酸
(2)当小溶质被固定化时往往需要间隔臂(3)必须控制固定化时的pH值(4)载体上活动基团的浓度需要考虑
29.洗脱方法:
在固定化氨基葡萄糖和外源凝集素的连接在加入葡萄糖后被反相,葡萄糖在结合位点与外源凝集素相互作用,所形成的复合物被洗脱。
另一方面,如果外源凝集素在纯化中被固定化,葡萄糖会竞争性取代糖蛋白,糖蛋白就会洗脱下来。
无特异性洗脱包括一些流动相的改变:
离液效应离子的加入比如硫氰酸盐和高氯酸盐。
亲和色谱分离五种人乳脱氢酶的同工酶,运用固定化AMP作为亲和配基,运用连续浓度的NADH进行生物特异性洗脱
30.检测器的类型:
紫外检测器:
荧光检测器:
蒸发光散射检测器;示差折光检测器:
质谱检测器:
电导检测器:
PH检测器:
31.氨基酸组成分析(柱前衍生化氨基酸分析)
⏹OPA(邻苯二甲醛):
荧光,主要氨基酸.
⏹FMOC(9-芴基甲基氯甲酸酯):
色氨酸,半胱氨酸反应低.
⏹异硫氰酸苯酯(PITC)
⏹NBD-Cl(4-氯-7-硝基-2,1,3-苯恶二唑):
可测脯氨酸和羟脯氨酸,对OPA方法的补充.灵敏度低.
⏹Dabsylchloride(4-(二甲氨基)偶氨苯-4-磺酰氯):
易引起柱损坏.
⏹AQC(6-氨基喹啉-N-羟基-琥珀酰亚氨基甲酸酯)
⏹2,4-二硝基氟苯(FDNB)
⏹2,4-二硝基氯苯(CDNB)等
32.纯度分析:
(1)定性鉴别:
肽图谱
(2)含量测定:
(3)氨基酸序列分析
1不连续PAGE分离样品效果好,分辨率高的原理?
答:
(1)样品的浓缩效应:
由凝胶系统的不连续性产生。
凝胶孔径不连续性②缓冲液离子成份的不连续性③PH的不连续性
(2)凝胶的分子筛效应:
蛋白质离子进入分离胶后,条件有很大变化。
由于其pH升高(电泳进行时常超过9.0),使Gly解离成负离子的效应增加;同时因凝胶的浓度升高,蛋白质的泳动受到影响,迁移率急剧下降。
此两项变化,使Gly的移动超过蛋白质,上述的高电压梯度不复存在,蛋白质便在一个较均一的pH和电压梯度环境中,按其分子的大小移动。
分离胶的孔径有一定的大小,对不同相对分子质量的蛋白质来说,通过时受到的阻滞程度不同,即使净电荷相等的颗粒,也会由于这种分子筛的效应,把不同大小的蛋白质相互分开。
(3)电荷效应:
带电多,MW小,迁移快
2.SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理?
答:
SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键,并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物,各种SDS-Pr均带相同密度的负电荷,其荷电超过了原Pr,消除了不同Pr荷电差异。
原态蛋白质与SDS结合后,变性蛋白质成一线性分子。
因此,各种蛋白质-SDS复合物在电泳时的迁移率,不再受原有电荷和分子形状的影响,而只和分子量有关。
4.免疫印迹技术指的是是将凝胶电泳与固相免疫测定结合,先把电泳分区的蛋白质转移到固相载体,再用酶免疫、放射免疫等技术测定。
该法能分离分子大小不同的蛋白质并确定其分子量。
常用于检测多种病毒如HIV的抗体或抗原。
6.聚丙烯酰胺凝胶制备时,聚合反应所使用的化学催化剂是_过硫酸胺(AP)_,光聚合催化剂是_核黄素_。
7.带电粒子在电场中的移动速度主要决定于 颗粒性质 、 电场强度 和 溶液性质 。
1.液相合成与固相合成优缺点
液相合成优点:
中间产物纯化、中间产物的理化常数、可以随意进行非氨基酸修饰、可以避免氨基酸缺失缺点是较为费时、费力等。
固相合成:
优点:
简化了每步反应的后处理操作,避免因手工操作和物料转移而产生的损失,产率较高且能够实现自动化等缺点:
