瘦素对肝细胞三酰甘油沉积的影响.docx
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瘦素对肝细胞三酰甘油沉积的影响
瘦素对肝细胞三酰甘油沉积的影响
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___________邮编:
___________)
【摘要】目的观察瘦素对人L02脂肪变肝细胞三酰甘油(TG)沉积的影响,探讨瘦素在非乙醇性脂肪性肝病发生、发展中的作用。
方法人肝L02细胞培养接种于50ml培养瓶中,用50%胎牛血清1640培养基造模,时间24h。
设立正常组、模型组、瘦素处理1,2,3组,处理组瘦素浓度分别为10-7mol/L,10-6mol/L,10-5mol/L,分别处理6h;再以10-6mol/L浓度瘦素建立时效关系分别处理(6,12及24h)。
每组均行油红“O”染色观察脂肪化情况,高效液相色谱测细胞内TG含量变化。
结果油红“O”染色显示50%的胎牛血清的1640培养基24h能成功地制造肝细胞脂肪变性模型,加入瘦素处理后脂肪化程度减轻。
高效液相色谱显示细胞内TG明显减少,且与瘦素呈剂量、时间依赖性关系。
结论肝细胞脂肪变性时,瘦素能使肝细胞脂肪化程度减轻,能减少肝细胞TG的沉积,对脂肪肝防治有一定的作用。
【关键词】脂肪变肝细胞;瘦素;三酰甘油 EffectsofLeptinonDispositionofTriglycerideinFattyLiverCells ZhouHongyu,YangXuefeng (DepartmentofGastroenterology,SecondAffiliatedHospital,NanhuaUniversity,Hengyang421001,China) Abstract:
ObjectiveToexploretheeffectofleptinontriglyceride’sdispositioninnormalandnonalcoholicinducedfattylivercell.MethodsL02livercellswereculturedin50mlculturedish.Fattylivercellmodelsweremadewith50%inactivatedembryobloodserumfor24hours.ResultsOilredstainingshowedthat50%inactivatedembryobloodserumcanmakefattylivercellmodel.AfterL02livercellswereturnedintofattylivercells,leptinwasaddedtofattylivercells.TheHPLCshowedthatthemodelgroup’striglyceridedispositionincreasedclearly,butafterleptinwasgivenintothemodelcells,triglyceride’sdispositiondecreasedobviously,whichwaspositivecorrelatedwithleptin’sconcentration.ConclusionWhenliverL02cellswereturnedintofattylivercell,leptincaninhibittriglyceride’sdisposition.Leptinhassometherapeuticeffectonfattylivercells. Keywords:
fattylivercell;leptin;triglyceride非乙醇性脂肪肝(NAFLD)是一种肝组织学改变与乙醇性肝病相类似,但与饮酒无明确关系的临床病理综合征,根据其病理学改变及临床表现分为单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性肝纤维化、脂肪性肝硬化[1,2]。
