Westernblot蛋白印迹法详细步骤.docx
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Westernblot蛋白印迹法详细步骤
Western-blot(蛋白印迹法)详细步骤
Westernblot(蛋白印迹法)详细步骤
一、组织的研磨
准备:
研钵、研磨棒、EP管、药匙、液氮、液氮匙、自封袋、一次性手套、棉手套
步骤:
①用研磨棒将装有冻存组织的EP管敲碎,取出组织,在研钵中盛满液氮,用力敲碎组织,研磨。
②研磨过程中一旦液氮干了,立即加入液氮,保持研磨在液氮中进行,直至组织呈干粉状。
③用在液氮中浸泡过的药匙将研磨好的粉末盛入新的EP管中。
④装有组织粉末的EP管现在液氮中保存,待所有组织都研磨结束后装入自封袋,于-80℃保存。
注意:
1.研钵使用前要用锡纸包口、研磨棒用锡纸包头,在烘箱中烘烤180℃至少3h以上。
2.组织研磨成粉末后待液氮全部挥发后再将组织粉末装管。
3.每种样品都最好留有副管,备用。
二、裂解提蛋白
准备:
裂解液配制比例RIPA:
PMSF=1000:
10=100:
1
若需要加入蛋白酶抑制剂,则比例一般为1:
1000(即1ml裂解液加1μl蛋白酶抑制剂)
步骤:
①将RIPA和PMSF按比例混匀,加入到装有组织粉末的EP管中,一般加入300~500μl左右(浓度尽量高点)。
②盖好盖子,在冰上裂解30~40min.
③到时间后于4℃,12000rpm离心10min,取上清液转移到新的离心管中,于-20℃保存。
注意:
1.裂解液加入后用手指弹一下混匀,当加入量很少时,成粘稠状,有必要时应用枪头混匀。
三、BCA法测定蛋白浓度(BCA试剂盒)
准备:
BCA试剂盒(BCA试剂A、BCA试剂B、蛋白标准液)、酶标板、酶标仪、摇床
步骤:
①按1:
15或1:
30稀释待测样品,即取1μl样品+14μl水。
②按下表在酶标仪中加入试剂,绘制标准曲线。
孔号
0
1
2
3
4
5
6
蛋白标准液(μl)
0
1
2
4
6
8
10
去离子水(μl)
10
9
8
6
4
2
0
蛋白含量(μg)
0
1
2
4
6
8
10
③按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:
1)根据样品数量配制BCA工作液。
④每个标准品孔加入200μlBCA工作液,样品孔加入待测样品10μl和200μlBCA工作液,充分混匀,在摇床上震荡30s,37℃放置30min,于492nm下测定OD值。
⑤标准曲线以蛋白含量(μg)为横坐标,吸光度为纵坐标,根据样品的吸光度可以在标准曲线上查得相应的蛋白含量。
注意:
1.标准曲线一般做两组,取最好的标准曲线计算。
2.蛋白浓度=(蛋白含量/总体积)×稀释倍数[μg/μl]
3.保证样品液中的蛋白含量相同(500μg/100μl),则取10μl样品液中含有50μg蛋白。
4.样品液稀释液要再沸水浴中煮10min(可用微波炉加热),放凉至室温后于-20℃保存。
四、SDS-PAGE蛋白质电泳
(一)、配胶
准备:
凝胶液各成分、电泳板、制胶架、梳子
步骤:
①选择适合电泳板(0.75mm:
1.0mm:
1.5mm),用自来水冲洗干净后再用蒸馏水冲洗,将玻璃板夹入玻璃板夹,注意底部对齐,夹好后卡到制胶架上。
②首先配制分离胶(一般用12%的SDS-PAGE分离胶),按分离胶配方配制,配胶时最后加APS和TEMED,迅速混匀,注意减少气泡的产生。
③将配好的分离胶迅速加入玻璃板之间至梳子下约1cm处(绿色线处),不要有气泡。
灌好胶后用蒸馏水覆盖胶层,加满蒸馏水至玻璃板顶端,以利于丙烯酰胺的聚合。
室温静置约30min至胶层与水层检出现明显TEMED
0.002
0.004
0.006
0.008
0.010
0.012
3.SDS-PAGE浓缩胶配方(5%Arcylamide)
不同体积(ml)凝胶液各成分所需体积(ml)
溶液成分
2
3
4
5
6
8
H2O
0.68
1.4
2.7
3.4
4.1
5.5
30%Arcylamide
0.17
0.33
0.67
0.83
1.0
1.3
1.0MTris-HCL(PH8.8)
0.13
0.25
0.5
0.63
0.75
1.0
10%SDS
0.01
0.02
0.04
0.05
0.06
0.08
10%APS
0.01
0.02
0.04
0.05
0.06
0.08
TEMED
0.001
0.002
0.004
0.005
0.006
0.008
4.配胶时加入的APS和TEMED是助凝剂,应最后加入,加入后应迅速将配好的胶灌入玻璃板之间,防止其凝固。
(二)、电泳
准备:
电泳仪、电泳缓冲液、样品、marker
步骤:
①取1×电泳缓冲液,待浓缩胶聚合完全后,将胶架放入电泳槽内,将电泳缓冲液倒满内槽,内槽电泳液灌满后电泳液自动溢出灌满外槽,内槽电泳液低于外槽,拔出梳子,向梳子孔内加样。