是每步中间产物不可以纯化,必须采用较大的氨基酸过量投料,粗品纯度不如液相合成物,必需通过可靠的分离手段进行纯化等。
3.多肽药物不稳定的原因:
(1)水解、氧化、外消旋化、二硫键的断裂及重排、β消除、凝聚、沉淀、吸附等。
(2)稳定性研究应根据多肽药物稳定性的特点合理选择试验条件、考察项目。
4.多肽结构研究的主要目的:
是要说明其氨基酸组成,序列是否正确,多肽分子中如有半胱氨酸,应明确其状态(氧化态或还原态),对含有多个半胱氨酸的多肽,应明确二硫键的正确连接位点。
对于长肽,需要对其空间结构(例如二级、三级结构)进行研究。
5.短肽:
结构确证方法
元素分析、红外光谱、核磁共振谱、氨基酸组成分析、质谱等常见方法,氨基酸序列测定。
中、长肽:
氨基酸组成,氨基酸序列分析。
(Edman降解,质谱:
分子量及其序列信息,是对Edman降解的很好补充。
3.蛋白质的理化性质:
(1)两性解离性质及等电点
(2)蛋白质胶体性质(3)蛋白质的沉淀(4)蛋白质的变性与复性蛋白质的紫外吸收特性(5)蛋白质呈色反应
8.氨基酸组成分析的步骤:
(1)水解。
在一定温度、酸度等条件下,蛋白质或多肽的肽键断裂,水解成游离氨基酸
(2)衍生。
在游离氨基酸残基上,衍生一个声色基团
(3)色谱。
利用高效液相色谱对这些氨基酸进行定性定量色谱分析
4.氨基酸分析方法:
1、茚三酮反应2、荧光胺法3、邻苯二甲醛(OPA)法4、PTC-AA分析法5、(DNS-Cl)法6、磺酰氯二甲胺偶氮苯(Dabsyl-Cl)法
5.N-末端的测定:
1、二硝基氟苯法(DNFB法、Sanger法):
二硝基氟苯在弱碱性条件下,与肽链的N端氨基作用,形成二硝基苯基肽链(DNP-肽),经酸水解后,N端残基成为二硝基苯基(DNP)-氨基酸,可用有机溶剂抽提,再进行纸层析或薄层层析后,根据层析斑点的位置作定性鉴定。
2、二甲氨基萘磺酰氯法(DNS-Cl法):
荧光剂DNS-Cl可与肽链N端氨基反应生成DNS-肽,经酸水解,N-末端残基形成DNS-氨基酸,用乙酸乙酯抽提,然后用层析法鉴定。
DNS-氨基酸于360nm或280nm处产生强烈荧光,根据荧光点位置确定N端氨基酸。
3、异硫氰酸苯酯法(PITC法):
在弱碱中,异硫氰酸苯酯(PITC)与N端氨基偶联生成苯基硫甲酰衍生物(PTC-肽)。
在酸性溶液中,PTC-肽经环化裂解生成PTC-氨基酸和N端少个氨基酸的剩余多肽。
由于PTC-氨基酸不稳定,很快转化成苯基乙内酰硫脲氨基酸(PTH-氨基酸4、DABITC法:
DABITC(4-N,N-对甲氨基偶氮苯-4’-异硫氰酸酯)能与N端氨基反应生成DABTH-氨基酸,经层析分离后,用盐酸气熏即可出现红色斑点,很容易鉴定。
5、氨肽酶法:
氨肽酶是一种肽链外切酶,它能从多肽链的N-端逐个的向里水解。
根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量,按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线,从而知道蛋白质的N-末端残基顺序。
6.C末端的测定:
1、羧肽酶法:
羧肽酶是一种肽链外切酶,能从多肽链的C端逐个的水解氨基酸。
根据不同的反应时间测出酶水解所释放的氨基酸种类和数量,从而知道蛋白质的C末端残基顺序。
2、LiBH4法:
硼氢化锂可与C末端氨基反应生成相应的α-氨基醇,水解后抽提氨基醇,可用层析法分离、鉴定。
3、肼解法:
当蛋白质和无水肼在100℃反应5~10h,肼可断裂所有的肽键,使所有氨基酸残基形成肼的衍生物——氨基酸酰肼,可与苯甲醛作用形成不溶的二亚苄基衍生物而除去,唯有C末端氨基酸以游离的形式存在于上清液中。