肝脏是体内参与脂质代谢的重要场所,肝脏选择性地摄取血中的非饱和脂肪酸,经酯化合成三酰甘油(TG),TG在肝细胞内,一方面氧化供能,另一方面分泌入血转化为低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)被其他组织利用。
肝脏所含脂质绝大部分为TG,各种致病因素可导致肝细胞内TG异常堆积而导致脂肪肝(FLD)的发生。
瘦素是肥胖基因(obesegene)编码的蛋白产物,其受体广泛分布于脂肪、骨骼肌、肝脏、心、肺、胰、卵巢、睾丸等外周组织。
瘦素通过与受体结合而发挥作用[3]。
瘦素的主要作用是调节机体脂肪的稳定,抑制食欲、增加能耗和减少体质量。
本研究以人肝L02脂肪变细胞模型,通过油红“O”染色、高效液相色谱等方法对瘦素作用后的脂肪变细胞进行研究,了解瘦素与NAFLD的关系,并初步探讨了瘦素对其的治疗作用。
1材料和方法 11主要试剂和仪器 1640培养基(GIBCO),胎牛血清(成都哈里生物有限公司),胰蛋白酶(Sigma),1,2,4丁三醇(Buches瑞士),油红“O”(北京生物化学有限公司),正己烷、异丙醇、乙腈(国产分析物)。
二氧化碳恒温培养箱(日本SANYO公司),超净工作台(德国Heraeus公司),倒置相差显微镜(OLYMPUS),50ml培养瓶,24孔细胞培养板(NUNC公司),酶标分析仪(美国BioRad550)。
12实验方法 12.1非乙醇性脂肪变肝细胞模型的建立 人肝L02细胞株培养接种于50ml培养瓶中,在含体积分数10%的灭活胎牛血清、100U/ml青霉素和100mg/L链霉素的1640完全培养基中,于37℃,5%二氧化碳培养,饱和湿度,贴壁生长,待细胞长满80%瓶底,消化液消化传代。
在更换新鲜培养液后加入胎牛血清,使其浓度为50%,继续培养24h,即形成非乙醇性肝细胞脂肪变性模型。
设正常组、模型组、瘦素处理1,2,3组,瘦素处理组的瘦素浓度分别为10-7mol/L,10-6mol/L,10-5mol/L,分别处理6h;再以10-6mol/L浓度瘦素建立6,12,24h的时效关系分别处理。
每组均行油红“O”染色观察脂肪化情况,高效液相色谱测细胞内TG含量变化。
1.2.2油红“O”染色观察造模是否成功 采用Lillie氏油红“O”染色法:
将细胞培养于放有无菌盖玻片的6孔培养板,用PBS冲洗盖玻片3次,每次5min,50%异丙醇固定1min,油红“O”染色液染色10min,蒸馏水冲洗3次,每次1min,苏木素染色5min,分色和返蓝后,HPIAS1000型图像分析系统收集图像。
按Wada方法进行脂质染色的半定量分析即根据脂滴的面积进行细胞分类。
细胞脂滴的面积小于细胞核的面积记为“-”,细胞脂滴的面积等于或大于细胞核的面积记为“+”,每一块玻片计数100个细胞。
1.2.3色谱分析和计算 安捷伦HP1100单元泵,自动进样器,紫外监测器和化学工作站进行分析。
检测波长230nm,流速0.7ml/min,采用梯度洗脱A:
乙腈B:
水0~12min:
75%A~95%A:
121min~18min:
75%A。
将标准溶液浓度对甘油/内标峰面积比值线性回归后得回归方程用于样品甘油浓度的计算。
TG的浓度为总甘油浓度游离甘油浓度。
1.3统计学方法 统计分析用SPSS软件,实验数据用均数±标准差(±s)表示,两组数据资料比较用t检验及方差分析,P0.05为有显著性差异。
2结果 21人肝L02细胞脂肪化 正常细胞用50%胎牛血清培养基培养24h后,用油红“O”染色,显微镜下观察,细胞浆内有大量脂滴存在,符合脂肪化肝细胞特点。
同时用高效液相色谱分析细胞内TG明显增加,与正常肝细胞比较有显著性差异(P0.05),其中细胞内TG从20.19μg/g增加到77.51μg/g,说明细胞内有大量TG聚集,造模成功。
2.2瘦素对人肝L02脂肪变细胞TG的影响 人肝L02细胞用50%的胎牛血清培养24h后,分别加入瘦素10-7mol/L,10-6mol/L,10-5mol/L培养6h。
