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分子诊断学笔记
[1]原核生物基因组
原核生物主要包括、细菌、支原体、立克次体、衣原体、螺旋体、放线菌、蓝绿藻等
有关质粒
按质粒的功能分类:
致育质粒 F质粒)编码性菌毛,介导细菌之间的接合传递;
耐药性质粒 R质粒) 编码细菌对抗菌药物或重金属盐类的耐药性;
毒力质粒 Vi质粒)编码与该菌致病性有关的毒力因子;
细菌素质粒 编码细菌产生细菌素;
代谢质粒 编码产生相关的代谢酶。
按复制机制分类:
1、严紧控制型
拷贝数少,一般<10个,分子量大;
调节因子是蛋白质,复制受限,受染色体DNA复制系统的控制;
严谨控制机理(低拷贝原因),认为是该质粒可以产生阻遏蛋白,反馈抑制自身DNA合成。
2、松弛控制型
拷贝数多,10-200个,分子量小;
调节因子是RNA,复制不受染色体DNA复制系统限制
基因工程使用松弛型(高拷贝数)质粒,以获得较多的基因产物。
性质:
1、转移性:
可以通过转化、转导或接合作用而由一个细菌细胞转移到另一个细菌细胞中,使两个细胞都成为带有质粒的细胞;质粒转移时,它可以单独转移,也可以携带着染色体(片段)一起进行转移,所以它可成为基因工程的载体。
2、质粒具有选择性标记:
质粒有抗药性基因、营养缺陷型基因、抗重金属盐基因等多种选择性标记;
3、质粒的不相容性:
同一类群的不同质粒一般不能在同一菌株内稳定共存;
4、自主复制性:
能独立于宿主染色体DNA外独立复制(但也必须在宿主细胞内才能复制);
质粒已成为分子克隆的有用工具,是目的DNA的载体。
载体质粒大多是在天然质粒基础上经人工构建而成,
质粒的一些特点:
1、有限制性核酸内切酶单一切口,可用以重组外源DNA;
2、有筛选标记,如抗药基因等;
3、插入外源DNA后,仍能转化宿主细胞,并能复制。
质粒基因转移的方式:
1、接合作用 当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时,质粒DNA从一个细胞(细菌)转移至另一细胞(细菌)的DNA转移称为接合作用
2、转化作用 通过自动获取或人为地供给外源DNA,使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型,称为转化作用
3、转导作用 当病毒从被感染的(供体)细胞释放出来、再次感染另一(受体)细胞时,发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用
4、转染作用 通过感染方式将外来DNA引入宿主细胞,并导致宿主细胞遗传性状改变的过程称为转染(transfection)。
转染是转化的一种特殊形式。
病毒基因组
完整的病毒颗粒包括:
衣壳、基因组(DNA或RNA)、被膜、病毒颗粒中的其他内容物
病毒分段基因组:
流感病毒属分段RNA病毒
意义:
a)降低包装压力
b)降低了造成断裂的可能性,提高编码能力
c)有分段基因组的病毒一般感染效率较低,只有全部基因组核酸片段存在时,病毒才具有感染能力。
植物病毒
d)由于分段基因组易发生重组,故病毒容易变异。
病毒基因组特点:
1、5‘的帽子和3’的poly(A)尾结构
2、末端重复序列结果:
粘性末段、正/反向互补序列、长末端重复序列;
3、高效基因组:
排列紧密很少间隔区,不仅非编码序列少,而且有重叠基因的存在;
4、分段基因组:
易重组,是病毒易变异的原因。
真核生物基因组
染色体的包装:
(1)染色体的一级结构—核小体
(2)染色体的二级结构—螺线管
(3)染色体的三级结构—超螺线管
(4)染色体的四级结构—染色单体