7.封闭N-末端的测定:
1.乙酰化N-末端2.吡咯烷酮羧酸末端3.甲酰基末端
8.肽的的圆二色性:
α-螺旋,190nm(+)208nm,222nm(-)
β-折叠:
195nm(+),antiparallel:
redshiftparallel:
blueshift215-217nm(-)
β-转角,180-190nm(-)200-205nm(+),225nm(+),band,weakredshift
9.X射线衍射法和核磁共振技术(NMR)是研究蛋白质三维空间结构最准确的方法。
10.蛋白质纯度检查方法:
HPLC和非还原SDS-PAGE两种方法,其纯度都应达到95%以上才能合格。
某些重组药物的纯度要求更高,要达到99%以上。
纯度的检测通常是在原液中进行。
最好的纯度标准是建立多种分析方法,从等电点、相对分子质量、疏水性等不同的角度来证明了蛋白质样品的均一性。
11.蛋白质含量测定:
Lowry法和Bradford法,紫外吸收法,双缩脲法,凯氏定氮
12.蛋白质药物理化性质的鉴定:
半干胶转移免疫印迹法是最常用的方法:
印迹的效率取决于蛋白质从胶上转移到膜上的效率以及蛋白质与膜结合的效率。
高相对分子质量的蛋白质应降低印迹缓冲液中的甲醇浓度,降低缓冲液的离子强度,增大电流强度.在阴极缓冲液中加入SDS,并延长印迹时间。
低相对分子质量蛋白质应提高印迹缓冲液中的甲醇浓度,提高缓冲液的离子强度,减少电流强度,采用疏水性更强的膜。
13.相对分子质量测定:
(1)还原型SDS-PAGE法测定:
在Mr为15000~200000的范围,与其他方法测得的Mr相比,误差一般在±10%以内,
(2)凝胶过滤(分子筛)法:
根据蛋白分子大小和形状进行测定,误差比SDS-PAGE大,目前应用较少。
(3)质谱法
14.等电点测定可以表征药物的理化性质和纯度
均一的重组蛋白质只有一个等电点,有时因加工修饰等影响可出现多个等电点,但应有一定的范围。
所以等电点测定是控制重组产品生产工艺稳定性的重要指标。
常用的测定方法:
等电聚焦电泳法(IEF):
毛细管电泳法(CE):
该法用紫外检测,适用于某些不易染色的蛋白质多肽,如EGF、hCGRP等制品的测定。
标准中等电点的规定:
等电点标准应规定为在±0.5pH范围之内,应有明显的主显带。
15.肽图的裂解方法:
(1)化学裂解法
(2)蛋白酶裂解法3)特殊处理:
二硫键、空间构象较复杂的特殊产品
16.肽图常用的分析方法有:
(1)SDS-PAGE电泳:
(2)反相HPLC(RP-HPLC):
(3)毛细管电泳:
(4)液质分析:
17.N末端和C末端氨基酸测序
作为重组蛋白质和肽的重要鉴别指标,一般要求至少测定N端15个氨基酸。
在中试头三批产品应当测定;C端定1~3个,但在我国现有法规中C端不一定要测定。
18.测定巯基的方法有PMCB法、DTNB法和NEMI法等。
19.对糖蛋白化学结构分析的意义:
附着于蛋白质的寡糖可以上调、下调或抑制糖蛋白的生物活性,还可以影响蛋白质的代谢命运、稳定性或溶解性
通过基因工程方法将一种糖蛋白在不同细胞中表达,可以导致生产不同类型的糖蛋白。
即使在相同的细胞类型中,也可能会出现糖形成时由于一些寡糖的精细结构不同和普通寡糖产生的相对频率不同而产生截然不同的糖蛋白。
20.糖蛋白的糖基化分析:
糖基化位点,分子量,糖的组成,连接方式,
分析方法:
酶解,质谱,LC/MS,GC/MS
21.残余杂质检测:
残余杂质可分为外来污染物和与产品相关的杂质两大类。
外来污染物包括:
微生物污染、热原、细胞的成分(例如细胞的蛋白质,DNA其他的组分)、培养基中的成分、来自生产过程各步骤中的物质、来自产品纯化步骤中的物质(亲和柱中的抗体,其他试剂);