油红“O”染色,显微镜下观察,细胞内脂滴依次减少。
瘦素10-5mol/L时效关系显示油红“O”染色细胞数明显依次减少。
高效液相色谱分析细胞内总甘油与TG模型组比较有显著性差异(P0.05)。
与瘦素呈时间、剂量依赖性关系(见表1,2)。
表1瘦素对人肝L02细胞细胞内TG影响的量效关系(略)表2瘦素对人肝L02细胞细胞内TG影响的时效关系(略) 3讨论 近年来,随着人们生活水平的提高,饮食结构的变化,检测手段的提高,非乙醇脂肪肝(NAFLD)发病率呈逐年上升趋势。
NAFLD根据其病理学改变及临床表现分为单纯性脂肪肝、非乙醇性脂肪性肝炎、脂肪性肝纤维化、脂肪性肝硬化。
NAFLD曾被普遍认为发病率较低,仅发生在伴有非胰岛素依赖性糖尿病的肥胖女性并且愈后良好。
但是自1994年起一系列研究结果表明NAFLD的发病在性别间没有明显差异,在非肥胖和糖尿病人中也有较高的发病率,特别是发现NAFLD可进展至肝炎、肝纤维化和肝硬化之后,才逐渐为人们所重视。
肥胖、高脂血症、2型糖尿病与NAFLD的发病密切相关。
大约75%的2型糖尿病患者可发生不同形式的NAFLD;70%的肥胖患者发生脂肪肝,其中18%出现NASH[4]。
NAFLD的发病机制尚非十分清楚,Day等[5]提出的“二次打击”(twohits)理论目前被广泛认同。
多种遗传和代谢性因素的联合作用诱发胰岛素抵抗(IR),后者通过增加的脂肪分解和FFAs转运至肝脏导致第一次打击—脂肪肝形成,并造成肝脏对第二次打击的敏感性增强。
氧应激、脂质过氧化等进一步促进IR,加重氧应激和肝细胞内细胞器损伤,导致炎症反应、肝细胞变性和肝纤维化,即第二次打击。
本研究结合文献[6]采用高脂培养基造模,形成典型的非乙醇性脂肪性肝细胞模型,主要研究NAFLD形成的第一步肝细胞内脂肪沉积及瘦素干预后的变化。
第3期瘦素对肝细胞三酰甘油沉积的影响周红宇,等肝脏是体内参与脂质代谢的重要场所。
肝脏脂质代谢稳态的变化是构成各种形式脂肪肝的基础,各种致病因素可通过一个或多个环节导致肝细胞内TG异常堆积。
TG在肝细胞的沉积决定于其合成、代谢及转运三个环节。
食物内的脂肪和胆固醇经小肠吸收后,以乳糜微粒与载脂蛋白结合的脂蛋白形式存在于血中,肝脏选择性摄取血中的非饱和脂肪酸,经酯化合成TG,肝细胞不能储存脂肪,TG在肝细胞内,一方面氧化分解供能,另一方面与载脂蛋白B100、C等以及磷脂、胆固醇结合生成极低密度脂蛋白,由肝细胞分泌通过血液循环运输至肝外组织。
当肝细胞合成TG增多,转运或氧化障碍时,都可能导致TG在细胞内的堆积,形成脂肪肝。
本实验经过高脂培养基培养L02肝细胞,发现肝细胞普遍发生脂肪变性,细胞肿胀,内含较大的脂肪滴,可将细胞核挤压向胞膜,可见高脂环境可引起肝脏脂肪浸润(TG贮存)。
而经过瘦素处理后肝细胞内脂滴明显减少,细胞形态恢复正常,高效液相色谱分析细胞内TG明显减少,与瘦素呈剂量依赖性关系。
说明10-7mol/L~10-5mol/L浓度的瘦素对离体脂肪变肝细胞有积极的防治作用。
瘦素是一种主要由白色脂肪组织分泌合成的由167个氨基酸残基组成的蛋白质类激素。
瘦素的表达具有组织特异性,主要在白色脂肪组织中表达,其中皮下脂肪的表达最高,棕色脂肪组织、肌肉、胃黏膜、胎盘滋养层细胞和羊膜细胞也可以合成少量瘦素[7]。
瘦素通过靶细胞膜上的受体及相应的信号转导体系发挥作用。
OBRb共有6种异构体。
OBRb的胞内结构域最长,由302个氨基酸搭配组成,并包含Janus激酶(JAK)结合结构域以及信号转导转录激活因子(STAT)结合的共同序列YXXQ,OBRb是唯一能进行信号转导并调节热量摄入和能量消耗的异形体[8]。
OBRb主要存在于下丘脑中能表达NPY的细胞表面,与瘦素结合后,通过JAK以及信号转导和转录激活物(STAT)蛋白发挥信号转导作用,调控核内DNA上Leptin效应基因的转录活性。
目前JAKSTAT途径被认为是Leptin受体信号转导的主要途径[9]。