②加样量为每孔8μl或10μl,如有剩余的孔,可加入等体积的1×loadingbuffer上样缓冲液,以防止样品胶跑歪。
③marker一般点在最左侧。
④将电泳槽与电泳仪连接,打开电泳仪开关,恒压80V预电泳10min至溴酚蓝前沿到达分离胶,将电压调整到恒压120V,电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部,注意不要让溴酚蓝跑出分离胶。
注意:
1.电泳的条带依据蛋白的分子量而区分,分子量大的蛋白跑的慢,在上端。
2.电泳液可回收多利用几次,一周左右。
(三)、转膜
准备:
甲醇、转膜缓冲液、滤纸、玻璃棒、海绵、PVDF膜或NC膜
步骤:
①电泳结束后立即转膜防止蛋白分散,剪取一张与凝胶大小相仿的PVDF膜,2块海绵,6张滤纸。
②将PVDF膜用甲醇活化约3min,然后将膜、凝胶、海绵和滤纸放在盛有转膜缓冲液的托盘中平衡15min。
③取下凝胶用切片切取需要的部分,两端以marker和上样边缘为界,用转膜缓冲液冲洗凝胶几次,在湿转板黑色面放置一张海绵、三张滤纸,再放置凝胶,每一层都要用玻璃棒赶出气泡。
④从甲醇中取出活化的膜在转膜缓冲液中浸洗一下,放在胶上,正面朝凝胶,再放三张滤纸、一张海绵,每一层用玻璃棒赶出气泡,最后夹紧转移夹。
⑤转移夹正极板(白色)对着电泳槽红色面,放入电泳槽中通电转膜,恒压72V或恒流300mA。
注意:
1.20KD以上的蛋白转膜时间约1h以上,100KD的蛋白转膜时间约1.5h左右,10KD左右的蛋白转膜时间为20~30min左右。
2.转膜要在冰水浴中进行,避免体系温度过高。
3.操作时要戴手套,用镊子夹持PVDF膜边缘防止划伤膜或染上杂蛋白。
4.PVDF膜可多次曝光(8次左右),NC膜可曝光2~3次。
(四)、封闭
准备:
脱脂奶粉、TBST缓冲液
步骤:
①转膜结束后,小心取出凝胶和膜,可在膜上观察到预染marker的条带。
②配制5%的脱脂奶粉(5g脱脂奶粉+100mlTBST缓冲液)封闭液,将膜放入盛有封闭液的容器中,室温摇床封闭1h。
注意:
1.可用考马斯亮蓝将凝胶染色以判断转移情况。
2.NC膜可置于丽春红染色液中,室温下染色5min,用双蒸水洗膜至水变清,无色蛋白条带清晰,说明染色效果好。
(五)、一抗孵育
准备:
抗体、5%脱脂奶粉、自封袋、封口机
步骤:
①根据抗体说明书以适当比例用5%脱脂奶粉稀释一抗。
②将自封袋剪去封口条,两边剪开,封闭后的PVDF膜小心放入袋内,通常4号袋可放置3~4条膜,膜与膜之间用封口机封好,剪开。
③加入配好的一抗溶液,小心排除气泡,用封口机封口后正面朝上(与凝胶接触的一面)在摇床上4℃过夜孵育或室温孵育1~3h。
④孵育后将膜取出,一抗溶液可回收放置-20℃保存两周回收利用。
⑤用TBST在摇床上洗膜3次,每次5min以去除残留的一抗。
(六)、二抗孵育
准备:
二抗、5%脱脂奶粉、自封袋、封口机
步骤:
①用5%脱脂奶粉按二抗说明书以适当比例稀释(1:
4000~1:
20000)。
②按一抗孵育的操作给洗过的膜孵育二抗。
③室温摇床孵育2h,孵育后将膜取出,用TBST洗膜3次,每次5min除去残留的二抗。
五、曝光鉴定
准备:
显影液、定影液、自来水、发光液A、发光液B
步骤:
①在暗室中将定影液、显影液、自来水分别倒入塑料盘中备用。
②于一离心管中加入发光液A、发光液B各200μl,混匀。
③在暗盒内放置一层自封袋,底层可用双面胶粘好,擦净后将漂洗后的膜正面朝上,摆放在塑料膜上,将发光液均匀的滴在PVDF膜上,用另一层塑料膜盖好膜,小心排除气泡。
④在暗室中取出一张X光胶皮,用剪刀剪成适当大小,根据肉眼观察到的荧光强弱调整曝光时间,胶片一旦放上不可移动。
⑤通过多次曝光以到达最佳效果。
曝光完成后打开暗盒取出X光胶片,浸入显影液中不停摇动显影,在红光下观察出现明显条带(一般约1min),立即浸入定影液中(一般约5~10min),以胶片透明为止,用自来水冲去残留的定影液,室温下晾干,胶片保存在干燥阴凉处。
注意:
1.若肉眼即可观察到可见荧光,则只需压片1~2s,一般压片时间为5~10min。
2.显影、定影和冲洗可在显影仪中一步进行。
六、扫描及分析
准备:
数码相机、Photoshop、Quantityone软件
步骤:
①选取效果较好的胶片拍照,导入计算机。
②用Photoshop简单处理图片,转成灰度模式,保存为.tif格式。
③用Quantityone软件分析条带的光密度值(灰度值)。
Quantityone软件的使用:
(1)选取要分析的条带框住,复制粘贴至数目比样品数多1(留有一个框空白背景),方框大小不可改变。
(2)分析光密度值,将结果导入到Excel表中,计算目的蛋白与内参蛋白的光密度比值,制成柱形图。
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