与产品相关的杂质包括:
突变物、错误裂解的产品、二硫化物异构体、二聚体和多聚体;化学修饰的形态:
脱去酰氨基的或氧化的形态、其他降解产物等。
22.宿主细胞蛋白含量测定方法:
1包被2加样3加抗体4检测。
23宿主细胞DNA残留量测定原理:
供试品中的DNA经变性为单链后吸附于固相膜上,在一定温度下,可与相匹配的单链DNA复性而重新结合成为双链DNA,称为杂交。
将特异性DNA探针标记后,与吸附在固相膜上的供试品单链DNA杂交,并使用与标记物相应的显示系统显示杂交结果,与已知含量的阳性DNA对照对比后,可测定供试品中外源性DNA的含量。
测定方法:
1.标记2.杂交3.免疫检测
杂质检测方法
(1)微量的生物大分子:
酶联免疫学或类似的方法进行定量或限量分析
(2)小分子物质:
液相色谱,气相色谱等分析化学方法或敏感的生物学方法。
(3)具有自我复制、繁殖能力的病毒、支原体:
生物学、分子生物学、生物化学和免疫学等方法(4)检测方法进行方法学验证(5)建立标准化的操作程序
25.最终产品的控制:
物理化学鉴定:
(1)氨基酸组成
(2)氨基酸末端序列:
N-端和C-端氨基酸(3)肽谱(4)巯基和二硫键:
巯基和/或二硫键的数量和位置。
(5)碳水化合物结构中性糖、氨基糖、唾液酸(6)分子量:
应用分子筛层析法、SDS-PAGE(还原和/或非还原条件下)、质谱测定法。
(7)等电点:
通过等电聚焦电泳或其他适当的方法测定。
杂质检查:
1)工艺相关杂质:
工艺相关杂质来源于生产工艺,可分三大类:
来源于细胞基质、培养基和下游工艺。
①来源于细胞基质的杂质包括源于宿主生物体的蛋白/多肽;核酸(宿主细胞/载体/总DNA);多糖及病毒。
②来源于培养基的杂质包括诱导剂(多核苷酸,病毒)、抗生素、血清及其他培养基组分。
③来源于下游工艺产生的杂质包括酶、化学/生化处理试剂(如溴化氰、胍、氧化剂和还原剂)、无机盐(如重金属、砷、非有色金属离子)、溶剂、载体/配体(如单克隆抗体),及其他可滤过的物质。
(2)产品相关杂质①化学修饰类型:
应考虑脱酰胺、异构化、错配S-S连接和氧化形式的分离和鉴别。
②降解物和聚合体:
聚合体包括二聚体和多聚体:
可用分子筛层析法(如SE-HPLC)进行定量;降解物:
应建立降解物的判定标准,并对稳定性试验产生的降解产物进行监测。
生物学测定:
(1)鉴别试验:
应用免疫印迹法2)效价测定:
采用国际或国家参考品,以体内或体外法测定制品的生物学活性,并标明其活性单位。
(3)特异比活性测定:
测定其特异比活性,以活性单位/重量表示。
(4)热原质试验(5)无菌试验(6)抗原性物质检查:
抗原可能产生的抗体或变态反应。
(7)异常毒性试验
1.生物检定:
是利用生物体包括整体动物、离体组织/器官、细胞和微生物等评估药物生物活性的一种方法。
以药物的药理作用为基础,以生物统计为工具,运用特定的实验设计在一定条件下比较供试品和相当的标准品或对照品所产生的特定反应,通过等反应剂量间比例的运算或限值剂量引起的生物反应程度,从而测定供试品的效价、生物活性或杂质引起的毒性。
2.生物检定法在生物新研究中的地位和作用。
生物检定法作用主要表现在:
(1)直接关切生化药物的有效性和安全性;
(2)量效关系确切,可为临床用药剂量的规范化提供参考;(3)是反映产品质量的重要指标,具有专属性。
应用:
1、药物的效价测定2、大分子结构的测定3、微量生理活性物质的测定4、药物的毒性成分及有害杂质的限度检查5、新药研究:
新药研发初始阶段,体外测定筛选有效成分、整体动物试验确认药效。
1.溶媒残留量:
1、比色法2、气相色谱3、HPLC4、红外光谱
2.牛津单位:
抑制50毫升肉汤培养基中金黄色葡萄球菌生长的青霉素的最低含量为一个牛津单位.