瘦素可与特异性运输蛋白结合,通过血脑屏障,然后与下丘脑特异受体结合,把体脂信号传递给下丘脑。
下丘脑再通过一系列神经体液因素调节机体能量代谢,调整体脂,控制体质量相对恒定。
给遗传性肥胖的ob/ob小鼠进行肌内注射瘦素,能够明显抑制食欲,促进代谢,4周后脂肪下降将近75%,而且没有明显的副作用。
给ob小鼠脑脊液中注入瘦素后[10]进食量明显减少,体质量渐降正常,而且减少的仅为脂肪组织。
且其基础代谢率有所升高,这说明抑制食欲、增加能耗和减少体重可能是瘦素减肥的主要机制。
瘦素可能具有从外周直接拮抗肝脂肪变性的作用。
瘦素可以激活AMP活化蛋白激酶(AMPactivatedproteinkinase)减少脂肪沉积[11],还可特异性抑制肝脏的硬脂酰基-辅酶A去饱和酶(stearoylCoAdesaturase1),使肝脏VLDL生成和脂肪沉积减少[12]。
瘦素参与肝脏内糖及脂肪代谢,它通过调控肝脏磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)的基因表达,促进肝脏对乳酸的摄取,减少TG合成,同时通过蛋白激酶A激活肉碱脂酰转移酶,影响肝脏对TG的氧化代谢[13]。
Uygun等[14]认为非脂细胞瘦素受体发生功能障碍时细胞内TG含量能增加100倍,而持续表达的异位高瘦素血症能使细胞内TG耗竭;瘦素还干预胰岛素在肝脏中作用,一方面拮抗胰岛素诱导的PEPCK下调,抑制胰岛素受体底物1(IRS1)的磷酸化,影响胰岛素受体后信号转导;另一方面,瘦素通过对PEPCK及糖异生的影响,限制TG的合成,提高肝脏及外周组织对胰岛素的敏感性,Stumvoil等[15]发现瘦素与脂联素等连用能促进小鼠肝脂肪燃烧及能量消耗,可逆转缺乏过氧化物酶体增殖受体(PPAR)α的脂肪萎缩小鼠的胰岛素抵抗。
但是Chitturi等[16]发现NAFLD患者有高瘦素血症,且瘦素水平与肝脏的脂肪变性程度呈直接正相关。
最近Chalasani等[17]报道,瘦素水平与脂肪肝的发生并无直接关系。
因此,瘦素对肝脂肪变性的影响尚无定论。
本实验经过高脂培养液培养证实细胞内TG明显增加,经过瘦素处理后肝细胞内TG明显减少,与瘦素呈剂量及时间依赖性关系。
说明瘦素能明显减少离体脂肪变肝细胞的TG沉积,与文献[12,18]报道一致。
可见瘦素对非乙醇性脂肪肝具有治疗作用。
其对TG的作用明显,体内外实验均表明,其可抑制乙酰COA羧化酶的表达而抑制TG的合成,可激活肉碱脂酰转移酶而促进TG的氧化代谢。
本实验通过高效液相色谱分析也显示瘦素处理后脂肪变肝细胞内TG量明显减少,瘦素能使肝细胞内TG沉积减少达到治疗非乙醇性脂肪性肝脏疾病的目的。
【参考文献】 \[1\]PotterJJ,WomackL,MezeyE,etal.Transdifferentiationofrathepaticstellatecellsresultsinleptinexpression\[J\].BiochemBiophysResCommun,1998,244:
178-182. \[2\]LeeGH,ProencaR,MontezJM,etal.Abnormalsplicingofleptinoftheleptinreceptorindiabeticmice\[J\].Nature,1996,376:
632. \[3\]DayCP.Nonalcoholicsteatohepatitis(NASH):
wherearewenowandwherearewegoing\[J\].Gut,2002,50:
585-588. \[4\]MedinaJ,FernándezSalazarLI,GarcíaBueyL,etal.ApproachtothePathogenesisandTreatmentofNonalcoholicSteatohepatitis\[J\].DiabetesCare,2004,27:
2057-2066. \[5\]DayCP,JamesO.Steatohepatitis:
ataleoftwo“hits”\[J\]?