真核生物染色体基因组一般特征
1、真核生物的基因组比较庞大;
2、线性双链DNA和二倍体;
3、真核细胞基因转录产物为单顺反子。
4、存在重复序列,重复次数可达百万次以上
5、基因是不连续的(断裂基因)
重复序列:
指多拷贝的相同或近似序列的DNA片段
一、高度重复序列,
按其结构特点分为三种:
1、反向重复序列
2、卫星DNA由于这类序列的碱基组成不同于其他部份,可用等密度梯度离心法将其与主体DNA分开,因而称为卫星DNA(或随体DNA)
3、较复杂的重复单位组成的重复顺序
二、中度重复顺序:
依据重复顺序的长度,中度重复顺序可分为:
短散布元件和长散布元件
Alu家族:
是哺乳动物基因组中含量最丰富的一种中度重复顺序家族(短分散元件),Alu家族每个成员的长度约300bp,每个单位长度中有一个限制性内切酶AluⅠ的切点(AG↓CT),Alu可将其切成长130和170bp的两段,因而定名为Alu序列(或Alu家族)
线粒体DNA的遗传特性:
母系遗传、突变率高、异质性、阈值效应、半自助复制与协同效应
阈值效应:
mtDNA突变导致氧化磷酸化水平降低,当突变的mtDNA达到一定比例时,使得线粒体总的能量供应降低到维持组织正常功能所需能量的最低值时,才可能引起某组织或器官的功能异常而出现临床症状。
DNA分子多态性的主要方式 :
微卫星DNA多态性(同一位点不同个体之间有不同长度的微卫星DNA,STR)、单个核苷酸的变异—单核苷酸多态性(SNP)等
1、微卫星DNA 又称短串联重复STR,指以1-6个碱基为核心单位串联重复而成的一类序列。
微卫星DNA结构 序列由中间的核心区(重复序列)和外围的侧翼区(非重复序列)组成,其核心序列为1~6bp,为高度重复序列。
成因:
1.姊妹染色单体的不均等交换2.复制滑移
2、SNP是基因组中散在的单个核苷酸的变异形成的一种DNA分子多态性
位置:
编码区SNP cSNP)、基因周边区SNP pSNP)、基因间SNP iSNP)
SNP非编码区:
SNP编码区=5:
1
成因:
单个核苷酸(碱基)置换:
转换:
嘧啶—嘧啶,嘌呤—嘌呤;颠换:
嘧啶—嘌呤,嘌呤—嘧啶 转换:
颠换=3:
1。
对这三种类型生物基因组一些简单的比较
病毒基因组:
(1)病毒基因组小,结构简单。
(2)不同病毒基因组可以是不同结构的核酸。
(3)基因组相关基因常从即排列呈现转录单元。
(4)病毒基因组的编码序列大于90%。
(5)基因有连续和间断的。
(6)有基因重叠现象
原核生物基因组:
(1)基因组通常由一条环状DNA分子组成。
(2)基因组中只有1个复制起始点。
(3)基因操纵子结构。
(4)编码序列一般不重叠。
(5)基因是连续的,无内含子,转录后不需要剪切。
(6)编码区在基因组中所占的比例远远大于真核基因组,但小于病毒基因组。
非编码区主要是一些调控序列。
(7)基因组中很少有重复序列。
(8)细菌基因组中存在有可移动的DNA序列,包括插入序列和转座子。
(9)具有编码同工酶的基因。
(10)在DNA分子中具有多种功能的识别区域。
真核生物基因组:
(1)每一种真核生物都有一定的染色体数目。
(2)基因组远远大于原核生物基因组,具有许多复制起始点。
(3)真核基因都由一个结构基因与相关的调控区组成,转录产物为单顺反子。
(4)真核生物含有大量重复序列。
(5)真核生物基因组内非编码序列占90%以上。
(6)真核基因是断裂基因。
(7)功能相关的基因构成各种基因家族。
(8)真核生物基因组中叶存在有一些可移动的遗传因素。
蛋白质组
蛋白质组:
生物体的全套蛋白质;或一个生命单位的全套蛋白质
特性:
与基因组相比,蛋白质组有高度动态性:
有组织特异性、生长发育特异性、生理病理状态特异性。
研究的必要性:
1、蛋白质的数量比基因的数量多(转录、翻译、翻译后水平的调控)
2、基因组是静态的,蛋白质组是动态的
3、蛋白质之间及其与其它各种大、小分子之间的广泛作用形成的犹如网络状的复杂系统。
蛋白质组学 是研究生物体全套蛋白质的组成、结构与功能的科学
蛋白质的分离:
双向凝胶电泳及图像分析技术
1、双向凝胶电泳
第一向的固相pH梯度等电聚焦电泳IPG-IEF;第二向SDS-PAGE组成的分离系统:
电泳速度只与蛋白质分子质量有关。
原理:
等电聚焦电泳:
基于蛋白质等电点(pI)的差异进行分离;
聚丙烯酰胺凝胶电泳:
是根据蛋白质分子量(Mw)的不同进行分离
质谱:
化合物分子受到电子流冲击后,形成的带正电荷分子离子及碎片离子,按照其质荷比大小依次排列而被记录下来的图谱,称为质谱。
质谱技术MS:
(用于蛋白质的鉴定)是在高真空系统中样品分子离子化后,根据不同离子间质荷比差异,以确定样品相对分子质量及分子结构的技术。
质谱仪的组成:
离子源、质量分析器、检测器
核酸分离与纯化
核酸分离提取的原则
1、选择原则,一是保证提取核酸一级结构的完整性,二是尽量排除其他分子的污染
2、保持核酸结构的完整性,应尽量减少破坏核酸的有害因素,尽量简化操作步骤。
技术路线的设计
1、核酸的释放,有物理法和化学法,化学法又分为溶胞法(应用最多最广泛)与干燥法
2、核酸的分离纯化,须去除三方面的杂质:
非核酸大分子物质,不需要的核酸分子,分离纯化过程中新加入的有机溶剂和金属离子等。
3、核酸的浓缩、沉淀和洗涤
浓缩:
若溶液中DNA含量低且容积较大,不易进行乙醇沉淀时,可用固体聚乙二醇吸水浓缩法或丁醇抽提浓缩法浓缩DNA。
沉淀与洗涤:
有机溶液沉淀核酸主要是利用核酸可与纳钾等阳离子形成盐,屏蔽了带负电的磷酸基团,使核酸分子聚集在一起而不溶于有机溶剂;盐类可使核酸沉淀,但往往含有少量共沉淀的盐,此时可经70-75%的乙醇洗涤而除去。
核酸的鉴定
首先是含量的鉴定
1、紫外分光光度法:
核酸分子中的碱基对波长260nm的紫外光有强烈吸收作用(最大吸收峰),1微克DNA钠盐的吸光度之为0.02,也就是A260=1时双链DNA含量为50μg/ml,单链DNA/RNA含量为40μg/ml,单链寡核苷酸的含量为33μg/ml。
适用于浓度大于0.25μg/ml的核酸溶液。
2、荧光光度法,以荧光染料嵌入碱基平面,则核酸在紫外线的激发下发出荧光,且荧光强度积分与核酸含量成正比,有三个特点:
灵敏度高;受RNA,ssDNA和其他物质的干扰小;对分子生物学中的常用酶无抑制作用。
其次是纯度鉴定
1、紫外分光光度法:
最常用,核酸在260nm处有最大吸收峰,蛋白质则在280nm处;盐和小分子在230nm处,酚在270nm处,这个差别可区分到底是什么污染;
纯DNA的A260/A280=1.8,若高出说明RNA污染,若低于则说明残余蛋白质;
A260/A280=2.0为高质量RNA的标志(1.8-2.1都可以)A230/A260=0.4-0.5,若升高则说明有残余盐。
2、荧光光度法
利用荧光染料溴化乙锭嵌入碱基平面后,核酸在紫外线的激发下发出橙红色荧光,作为荧光染料示踪。
可鉴定DNA制品有无RNA干扰,反之亦可。
RNA变性电泳后有特征性的三条带,原核生物为23S、16S、5S的rRNA条带,真核生物则由28S、18S的rRNA和5S、5.8S的rRNA和tRNA;(mRNA代表基因转录水平,行使模版功能)
还有完整鉴定性:
以溴化乙锭为示踪染料的核酸琼脂糖凝胶电泳结果可用于判断核酸完整性
1、完整无降解或降解很少的总RNA电泳图,除具特征性三条带外,三条带的荧光强度应为一特定比值