3.管碟法原理:
抗生素在涂布特定菌的琼脂培养基内扩散,形成一定浓度抗生素的球型区,抑制试验菌生长,通过透明培养基观察抑菌圈,抗生素剂量的对数与抑菌圈面积或直径成正比。
在同样条件下将已知效价的标准品溶液与未知效价的供试品溶液的剂量反应(抑菌圈)进行比较;
当标准品和供试品是属于同一性质的抗生素时,标准品溶液和供试品溶液.对一定试验菌所得的剂量反应曲线,在一定剂量范围内应互相平行。
3.二剂量法:
将抗生素的标准品及检品各稀释成有一定比例的二种剂量(2:
1或4:
1),即高剂量和低剂量,在同一平板上进行对比,根据所产生抑菌圈大小来计算检品效价的方法。
4.β-内酰胺类抗生素的鉴别1酶法:
β-内酰胺酶2红外吸收光谱法3紫外吸收光谱法4、茚三酮反应
5.氨基糖苷类抗生素:
1茚三酮反应2坂口反应:
链霉素水解产物链霉胍特有。
链霉胍,8-羟喹啉分别与次溴酸钠反应,其各自的产物在相互作用生成橙红色化合物。
3糖类反应:
五碳糖或六碳糖在硫酸存在的条件下α-奈酚呈红紫色4埃尔松-摩根:
样品在强酸或强碱水解后释放出氨基己糖,对二甲胺基苯甲醛的乙醇及盐酸溶液成红色5麦芽酚反应:
链霉糖在碱性条件下与铁离子生成紫红色络合物。
6.四环类抗生素:
(一)呈色反应1、浓硫酸反应2、三氯化铁反应:
酚羟基
(二)荧光反应:
土霉素绿色荧光,四环素黄色荧光(三)紫外光谱(四)色谱
7.大环内酯抗生素
(一)呈色反应1、硫酸反应:
遇硫酸均呈红棕色2、莫利西反应:
糖类的反应3、Seliwanaff反应:
红霉素淡黄色
8.抗生素类药物的杂质检查:
青霉素过敏原:
青霉噻唑多肽或青霉噻唑蛋白
链霉素毒性杂质:
链霉胍,链胍双氢链糖;双氢链霉素;链霉素醛基结合物;神经毒性:
二链霉胺
二链霉胺含量测定原理:
二链霉胺等不被KBH4还原,能与盐酸氨基脲反应,生成的缩氨脲在233nm有吸收峰
1.多糖的分子量测定
(1)凝胶色谱法:
方法:
SephadexG-200,多糖标准品
分部收集,硫酸-苯酚检测,分别求得洗脱体积Ve,Ve与1gM之间存在着线性关系,绘制标准曲线。
Ve=-KlogM+C将待测样品上柱,待测多糖Ve。
通过标准曲线求出待测多糖分子量。
(2).高效液相色谱——重均分子量
色谱条件:
凝胶柱(分子量大小),示差折光检测器。
标准曲线:
准曲线:
LogMW=a+btRMW为重均分子量,tR为保留时间
待测多糖分子量(GPC专用软件):
重均分子量Mw=∑(RIiMi)/∑RIi
Mi为供试品在保留时间ti时的分子量,RIi在第i部分中被洗脱物质的量(重量)。
2.多糖的含量测定:
比色法硫酸咔唑法—己糖醛酸测定。
在浓硫酸中,己糖醛酸与咔唑溶液反应生成的反应物呈红色。
乙酰丙酮法原理:
氨基己糖在碱性条件下加热,可与乙酰丙酮缩合成吡咯衍生物,该衍生物与对-二甲氨基苯甲醛反应,反应物呈红色硫酸苯酚法原理:
多糖在浓硫酸作用下水解成单糖,该单糖在强
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