Gastroenterology,1998,114:
842-845. \[6\]徐正捷,范建高,王国良,等.乳果糖对大鼠非酒精性脂肪性肝炎模型形成的影响\[J\].中华消化杂志,2003,23:
97-100. \[7\]SchwartzM,PeskindE,RaskindM,etal.Cerebrospinalfluidleptinlevels:
relationshiptoplasmalevelsandtoadiposityinhumans\[J\].NatMed,1996,2:
589-593. \[8\]FeiH,OkanoHJ,LiC,etal.Anatomiclocalizationofalternativelysplicedleptinreceptors(OB-R)inmousebrainandothertissues\[J\].ProcNatlAcadSciUSA1997,94:
7001-7005. \[9\]ChuaSCJr,ChungWK,WuPengXS,etal.PhenotypesofmousediabetesandratfattyduetomutationsintheOB(leptin)receptor\[J\].Science,1996,271:
994-996. \[10\]LeLaySL,BoucherJ,ReyA,etal.Decreasedresistinexpressioninmicewithdifferentsensitivitiestoahighfatdiet\[J\].BiochemBiophysResCommun,2001,289:
564-567. \[11\]MinokoshiY,KimYB,PeroniOD,etal.LeptinstimulatesfattyacidoxidationbyactivatingAMPactivatedproteinkinase\[J\].Nature,2002,415:
339-343. \[12\]OralEA,SimhaV,RuizE,etal.Leptinreplacementtherapyforlipodystrophy\[J\].NEnglJMed,2002,346:
570-578. \[13\]HuangL,WangZ,LiC,etal.Modulationofcirculatingleptinlevelsbyitssolublerecepter\[J\].JBidChem,2001,276:
6343-6349. \[14\]UygunA,Kadayifei,YesiloveZ,etal.Serumleptinlevelsinpatientswithnonalcoholicteatohepaticpatients\[J\].AmJGastraenterol,2000,95(12):
3584-3589. \[15\]StumvoilM,TschritterO,FritscheA,etal.AsociationofTGpolymortioninadiponection(Exon2)withobesityandinsulinsensitivity;interactionwithfamilyhistoryoftypediabetes\[J\].Diabetes,2002,51
(1):
37-41. \[16\]ChitturiS,FarrellG,FrostL,etal.SerumleptininNASHcorrelateswithhepaticsteatosisbutnotfibrosis:
amanifestationoflipotoxicity\[J\]?
Hepatology,2002,36:
403-409. \[17\]ChalasaniN,CrabbDW,CummingsOW,etal.Doesleprinplayaroleinthepathogenesisofhumannonalcoholicsteatohepatitis\[J\]?
AmJGastroentero,2003,98:
2771-2776. \[18\]AsilmazE,CohenP,MiyazakiM.Siteandmechanismofleprinactioninarodentformofcongenitallipodystrophy\[J\].JCoinInvest,2004,113(3):
414-424.
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