2、降解系数大的核酸条带相对分子质量大,电泳迁移率低,溴化乙锭嵌入核酸中的数量也增多,荧光强度高;反之~
3、一般28S或23SRNA的荧光强度约为18S或16S的2倍,否则提示有RNA降解,若在加样槽附近有条带,则DNA有污染。
保存:
DNA:
原则是减少DNA脱氨基,抑制DNA酶、减少DNA分子的各种反应、避免微生物污染
一般将DNA保存于pH8.0的TE缓冲溶液中,可减少DNA脱氨/抑制DNA酶,加少量氯仿可抑制细菌污染;在零下70度可保存5年+
RNA:
主要是抑制RNA酶
以焦炭酸二乙酯水溶解RNA,或在RNA溶液中加入RNasin(RNA酶阻抑蛋白)等RNA酶抑制剂,可延长保存时间;另外将RNA以沉淀形式保存于70%乙醇溶液或去离子甲酰胺溶液中,可于零下20度长期保存。
分离纯化基因组DNA
一般技术路线(含方法)
(一)酚抽提法
一些试剂的作用:
EDTA:
二价金属离子螯合剂,可螯合激活DNA酶必须的钙镁等离子,从而抑制DNA酶的活性,还可降低细胞膜稳定性。
SDS:
阴离子除垢剂,可降解细胞膜,乳化脂质和蛋白质,使与其结合的物质沉淀而分离(还可使蛋白质变性、解聚和降解DNA酶)
RNA酶顾名思义;蛋白酶K:
水解各种蛋白质并裂解细胞;酚:
强蛋白变性剂,使蛋白质变性沉淀,抑制DNA酶活性;pH8.0的Tris溶液(TE溶液):
使DNA顺利进入水相,避免其滞留于蛋白质层。
(二)甲酰胺解聚法
与酚抽提法类似,不同之处在于它是用高浓度的甲酰胺裂解DNA与蛋白质的复合物,然后以透析法除去蛋白酶和有机溶剂。
(三)玻棒缠绕法
本法以盐酸胍裂解细胞,基因组DNA沉淀于细胞裂解液和乙醇液的交界面,用带钩玻棒将沉淀的DNA缠绕于上,使高相对分子质量的DNA沉淀从乙醇中转移出来,然后以pH8.0的Tris溶液重溶。
回收DNA片段
原则与要求:
一是提高回收率,二是去除样品中的杂质
重组DNA技术
分子克隆(也称基因克隆或DNA克隆):
指按照人的意愿,在体外将制备的DNA片段与载体DNA重组,然后导入受体细胞,并在受体细胞中复制、扩增,以获得该DNA分子的大量拷贝的技术。
又称重组DNA技术。
一、制备目的基因的方法:
直接分离、人工合成、构建基因组文库G-文库、构建cDNA文库C-文库;
二、载体的选择与构建
载体:
是指能在连接酶作用下和外源DNA片段连接起来,并运送到宿主细胞进行扩增或表达的运载工具。
载体化学本质为DNA分子。
要求:
①自主复制能力(重组DNA能在受体细胞内复制);
②具有多克隆酶切位点;
③具有易检测的遗传标记,便于筛选;
④相对分子质量小,在受体细胞内多拷贝,便于提取纯化;
克隆载体:
能将外源基因在受体细胞中复制扩增并产生足够量目的基因的载体称为克隆载体
表达载体:
能够携带目的DNA片段进入宿主细胞扩增和表达,获得目的DNA蛋白质产物的一类DNA分子。
对该类载体,还要求它能配备与宿主细胞相适应的启动子、前导序列、加尾信号、增强子等DNA调控元件。
三、连接DNA片段(目的基因&载体)的方法
粘端连接(最好)、平端连接(无方向性)、定向连接(需要双酶切)、同聚物加尾连接、人工接头连接
四、重组体DNA导入受体细胞的方法
1、CaCl2转化法(实验必做、必考);2、电穿孔法;3、磷酸钙共沉淀法;4、λ噬菌体的转染;5、脂质体法;6、显微注射法
五、重组子的筛选
原理:
通过某些特定方法,从被转化的细胞群体或基因文库中,鉴别出真正的重组子的过程
重组体的筛选方法:
1、根据遗传表型筛选(抗生素抗性筛选、B-半乳糖苷酶系统筛选)
2、根据重组子结构特征筛选(1、快速裂解菌落并鉴定分子大小2、内切酶酶切图谱鉴定)
3、核酸分子杂交筛选
4、PCR筛选重组子
5、核苷酸序列测定
六、外源基因的表达与分离纯化
(一)在原核细胞中表达
目的:
使外源基因在原核细胞中以发酵的方式快速/高效合成基因产物,以大肠埃希菌表达系统的应用最为广泛。
主要过程:
DNA转录生成mRNA,后者再翻译成蛋白质;
条件:
①外源基因无内含子;②具有强启动子、SD序列和翻译起始位点;③连接后必须形成正确阅读框架;④外源基因mRNA必须相对稳定,能有效翻译;⑤形成的蛋白质不易降解。
(二)在真核细胞中表达
要求:
除了和原核表达系统类似的以外,还需要启动子元件、增强元件、加poly(A)信号、剪切信号及其用于复制和选择的元件。
分类:
酵母表达系统(最理想);哺乳动物表达系统。
(三)外源基因表达产物的分离纯化。
一些概念
转化:
以质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入受体细胞的过程称为转化。
转染:
是指以噬菌体DNA或以它为载体构建的重组子导入受体细胞的过程称为转染。
感染:
具有感染力的噬菌体将头部重组子导入受体细胞的过程称为感染.
重组子:
含有重组DNA分子的转化细胞
重组体:
不同来源的DNA通过重组作用所组成的DNA分子
重组DNA:
不同来源的DNA通过磷酸二酯键连接而重新组合成新的DNA分子的过程
G-文库;将某种生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段,再与合适的载体在体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落
C-文库:
将某种生物体基因组转录的全部mRNA,经反转录产生cDNA片段,再分别与克隆载体重组,储存于某种受体菌中。
基因组文库:
含有某种生物全部基因随机片段的重组DNA克隆群
II型限制酶:
能够识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类核酸内切酶。
识别序列特点:
具有回文结构的DNA片段
切割方式:
在对称轴处同时切割DNA的两条链、在对称轴两侧相类似的位置切割两条链
末端类型:
平末端和3*或5*突出的粘性末端。
DNA连接酶:
是一种封闭DNA链上切口的酶
催化反应的化学本质:
修复双链DNA上切口处的磷酸二酯键
DNA连接酶的反应条件
Tris-HCl 50-100mmol/L pH7.5
MgCl2 10mmol/L
ATP 0.5-1mmol/L
DTT 5mmol/L
Volume 10-20μL
Temperature 4-15℃
Time 4-16h
作用:
能够催化两个互补粘性末端或平末端双链DNA分子形成磷酸二酯键,实现DNA重组。
连接多个平头双链DNA分子
DNA聚合酶
酶类与活性:
1、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ:
参与DNA修复,具5’→3’核酸聚合酶活性、3’→5’和5’→3’外切酶活性
2、T4DNA聚合酶:
有3′→5′的核酸外切酶活性、5′→3′的DNA聚合酶活性。
3、逆转录酶:
⑴ 以单链RNA为模板,催化合成cDNA单链;⑵ 从5*末端或3*末端降解DNA杂合链中的DNA;⑶ 以DNA为模板,催化合成cDNA双链。
4、TaqDNA聚合酶:
有强的5’~3’DNA聚合酶活性、有5’~3’核酸外切酶活性、无3’~5’核酸外切酶活性
5、末端脱氧核苷酸转移酶:
标记DNA的3ˊ—OH末端;也可催化载体分子或待克隆的DNA片段上加上互补的同聚尾,便于进一步连接。
6、大肠埃希菌DNA聚合酶1Klenow大片段,活性同3
7、5*-3*聚合酶活性、3*-5*外切酶活性》2》6
工具酶 作用
限制酶:
识别和切割双链DNA
连接酶:
连接两个DNA分子/片段
聚合酶I:
DNA聚合、外切
耐热DNA聚合酶 PCR
TaqDNA聚合酶 聚合外切
逆转录酶 cDNA合成
碱性磷酸酶 切除末端磷酸基
T4多核苷酸激酶 5*末端磷酸化
末端转移酶 3*末端加入同质多聚物尾
核酸酶S1,绿豆核酸酶 水解单链核酸,使双链DNA突出端变为平末端
几种常用载体比较
克隆容量 受体细胞 筛选原理
质粒载体《2Kb 大肠杆菌 pUC系列→蓝白斑筛选
pBR322→双抗生素筛选
噬菌体载体 大肠杆菌 入噬菌体《22Kb →蓝白斑筛选
M13噬菌体《1Kb →蓝白斑筛选
粘粒载体 40-50Kb 大肠杆菌
病毒载体 动物细胞
酵母人工染色体200-1000Kb 酵母细胞
pBR322质粒特点:
1、相对分子质量好,4.363kb
2、有一个复制起始点,为松弛复制子
3、可用氯霉素扩增其质粒拷贝数
4、有四环素、氨苄霉素两个抗药性基因
5、有24种限制酶的单一识别点
pUC:
pUC18/19质粒载体是由pBR322质粒和M13噬菌体重组构建而成的双链DNA克隆载体。
pUC是系列质粒载体
结构特点:
1)pUC载体较小,全长仅2686bp;具有更高的拷贝数
2)只保留了一个药物抗性基因Ampr
3)大肠杆菌β半乳糖苷酶基因的启动子及其编码α-肽链的DNA序列——LacZ′基因;
4)有一个多克隆位点区,极有利于克隆外源基因。
分子克隆的基本步骤
分:
目的基因的获得(基因文库、逆转录、人工合成、从基因组分离)、载体的获得
切:
限制酶切割目的基因和载体,产生平末端或相同的粘性末端;
接:
连接酶连接分子间的粘性末端或平末端;
转:
重组体导入受体细胞,转化或转染;
筛:
双抗生
简述筛选pUC载体和目的基因形成的重组体
(1)2.69kb,保留了pBR322质粒的Ampr,转化菌可在氨苄青霉素培养基中存活;
(2)LacZ′基因编码β-半乳糖苷酶的一个片段,与宿主细胞编码的缺陷型β-半乳糖苷酶互补成为完整的酶,催化指示剂底物X-gal形成蓝色产物,菌落呈蓝色;
(3)LacZ′基因中有MCS 外源基因插入,使LacZ′基因插入失活,不能表达a-片段,不能与宿主细胞互补,X-gal不能转变为蓝色,表现白色菌落。
PCR
PCR聚合酶链反应
原理:
由人为提供模板DNA、DNA引物、4种dNTP和DNA聚合酶,在体外条件下实现DNA复制的过程。
用途:
目的基因克隆、基因体外突变、DNA和RNA的微量分析、DNA序列测定、基因突变分析
三个基本步骤:
变性-退火-延伸
变性:
93-98摄氏度;退火:
37-65摄;延伸:
70-75摄,
整个PCR过程一般需进行三十轮的循环,
变性:
在第一轮循环前需预变性,在94℃下变性5-10min非常重要,它可使模板DNA完全解链;
(Tm值:
DNA热变性发生在一个很窄的温度范围内,将DNA变性达到50%时的温度称解链温度或溶解温度。
GC越高,Tm值越高)
退火:
引物退火的温度的高低和所需时间的长短取决于引物的碱基组成、引物的长度、引物与模板的配对程度以及引物的浓度实际使用的退火温度比扩增引物的Tm值约低5℃退火温度越高,所得产物的特异性越高
(退火温度由引物的Tm值决定,延伸温度和时间由TaqDNA酶活性决定一般变性温度与时间为94℃30~50s产物由引物决定,循环次数由初始模版浓度决定)
延伸:
反应通常为
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